一种测定烟草细胞内K⁺相对浓度的方法

一种测定烟草细胞内K⁺相对浓度的方法
【专利摘要】本发明涉及一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，首先利用细胞裂解缓冲液处理烟草叶片，过滤取滤液，离心，保留沉淀，用醋酸铵水溶液悬浮，制备原生质体液；其次准备玻璃电极系统，在K+选择性微电极的前端灌充氢离子液态交换剂，后端灌充电解液；最后进行离子相对浓度测定，将原生质体液滴在盖玻片上，静置使原生质体固定，盖玻片置于测试小室底部，用K+选择性微电极在Z轴方向上，刺破细胞膜，利用电极的瞬间感应分别测定探针在溶液中、接触细胞内液及细胞内外液交流后的电流电压，快速获得细胞质中K+相对浓度，进行样品间的差异比较。采用此方法，安全性高，绿色环保，用时较短，反应灵敏，数据精确，方法简单有效，实用性强。
【专利说明】
一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法
技术领域
[0001]本发明涉及植物细胞盐离子的测定方法，尤其是涉及一种测定烟草细胞K+相对浓度的方法。
【背景技术】
[0002]钾是植物体中含量最多的金属元素，主要以离子态存在，被公认为植物的品质元素，它的主要功能包括:能够通过影响气孔的开闭来调节水分蒸腾和二氧化碳进入叶片的过程;能够活化六十多种酶，直接或间接参与植物生长代谢的所有主要过程;可以促进光合作用的进行，并且加速光合作用产物向贮藏器官(种子、根)的输送;增进根系吸水;提高植物的抗逆能力。因此，细胞内K+浓度是植物生理学研究中最常用的指标，同时也是反映植物生长状态的重要指标。
[0003]目前测定细胞内K+浓度的方法，一般是用化学消煮，然后进行ICP(电感耦合等离子体发光质谱仪)测试，得到细胞内K+的浓度绝对值，一般以mg/g FW表示。采用该种方法，是将样品细胞经过预处理后，加入浓硝酸、浓硫酸和强氧化剂H2O2,置于电炉上加热消煮，全部消煮时间约为3个小时，耗费时间较长;其次，该方法前期的消煮需要用到浓硝酸、浓硫酸和强氧化剂H2O2等高危药剂，对环境有害，同时长时间消煮有爆炸的风险;此外，科研中常常涉及的对K+的测定，往往是用来进行相对值比较，不需要用到绝对值。因此，采用传统的化学消煮-1CP法测定细胞内K+浓度不仅过程繁琐，而且安全性不高。

【发明内容】

[0004]本发明目的是针对细胞内K+浓度测定的现状提供一种采用玻璃电极扎破细胞膜，利用电极来瞬间感应细胞内离子浓度，从而快速获得细胞质中K+相对浓度，进行样品间差异比较的方法。
[0005]本发明涉及的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，包括以下步骤:
步骤一、原生质体的制备
取待测烟草叶片，剪成方块状，放进细胞裂解缓冲液中，在28 °C，40 r/min下摇晃6-8小时，得到细胞裂解液，过滤细胞裂解液，取滤液;将所得滤液通过水平转头离心机在4 V，100 g下离心2min，离心结束，丢弃上清液，留下沉淀;所得沉淀用醋酸铵水溶液悬浮处理lh，得到原生质体液；
步骤二、玻璃电极系统的准备
玻璃电极系统采用非损伤微测系统;其中K+选择性微电极前端灌充有20μπι的选择性的氢离子液态交换剂，K+选择性微电极后端灌充有Icm的电解液柱，将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触;K+选择性微电极在使用前用校正液进行校正；接地参比电极为固体电极；
步骤三、离子浓度测定
在离子浓度测定之前，将经多聚赖氨酸水溶液处理过的盖玻片固定在测试小室的底部，取步骤一所得的原生质体液滴放在盖玻片的中央，静置5min，原生质体固定在盖玻片上;进行离子浓度测定时，K+选择性微电极在Z轴方向上，刺破细胞膜，出现第一个离子峰；然后电极将直接接触胞内液，当获得第二个离子峰的时候，所得的电压值，用来代表相对的离子浓度。
[0006]进一步的，步骤一中，烟草叶片被剪成2mm X 2 mm的方块。
[0007]进一步的，步骤一涉及的细胞裂解缓冲液，其中，每升细胞裂解缓冲液中含15g离析酶、20 g纤维素酶、0.05 g MES和0.5 mol甘露醇，余量为水;pH值为5.7;
其中，MES是2-(N-吗啡啉)乙磺酸，分子式为C6H13N04S。
