作为抗癌剂的自组装的两亲性聚合物的制作方法
【专利说明】作为抗癌剂的自组装的两亲性聚合物
[0001] 本申请是以下申请的分案申请：申请日：2007年7月19日；【申请号】2007800538370 (PCT/US2007/073880);发明名称："作为抗癌剂的自组装的两亲性聚合物"。 发明领域
[0002] 本发明涉及两亲性聚合物的领域，尤其是生物相容的形成胶束的梳型聚合物的领 域。本发明还涉及靶向的药物递送和抗癌剂的领域。
[0003] 背景
[0004] 近些年，含有疏水嵌段和亲水嵌段的两亲性嵌段共聚物由于当周围溶剂变化时它 们的自组装为各种纳米结构的能力而被充分研究。参见Cameron等人Can . J . Chem. / Rev. Can. Chim. 77:1311-1326(1999)。在水性溶液中，两亲性聚合物的疏水段有为了避免与 水接触并将体系的界面自由能最小化而自组装的趋势。同时，亲水嵌段在水性环境中形成 水合的"晕(corona)"并且因此聚集体保持热动力学上稳定的结构。所得的是具有疏水核和 亲水晕的聚合物聚集体颗粒的稳定的、乳胶状的胶体悬浮液。
[0005] 梳型两亲性共聚物与嵌段共聚物不同在于其主链主要是疏水的或亲水的，具有从 主链悬垂而不是并入主链的相反极性的聚合物链。已经用疏水主链和亲水支链制备了梳型 共聚物(Mayes等人，美国专利第6，399，700号），并且也用亲水主链和疏水支链制备了梳型 共聚物(Watterson等人，美国专利第6,521，736号；1]^1叫1311等人，美国申请公开第2006/ 0148982号）。前者被用于提供对细胞表面受体的配体的多价展示，而后者被用于使药物增 溶并将它们递送至细胞。
[0006] 已经将两亲性聚合物聚集体作为用于增溶不溶性药物的载体，靶向的药物递送载 体，和siRNA或基因递送系统进行研究。由于链缠结和/或内部疏水区域的结晶性，它们具有 比常规低分子量胶束更稳定的结构。载体的聚合性质使得聚集体对一般的脂质体在被稀释 至它们的临界胶束浓度时会经受的崩解相对免疫。双层膜的缺少使得它们更容易与细胞膜 融合并且将它们的有效载荷直接递送至细胞。聚集体的两亲性质还提供了类洗涤剂的活性 并且适当地靶向的聚集体表现为能够与病毒外壳蛋白融合并干扰病毒外壳蛋白。
[0007] 由于聚（乙二醇）（PEG)的良好的生物相容性以及PEG包被的"隐形"颗粒避开网状 内皮组织系统的显著能力，并有PEG的胶束、脂质体和聚合物作为用于药物递送系统的材料 已经得到广泛认同。有许多将PEG作为PEG-脂质（形成脂质体和胶束）的亲水成分的使用的 报道；参见例如Krishnadas等人，Pharm.Res . 20: 297-302(2003)。已将自组装为更坚固的 "聚合物组装聚集体(polymersomes)"的自组装的两亲性嵌段共聚物作为用于药物增溶和 递送的载体来研究。参见例如Jones和Leroux，Eur ? J ? Pharm? Biopharm.48:101-111 (1999); Photos 等人，J. Controlled Release，90:323-334(2003); Kataoka 等人，Ad v. Drug Deliv.Rev.47:113-131 (2001);以及Torchjlin，J.Controlled Rel. 73:137-172(2001)。
[0008] 还参见Gref等人，Int ? Symp ? Controlled Release Mater ? 20:131 (1993) ;Kwon等 人，Langmuir，9:945(1993) ;Kabanov等人，J.Controlled Release，22:141(1992) ;Allen等 人，J. Control led Re lease，63:275 (2000); Inoue等人，J. Controlled Re lease，51:221 (1998) ;Yu和Eisenberg，Macromolecules，29:6359(1996) ;Discher等人，Science，284:113 (1999) ;灯111等人，美国专利第6,322,805号；36〇等人，美国专利第6,616,941和7,217,770 号；Seo等人，欧洲专利第EP 0583955号。已经报道了具有这种能力的聚（乙烯亚胺）（PEI)的 使用，重点在于寡核苷酸的递送(Nam等人，美国专利第6,569,528号;Wagner等人，美国专利 申请公开第20040248842号）。类似地，Luo等人，在Macromolecules 35:3456(2002)中描述 了适用于递送多核苷酸的PEG辄合的聚酰胺型胺类("PAMAM")树枝状大分子。
