具有电荷翻转及靶向功能的聚赖氨酸纳米前药胶束及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有电荷翻转及靶向功能的聚赖氨酸纳米前药胶束及其制备方 法和在制备肿瘤靶向药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 近些年来，由于环境等各方面的原因，癌症在日常生活中变得越来越为常见，而且 呈现出低龄化的趋势，俨然已经成为了人类健康的最大威胁。但是，由于目前所常用的抗癌 药物的选择性低，为了实现临床效力，一般都会给予病人比较高的药物剂量，但是这同时也 可能对健康细胞造成严重损伤。因此，当前针对癌症较为有效的方法就是开发高效的药物 运输系统来减少药物对健康细胞的损伤。
[0003] 目前所常见的抗癌药物主要为DNA毒化物，顾名思义，这些药物必须得进入细胞核 才能够发挥其应有的作用。然而，耐药性肿瘤细胞具有多种机制，可以比较高效的阻止药物 进入细胞核。因此，用于抗癌药物运输的载体必须具有核定位能力，比较常见的为一些带正 电的生物大分子。然而，这类带正电荷的聚合物很容易被网状内皮系统所识别并清除出血 液循环，也会与血液中的蛋白发生吸附作用从而带来一定的风险。针对这一问题，现在较为 常用的方法是将聚合物用聚乙二醇、两性离子或者是羧基酰胺进行修饰。
[0004] 其中羧基酰胺修饰后所得到的药物载体具有电荷翻转的能力。其在人体正常的 生理条件下能够稳定存在，呈现负电，而当到达肿瘤组织或者癌细胞内时，由于pH环境变为 弱酸性，从而导致羧基酰胺水解，使得原先的负电体系变为正电。因此，这样一种具有电 荷翻转能力的药物载体，一方面可以避免血液循环中蛋白的吸附，同时也具有较好的核定 位能力。
[0005] 聚赖氨酸是近年来较为热门而且研究最为广泛的一种聚氨基酸，除了一般聚氨基 酸所具有的良好的生物相容性、无毒副作用，无免疫原性、可生物降解等优点外，合成相对 而言较为简单易于控制，化学修饰较为方便，当用作药物载体时载药量较大且对某些癌细 胞具有亲和性，而其侧链上的氨基也为制备具有电荷翻转能力的药物载体提供了便利。
[0006] 此外，上述具有电荷翻转能力药物载体癌细胞附近偏酸性的环境中通过电荷翻转 变成正电体系后还可以增加细胞内吞作用。因此研制这么一种具有电荷翻转及靶向功能的 聚赖氨酸纳米前药胶束具有重要的研究意义以及应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有电荷翻转及靶向功能的聚赖氨酸纳 米前药胶束及其制备方法和在制备肿瘤靶向药物中的应用，简化了前药胶束的结构与制备 过程，并且该前药胶束同时兼具主动、被动靶向以及pH响应性能，可以提高治疗效率，降低 毒副作用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0009] 本发明提供了一种具有电荷翻转及靶向功能的聚赖氨酸纳米前药胶束，所述纳米 胶束以疏水性药物为内核，所述的疏水性药物结构中含有氨基，聚赖氨酸链为壳层，所述聚 赖氨酸链由10~25个赖氨酸组成，疏水性药物的氨基和聚赖氨酸链的末端羧基通过酰胺键 连接，并且在聚赖氨酸链末端氨基通过酰胺键修饰上靶向配体，将聚赖氨酸链侧链氨基进 行羧基酰胺化。
[0010] 进一步，所述疏水性药物可以是阿霉素(D0X)、阿霉素盐、吡柔比星等，其中阿霉素 盐可以是阿霉素无机酸盐：如阿霉素盐酸盐、阿霉素硫酸盐、阿霉素硝酸盐等；也可以是阿 霉素有机酸盐，如阿霉素草酸盐、阿霉素乙酸盐等。优选疏水性药物为阿霉素。
[0011] 进一步，所述聚赖氨酸链优选由19个赖氨酸组成。
[0012] 进一步，所述靶向配体可以是叶酸或者乳糖酸，优选叶酸。
[0013] 进一步，与聚赖氨酸链侧链氨基进行羧基酰胺化的试剂可以是2,3_二甲基马来 酸酐、2-甲基马来酸酐、3，4，5，6-四氢苯酐、2，2，3，3-四甲基丁二酸酐、丁二酸酐或马来酸 酐，优选2,3_二甲基马来酸酐。
[0014] 本发明还提供了一种所述具有电荷翻转及靶向功能的聚赖氨酸纳米前药胶束的 制备方法，包括如下步骤：
[0015] (1)将疏水性药物溶解在有机溶剂A中，在氮气保护下加入赖氨酸类化合物，所述 的赖氨酸类化合物的侧链氨基通过保护基团保护，于20_70°C避光搅拌2-5天，将反应溶液 用有机溶剂D沉淀，抽滤，室温真空干燥得到产物A;
[0016] (2)将产物A溶解在有机溶剂B中，加入1-羟基苯并三唑(H0BT)、0-苯并三氮唑-四 甲基脲六氟磷酸酯(mTU)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)和靶向配体，搅拌反应2~24h，将反应 液先对有机溶剂B透析1~2天，再对超纯水透析2~4天，其中透析袋的MWC0为500~1500Da， 取截留液冷冻干燥得到产物B;
[0017] (3)脱除产物B中侧链氨基上的保护基，得到产物C;
[0018] (4)将产物C超声分散在有机溶剂C中，加入三乙胺(TEA)和进行e-羧基酰胺化的试 剂，搅拌反应2~24h，反应液用有机溶剂D沉淀，离心后真空干燥得到产物D;
[0019] (5)将产物D溶解在水中，超声静置后将水溶液冷冻干燥即得到具有电荷翻转及靶 向功能的聚赖氨酸纳米前药胶束；