[0008]进一步的，步骤一涉及的醋酸铵溶液，其中，每升醋酸铵水溶液中含3.85g醋酸铵、0.5 g MES和0.5 mol甘露醇，余量为水;pH值为5.7。
[0009]进一步的，步骤二中的电解液，由NaCl、KH2P04和水组成，其中，NaCl在电解液中的浓度为15 mmol/L，KH2PO4在电解液中的浓度为40臟01/1，电解液的?!1为7.0。
[0010]进一步的，步骤二中的K+选择性微电极，在使用前要进行校正，用pH6.5和pH 5.5的PBS缓冲液依次进行校正。
[OO11 ]进一步的，步骤三中的多聚赖氨酸水溶液的浓度为0.008%(m/v)。
[0012]有益效果:本发明的方法与现有技术相比，采用玻璃电极系统代替化学消煮，反应迅速，用时较短，同时无需用到强酸和强氧化剂，规避了安全性的风险，绿色环保;利用K+选择性微电极，通过刺破细胞膜获取电子流峰来进行离子浓度的比较，反应灵敏，数据精确，无需ICP测定K+的绝对浓度，方法简单有效，实用性强。
【附图说明】
[0013]图1是电极测定溶液离子浓度图；
图2是电极测定细胞内离子浓度图；
图3是电极测定细胞内外液交流后的细胞内离子浓度图；
图4是电极扎破细胞膜前后形成的离子流峰图；其中，图中*处为第二个离子峰；
图5是用玻璃电极离子峰法所测得的样品间K+相对浓度图；
图6是用化学消煮-1CP法所测得的样品间K+相对浓度图。
【具体实施方式】
[0014]以下通过实施例对本发明作进一步说明。
[0015]实施例1:一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，包括以下步骤:
步骤一、原生质体的制备
取I g烟草叶片，剪成2 mm X 2 mm的方块，放进细胞裂解缓冲液中，28 °C，40 r/min轻微摇晃6-8小时，得到的混合物即为细胞裂解液。细胞裂解液通过一层纱布过滤，取滤液;将所得滤液通过水平转头离心机在4 0CaOO g下离心2min，离心结束，丢弃上清液，留下沉淀，所得沉淀用下一步醋酸铵水溶液进行悬浮。
[0016]上述步骤涉及的细胞裂解缓冲液，其中，每升细胞裂解缓冲液中含15g离析酶、20g纤维素酶、0.05 g MES和0.5 mol甘露醇，余量为水;pH值为5.7。
[0017]其中，MES是2-(N_吗啡啉)乙磺酸，分子式为C6H13MkS;其中，纤维素酶和离析酶R-1O均购自Yakult公司，MES和甘露醇购自美国Amresco公司。
[0018]上述步骤涉及的醋酸铵溶液，其中，每升醋酸铵水溶液中含3.85g醋酸铵、0.5gMES和0.5 mol甘露醇，余量为水;pH值为5.7。
[0019]在醋酸铵水溶液中加入不同浓度的K+，形成K+浓度梯度:0 mmol/L，50 mmol/L，100mmol/L,150 mmol/L和200 mmol/L
[0020]用不同K+浓度的醋酸铵水溶液分别处理所得原生质体沉淀lh，获得五种原生质体液。因为醋酸铵溶液是辅助外界离子进入细胞，对细胞质和溶液进行离子平衡的试剂。所以，处理后的细胞内外K+浓度形成平衡。
[0021]步骤二、玻璃电极系统的准备
测定使用非损伤微电极，其中，κ+选择性微电极前端灌充有20 MI的选择性的氢离子的液态交换剂(LIX)，K+选择性微电极后端灌充有I cm的电解液柱。将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。接地参比电极为固体电极。
[0022 ]所述的玻璃电极系统为美国扬格公司的B1-OOIA测试系统。
[0023]其中，测定所用非损伤微电极为XY-H-Ol型，由旭月(北京)科技有限公司提供。
[0024]所述的K+选择性微电极在使用前用pH6.5和pH 5.5的I3BS缓冲液依次进行校正，能斯特斜率为58 mV/decade。
[0025]其中，PBS缓冲液为磷酸缓冲盐溶液，每升PBS缓冲液中含0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)，1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，余量为水;pH为7.4。
[0026]所述的选择性的氢离子的液态交换剂(LIX)购自Sigma，产品目录号为Hydrogen1nophore 1- cocktail B, 95293。
