一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型葡聚糖（DEX)氧化还原敏感骨靶向胶束的设计制备及应用 方案。
【背景技术】
[0002] 研究发现至少50%的癌症晚期患者会出现骨转移的现象。肿瘤骨转移的发生影响 了药物对肿瘤的治疗，增加了患者的疼痛，降低了患者的存活率。由于骨质硬度大、血管分 布少、药物渗透性低等特点，传统给药方式很难将药物有效递送至骨转移瘤处。如何有效递 送药物，是解决骨转移瘤治疗难题的关键。骨靶向递药系统的提出，为骨转移瘤的治疗带来 了曙光。
[0003] 双膦酸盐类（BPs)对骨的HA具有很高的亲和力。一旦BPs进入体内后，BPs就会 被快速从血液循环中清除而吸附到暴露的骨矿物质区域。阿仑膦酸钠（ALN)属于第三代 BPs类药物，具有很强的亲骨性，其结构简单，可化学修饰，被广泛用作递药系统中的骨靶向 配体。研究表明，对环境响应的递药系统对药物的可控释放起到关键作用。二硫键是一种 对谷胱甘肽（GSH)敏感的化学键，在肿瘤细胞内外GSH的含量差别巨大。其中肿瘤细胞内 GSH的浓度可达到2-10mM，而肿瘤细胞外GSH的浓度约为2-20 μ M，浓度几乎相差1000倍。 利用二硫键连接的递药系统可以选择性的将药物释放在GSH含量高的肿瘤细胞内，而在血 液中可以稳定存在。
[0004] 葡聚糖（DEX)具有良好的生物相容性和水溶性，已被广泛应用于生物医药领域。 基于DEX制备的胶束递药系统，因其具有粒径小、载药力强等特征已被广泛研究。最近的研 究还表明基于DEX的胶束在体内循环也具有类似PEG "隐形"的功能。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，可以 将更多DOX递送到骨转移瘤处，同时显著降低DOX在正常组织的分布，从而有效提高DOX的 抗肿瘤活性，降低其毒副作用，为治疗骨转移癌递药系统的开发提供新思路。
[0006] -种可用于治疗骨转移癌的氧化还原敏感骨靶向胶束，其特征是以阿仑膦酸 钠（ALN)为骨靶向配基，以分子量5000的葡聚糖（DEX (5K))为亲水材料，以十四胺（M) 为疏水材料，以3, 3二硫二丙酸（DPC)为交联剂合成MA-DEX(5K)-ALN，以阿霉素（DOX)为 模型药物，制备出兼有主动骨靶向及对肿瘤细胞微环境有特异性响应的纳米胶束DOXO MA-DEX w-ALN。
[0007] 具体制备方法如下：
[0008] (1)二硫二丙酸-阿仑膦酸钠（DPC-ALN)的合成方法
[0009] ①在 20mL 的 1，4 二氧六环中加入 2. 4mmol 的 DPC 501. lmg，4. 8mmol 的 EDCI 916. 8mg，搅拌30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 μ L的TEA，继续搅拌活化 3h ;②在20mL的蒸馏水中加入I. 2mmol的ALN 325. 6mg，充分溶解后，分三批次缓慢滴加入 上述反应液，在反应过程中，缓慢滴加0. 2M NaOH使反应液的pH值稳定维持在7. O左右，2 小时后继续滴加0. 2M NaOH使pH调成9. 0,继续反应过夜，反应结束后旋干溶剂，固体用大 量二氯甲烷反复润洗三次，甲醇润洗三次，得产物；
[0010] (2)二硫二丙酸-十四胺（DPC-M)的合成方法
[0011]在 20mL 的 1，4 二氧六环中加入 2. 4mmol 的 DPC 500mg，4. 8mmol 的 EDCI 916. 8mg， 搅拌30min，然后加入5. Ommol的NHS 575. 2mg以及150 μ L的TEA，继续搅拌活化3h，随后 在反应液中加入I. 3_〇1的M 217. 6mg，室温反应12h，TLC监测反应，结束反应后，过柱分 离，其中展开剂以体积比计为：二氯甲烷：甲醇=10:1 ;
[0012] (3)葡聚糖(5K)-3, 3二硫二丙酸-十四胺（DEXw-DPC-MA)的合成方法
[0013] 称取一定量的DPC-MA、EDCI、NHS和TEA依次溶于30mL的DMSO中，充分溶解后加 入一定量的DEX w，室温反应12h，结束反应后，过滤反应液，得淡黄色澄清液体，滤液用大 量二氯甲烷沉淀，并反复用二氯甲烷清洗沉淀，甲醇润洗沉淀三次，最后将沉淀溶于少量蒸 馏水中透析冻干，即得DEX (5K)-DPC-OA ;
[0014] (4)十四胺-3, 3二硫二丙酸-葡聚糖teK)-3, 3二硫二丙酸-阿仑膦酸钠 (ma-dpc-dex(5K)-dpc-aln)的合成方法
[0015] 称取一定量的DPC-ALN、EDCI、NHS和TEA依次溶于40mL的DMSO中，充分 溶解后加入一定量的DEX eK) -DPC-M，油浴60 °C反应48h，反应结束后透析冻干即得 MA-DPC-DEX(5K)-DPC-ALN，缩写为 MA-DEX(5K)-ALN ;