[0020] 其中，有机溶剂A、有机溶剂B、有机溶剂C各自独立选自下列之一：乙腈、N，N-二甲 基甲酰胺(DMF)、六甲基磷酰胺、二甲基亚砜，优选为DMF;并且步骤⑴~(4)操作过程中全 程避光。有机溶剂D可以为乙醚、丙醚、石油醚、正己烷、环己烷、甲苯，优选乙醚。
[0021] 进一步，步骤(1)中，所述赖氨酸类化合物为Ne-苄氧羰基-L-赖氨酸、Ne-叔丁氧羰 基-L-赖氨酸或Ne-芴甲氧羰基-L-赖氨酸，优选Ne-苄氧羰基-L-赖氨酸。
[0022] 进一步，步骤(1)中，所述疏水性药物与赖氨酸类化合物的物质的量之比为1:10~ 30，优选两者的物质的量之比为1: 25~30，最优选为1:28.4;所述有机溶剂A的用量以疏水 性药物的物质的量计为90~180L/mol，优选100~120L/mol，最优选116L/mol。
[0023] 进一步，步骤(2)中，所述产物A、l-羟基苯并三唑(H0BT)、0-苯并三氮唑-四甲基脲 六氟磷酸酯(mTU)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA)、靶向配体五者的物质的量之比为1:1~3:1 ~3:2~6:3~6〇
[0024]进一步，步骤(3)中，本领域技术人员可按照文献报道方法脱除产物B中氨基上的 保护基，例如赖氨酸类化合物为Ne_苄氧羰基-L-赖氨酸时，可通过如下方法脱除保护基:将 产物B溶解在一定量的三氟乙酸(TFA)中，冰浴搅拌一段时间后缓慢滴加一定量的33wt. % HBr/AcOH溶液，搅拌1-2h，即可将产物B侧链氨基上的保护基团脱除，产物B与33wt.%HBr/ AcOH溶液物质的量之比为1:60~400。
[0025]进一步，步骤(4)中，产物C、三乙胺(TEA)和进行羧基酰胺化的试剂物质的量之 比为 1:0.05 ~0.1:20 ~75。
[0026] 本发明中，产物A、产物B、产物C的物质的量是分别根据其质量除以GPC结果中的Mw 计。
[0027] 本文还提供了所述具有电荷翻转及靶向功能的聚赖氨酸纳米前药胶束在制备肿 瘤靶向药物中的应用。
[0028] 与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
[0029] (a)本发明直接利用疏水性药物引发赖氨酸酸酐开环聚合，此法较为简便；
[0030] (b)本发明中的所制备的纳米前药是一种由纯药物组成、零含量惰性载体的纳米 药物，避免了其他类似纳米药中大量惰性药物载体的存在，避免了由于这些载体材料的存 在对人体中相关组织器官的代谢负担，避免了载体材料可能存在的毒副作用;本发明中所 制备的纳米胶束兼具主动靶向与被动靶向，具有较好的靶向潜力;本发明所设计纳米胶束 的电势对pH具有响应性，一方面可以有效避免血液循环中蛋白的吸附，另外一方面增加了 进入细胞的能力。
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例1的D0X-PLL (DMA) -FA合成示意图
[0032]图2为本发明实施例1的D0X-PLL(DMA)-FA的傅里叶红外光谱图；
[0033]图3为通过DLS测得的实施例1所制备D0X-PLL-FA胶束水合粒径分布图；
[0034]图4为透射电镜中观察到的实施例1所制备D0X-PLL(DMA)-FA胶束形态以及DLS测 得的水合粒径分布图；
[0035]图5为实施例1所制备的D0X-PLL(DMA)-FA胶束在37°C，不同pH环境下电荷反转图； [0036]图6为实施例1所制备的D0X-PLL(DMA)-FA胶束在37°C，不同木瓜蛋白酶活力下的 D0X释放曲线。
【具体实施方式】
[0037]以下对本发明的实施方式给出详细介绍，但本发明的保护范围不限于此。
[0038] 实施例1:
[0039] (1)光气法制备Ne-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐:将2.62g(0.02mol)的Ne-苄氧羰基- L-赖氨酸超声分散在90mL的无水THF中，全程N2保护，50°C下进行剧烈搅拌。将5.94g重结晶 后的三光气溶解在15mL的无水THF中，逐滴滴加到反应体系中，直到溶液变成澄清，之后继 续搅拌反应90min，最后减压蒸馏掉大概2/3左右的溶剂，然后加入到大量的正己烷中，抽滤 得到固体，再进行两次重结晶，将产物在室温下真空干燥过夜，即制备得到Z-Lys-NCA。 [0040] (2)D0X引发NCA开环聚合制备DOX-PLL(Z):将20mg D0X溶于3mL的无水DMF中，将 320mg上述制备得到的Z-Lys-NCA溶解在lmL的无水DMF中，将其缓慢滴加到D0X/DMF溶液中， 在犯保护下，50°C油浴搅拌反应4天，将反应后的溶液滴加到过量的乙醚中进行沉淀，抽滤 得到产物并在30°C下真空干燥过夜。实验过程中全程进行遮光处理。表1为实施例所制备 DOX-PLL(Z)的 GPC 结果；
[0041]表1
[0043]根据GPC结果可知，D0X-PLL (Z)中赖氨酸的链段数为19。
[0044] (3)D0X-PLL(Z)-FA的制备:称取100mg上述制备得到的DOX-PLL(Z)溶解在5mL的无 水DMF中，加入70mg的HBTU和24mg的H0BT