[0027]所述的电解液由NaCl、KH2PO4和水组成，其中，NaCI在电解液中的浓度为15 mmo I/UKH2PO4在电解液中的浓度为40 mmo I/L，电解液的pH为7.0。
[0028]所述的电极固定器(EHB-1)和接地参比电极(DRIREF-2)购自世界精密仪器商贸(上海)有限公司WPI。
[0029]步骤三、离子相对浓度测定
在离子浓度测定之前，盖玻片用0.008 %(m/v)多聚赖氨酸水溶液进行处理:将干净的盖玻片浸入0.008 %(m/v)多聚赖氨酸水溶液中，浸泡5min后，过夜风干，并干燥保存使用。试验前将处理过的盖玻片固定在测试小室的底部。取经含O mmol/L，50 mmol/L, 100 mmol/L，150 mmol/L和200 mmol/L K+浓度的醋酸铵溶液处理Ih后的原生质体液分别滴放在盖玻片的中央，静置5min，原生质体固定在盖玻片上，利用光学显微镜开始进行离子浓度测定。
[0030]用K+选择性微电极在Z轴方向上，刺破细胞膜，此过程包括三个步骤:第一，表面轻触，如图1所示，此时测定溶液离子浓度;第二，扎破细胞膜，如图2所示，测定细胞内离子浓度;第三，扎破细胞膜后，电极滞留在细胞内，如图3所示，测定细胞内外液交流后的液体内离子浓度。通过数据采集软件获得一个电极刺破细胞膜前后的离子流，如图4所示，其中，出现两个离子流峰:在电极扎破细胞瞬间，有一个突发离子流峰;离子流迅速下落，而到达第二个峰的时候，即图中*所表示的地方，就是电极重新恢复，测定细胞内K+含量的临界点。*之后，细胞内外液进行离子交换，K+流所指示的含量不断下降，最终回到扎破前的状态。
[0031]结合5种不同的烟草细胞样品，对获得的所有离子流以及离子流峰进行分析，获得样品间胞内K+相对浓度，用电压值来表示的K+相对含量，从而进行样品间K+含量的差异比较。结果如图5所示，经未加入K+(S卩K+浓度为O mmol/L)的醋酸铵溶液处理的烟草细胞的电压值约为55eV，处理烟草细胞的醋酸铵溶液中K+浓度越高，所测得电压值越大，其中，K+浓度相差50 mmol/L，所测得的值相差约10eV，样品间K+浓度差异比较明显；因此，本发明的玻璃电极离子峰法完全可以进行细胞内的K+浓度相对定量。
[0032]其中，所述的多聚赖氨酸购自美国Sigma公司。
[0033]其中，所述的光学显微镜为ZeissIM-35倒置相差显微镜。
[0034]其中，所述的数据采集软件为Asetl.05。
[0035]相关对比实验:用化学消煮-1CP法对电极离子峰相对定量方法的验证，包括以下步骤:
步骤一、原生质体的制备
取I g烟草叶片，剪成2 mm X 2 mm的方块，放进细胞裂解缓冲液中，28 °C，40 r/min轻微摇晃8小时，得到的混合物即为细胞裂解液。细胞裂解液通过一层纱布过滤，取滤液;将所得滤液通过水平转头离心机在4 0CaOO g下离心2min，离心结束，丢弃上清液，留下沉淀。所得沉淀用下一步醋酸铵水溶液进行悬浮。
[0036]上述步骤涉及的细胞裂解缓冲液，其中，每升细胞裂解缓冲液中含15g离析酶、20g纤维素酶、0.05 g MES和0.5 mol甘露醇，余量为水;pH值为5.7。
[0037]上述步骤涉及的醋酸铵溶液，其中，每升醋酸铵水溶液中含3.85g醋酸铵、0.5gMES和0.5 mol甘露醇，余量为水;pH值为5.7。
[0038]在醋酸铵水溶液中加入不同浓度的K+，形成K+浓度梯度:0 mmol/L,50 mmol/L，100mmol/L,150 mmol/L和200 mmol/L
[0039]用不同K+浓度的醋酸铵水溶液分别处理所得原生质体沉淀lh，获得五种原生质体液。因为醋酸铵水溶液是辅助外界离子进入细胞，对细胞质和溶液进行离子平衡的试剂。所以，处理后的细胞内外K+浓度形成平衡。
[0040]步骤二、化学消煮-1CP法测定K+含量
1.对分别经含Ommol/L,50 mmol/L, 100 mmol/L, 150 mmol/L和200 mmol/L K+浓度的醋酸铵处溶液处理Ih后的原生质体液通过10000 g离心进行收集，然后加入浓硝酸，浓硫酸和强氧化剂H2O2,置于电炉上加热消煮至瓶内溶液开始转白后，继续消煮120分钟，全部消煮时间约为3小时；