[0016] (5)MA-DEXw-ALN载阿霉素（DOX)胶束的制备
[0017] 称取3mg DOX · HCl于4mL DMSO中，再加入3 μ L的TEA，在60°C油浴中避光磁力 搅拌Ih使其充分溶解，加 IOmg的MA-DEX(5K)-ALN于制备液中，持续搅拌2h后缓慢滴加蒸馏 水32mL，继续搅拌12h ;将上述混合液装入分子截留量为2000的透析袋中，透析48h，每6h 换一次水，透析后冷冻干燥得聚合物载药胶束。
[0018] 本发明骨靶向胶束D0X_V-DEX(5K) -ALN对DOX具有较高的载药量与包封率，可明显 增加 DOX对羟基磷灰石（HA)的吸附量，将更多的DOX递送至骨转移瘤处，从而使DOX在肿 瘤组织富集，增加 DOX对骨转移癌的治疗作用，减轻肿瘤对骨的破坏作用；同时降低DOX在 正常组织的分布，提高DOX的疗效，降低毒副作用。
【附图说明】
[0019] 图1是DOX及D0X@MA-DEX(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后肿瘤体积的变化图。裸鼠 胫骨骨髓腔注射A549细胞造模，尾静脉给药。A :普通相机观察荷瘤裸鼠肿瘤体积；B :测 量荷瘤裸鼠肿瘤体积变化；C :各给药组肿瘤体积抑制率。η = 3, ?土S，*P〈0. 05, VS DOX ; #P〈0. 05,VS Control。
[0020] 图2是DOX及D0X@MA-DEX(5K)-ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后裸鼠体重的变化曲线图。 裸鼠胫骨骨髓腔注射A549细胞造模，尾静脉给药。η = 3,〒:tS, *P〈0. 05, VS D0X。
[0021 ] 图3是DOX及D0X0MA-DEX (5K) -ALN胶束治疗荷瘤裸鼠后荷瘤裸鼠右后肢 Micro-CT重建（A)及矢状位图像（B);荷瘤裸鼠右后肢Micro-CT数据分析（C和D)。BV/ TV 为骨体积 / 组织体积。η = 3, J士S，*Ρ〈0· 05, VS D0X。
[0022] 具体实施方法
[0023] D0X@MA-DEX(5K)-ALN胶束的体内外抗肿瘤活性研究
[0024] 1目的：通过体内外实验，评价D0X_V-DEX(5K)-ALN胶束的抗肿瘤活性。
[0025] 2研究方法：
[0026] 2. 1包封率及载药量测定
[0027] 应用荧光分光光度法测定DOX浓度，激发波长为470nm，发射波长为597nm，用DMSO 作为溶媒配制100 μ g/mL DOX标准储备液，然后分别稀释为0. 1、1.0、2.0、5.0、10. 0、15. 0、 25. 0 μ g/mL，荧光分光光度计测定荧光强度，以荧光强度对浓度进行线性拟合，得到检测 DOX 标准曲线的回归方程为 y = 20. 118x-15. 352, R2= 0. 9976。其中 DOX 在 0. 1-25 μ g/mL 范围内，荧光光度值与浓度具有良好的线性关系。
[0028] 称取Img的载药胶束D0X_V-DEXeK)-ALN溶解于3mLDMS0中，测定DOX荧光强度， 每个样品测定三次。载药量以及包封率由以下公式计算：
[0029] 载药量=(胶束中药物量/胶束的量）X 100%
[0030] 包封率=(胶束中包封的药物量/制备胶束投入的药物总量）X 100%
[0031] 2. 2评价D0X_V-DEX(5K)-ALN胶束与HA的吸附动力学
[0032] 精密称取Img的DOX和D0X_V-DEX(5K)-ALN胶束溶解于IOmL的PBS中，测定溶液 的吸光度值，记录数据。然后分别加入IOOmg的HA搅拌，在5、15、30和60min时，样品于 5000rmp离心10min，吸取上清液分别测定吸光度值。
[0033] 吸附率=[(测前-测后）/测前]X100%
[0034] 2. 3评价DOX@MA-DEXw-ALN胶束的体外细胞毒性
[0035] 利用MTT法测定DOX以及DOX_V-DEXw-ALN胶束对A549细胞、PC-3细胞、 MDA-MB-231细胞及MDA-MB-231/ADR细胞的毒性作用。取对数生长期的肿瘤细胞，用0. 25% 的胰蛋白酶消化，接种于96孔板（细胞浓度IXioVmL,接种体积200 yL)。置于孵箱 (37°C )中培养24h，弃去培养液。分别将DOX和D0X@MA-DEX(5K)-ALN胶束溶于无血清的培 养液中，以不加药物为阴性对照组。胶束折合DOX的浓度分别为0. 08、0. 8、8. O和40.0 μ g/ mL，每孔加入200 μ L药物溶液，孵育24h。每孔加入20 μ L MTT溶液，继续培养4h后弃去培 养液，每孔加入200 μ L的DMSO。将培养板置于摇床振摇lOmin，酶标仪490nm处测定吸光 度值。细胞生存率％ =(给药后的吸光度值/阴性对照的吸光度值）X 100