2.将冷却后的消煮液用水小心地洗入10ml容量瓶中，冲冼时用水应少量多次，轻轻摇动容量瓶，待完全冷却后，用水定容，用干燥漏斗和无磷滤纸将溶液滤入干燥的10ml三角瓶中。同时做空白试验；
3.将消煮液体进入ICP，测定K+浓度，以mg/gFW表示，如图6所示。
[0041 ]所述的ICP为ICAP6300电感耦合等离子体发射光谱仪。
[0042]通过对经化学消煮-1CP法和本发明的电极离子峰法测定的K+含量的差异比较可知，两种方法测得的相同样品细胞间K+相对含量的趋势是相同的，因此所建立的电极离子峰法完全可以进行细胞内K+浓度的相对定量，同时可以用于更广泛的样品间细胞内离子含量的比较。
[0043]以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一、原生质体的制备 取待测烟草叶片，剪成方块状，放进细胞裂解缓冲液中，在28°C，40r/min下摇晃6-8小时，得到细胞裂解液，过滤细胞裂解液，取滤液;将所得滤液通过水平转头离心机在40C , 100g下离心2min，离心结束，丢弃上清液，留下沉淀;所得沉淀用醋酸铵水溶液悬浮处理lh，得到原生质体液； 步骤二、玻璃电极系统的准备 玻璃电极系统采用非损伤微测系统;其中K+选择性微电极前端灌充有20μπι的选择性的氢离子液态交换剂，K+选择性微电极后端灌充有Icm的电解液柱，将电极固定器上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触;K+选择性微电极在使用前用校正液进行校正；接地参比电极为固体电极； 步骤三、离子相对浓度测定 在离子浓度测定之前，将经多聚赖氨酸水溶液处理过的盖玻片固定在测试小室的底部，取上述步骤一所得原生质体液滴放在盖玻片的中央，静置5min，原生质体固定在盖玻片上;进行离子浓度测定时，K+选择性微电极在Z轴方向上，刺破细胞膜，离子流上出现第一个离子峰;然后电极将直接接触胞内液，当获得第二个离子峰的时候，所得的电压值，用来代表相对的离子浓度。2.根据权利要求1所述的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:步骤一中所述的待测烟草叶片被剪成2 mmX2 mm的方块。3.根据权利要求1所述的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:步骤一中所述细胞裂解缓冲液，每升细胞裂解缓冲液中含15 g离析酶、20 g纤维素酶、0.05 g MES和0.5 mol甘露醇，余量为水;pH值为5.7。4.根据权利要求1所述的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:步骤一中所述醋酸铵溶液，每升醋酸铵水溶液中含3.85g醋酸铵、0.5 g MES和0.5 mo I甘露醇，余量为水;PH值为5.7。5.根据权利要求1所述的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:步骤二中所述电解液中含15mmol/L NaCl和40mmol/L KH2PO4，余量为水;pH为7.0。6.根据权利要求1所述的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:步骤二中所述K+选择性微电极，在使用前要进行校正。7.根据权利要求6所述的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:采用pH6.5和pH 5.5的PBS缓冲液依次进行校正。8.根据权利要求1所述的一种测定烟草细胞内K+相对浓度的方法，其特征在于:步骤三中所述多聚赖氨酸水溶液的质量体积百分比浓度为0.008%。
【文档编号】G01N27/36GK106093162SQ201610396520
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月7日 公开号201610396520.8, CN 106093162 A, CN 106093162A, CN 201610396520, CN-A-106093162, CN106093162 A, CN106093162A, CN201610396520, CN201610396520.8
【发明人】刘晶, 郑轶琦, 田耀武, 赵燕, 张巧明, 王哲锋
【申请人】河南科技大学