[0009] 除了对增溶、分配和递送药物的需求，还有对于对靶细胞类型、组织、肿瘤或器官 特异性定向的靶向的药物递送系统的需求。这往往通过连接对靶位点处的细胞壁具有特异 性亲和力的抗体或其他配体来实现。然而除了在聚合物链的末端以外PEG缺乏官能团，并且 在嵌段共聚物中，大部分的末端基团不可避免地被与其他嵌段共聚物部分的连接键所占 据。出于这一原因，靶向部分例如抗体或细胞粘附分子与PEG嵌段共聚物的连接通常被限制 于非PEG嵌段，遗憾地非PEG嵌段不是共聚物通常以自组装聚集体的晕暴露的部分。
[0010] 导致嵌段共聚物自组装为聚合物聚集体的相分离现象是容易可逆的，并且已经进 行了通过交联疏水核增加聚集体的稳定性的尝试(参见欧洲专利第EP 0552802号）。还尝试 了药物对嵌段共聚物的疏水部分的共价连接(Park和Yoo，美国专利第6，623，729号;欧洲专 利第EP 0397307号）。
[0011] 树枝状聚合物容易与靶向部分辄合并且具有体内靶向特异细胞（Singh等人 (1994)C1 in. Chem. 40:1845)以及阻碍病毒和细菌病原体对生物学基底粘附的潜能。已经评 价了与多个唾液酸辄合的梳型支链和支化接枝(dendrigraft)聚合物的抑制病毒血细胞凝 集和体外阻碍哺乳动物细胞的感染的能力（Reuter等人（1999)Biocon jugate Chem. 10 : 271)。最有效的病毒抑制剂是梳型支链和支化接枝的大分子，其显示出50，000倍增加的抗 这些病毒的活性。
[0012] 近来，药物公司Starpharma宣布成功开发了通过与病毒表面上的受体结合而预防 HIV感染的树枝状大分子基础的杀生物剂(VivaGel?)(Halford(2005)Chem.&Eng.News 83 (24):30)。Chen等人（2000) (Biomacromolecules ? 1:473)已经报道了季铵官能化的聚（丙稀 亚胺)树枝状大分子是非常强效的杀生物剂。
[0013]杀死癌细胞而不损害患者的几乎相同的健康细胞是非常困难的有待解决的问题。 即便用最成功的化学治疗剂，仅仅部分实现了对癌细胞的机制基础的选择性毒性。出于这 一原因，癌疗法是尤其需要靶向递送的一类剂，并且已经对开发癌特异性细胞表面标记的 配体进行了大量的努力（Delgado和Francis，Drug Targeting: Strategies，Principles and Applications(药物革巴向：策略、原则和应用），Humana Press，2000)。
[0014]例如，在卵巢、肾、肺、乳腺、脑和子宫内膜的癌以及造血来源的骨髓细胞中叶酸的 细胞表面受体常常升高。由于叶酸的受体在正常细胞中通常很少见，但却在癌细胞表面上 显示，因此它已经常常被利用为受体定向的癌疗法的革El(Lu和Low，J Control Release.91 ： 17-29(2003))。报道的应用中叶酸与抗肿瘤药物、抗体(美国专利第5，547,668号）、脂质体 (Liu和Lee，Drug Design Reviews 0nline，2:547_552(2005))和其他纳米粒子药物递送结 构（Torchilin，Adv.Drug Delivery Rev.58:1532-1555(2006))直接辄合。由叶酸辄合的两 亲性嵌段共聚物形成的胶束已经显示出将紫杉醇选择性地递送至肿瘤细胞(Park等人， J.Controlled Release 109:158-168(2005))。
[0015]相似地，表皮生长因子受体(ErbBl，EGFR)在广谱的上皮起源的人类肿瘤中过量表 达，所述肿瘤包括乳腺、头颈、胃、结肠直肠、食道、前列腺、膀胱、肾脏、胰腺和卵巢癌，以及 非小细胞性肺癌。这些发现已经将EGFR确立为受体介导的递送系统的另一个重要的靶。EGF 本身显示出强的促有丝分裂和血管生成活性，这使得它不适合作为靶向部分，但是已经为 了这一目的开发了 EGFR的多种非激动剂配体。
[0016]已经成功地将直接抗细胞特异或肿瘤特异的表位的抗体用作靶向疗法，单独地 (活化患者的补体系统)或递送放射性同位素或毒素。例如，托西莫单抗、抗CD20 B淋巴细胞 抗原的鼠 IgG2aA单克隆抗体可被放射性碘标记并被用于将碘-131选择性地递送至淋巴细 胞。这已经作为用于非霍奇金淋巴瘤的治疗成功地在临床上得到证实，并且已经以商品名 品化用于这一适应症。相似地，另一种抗CD20的单克隆抗体伊莫单抗 (Zevalin?)，已经被用以递送用于非霍奇金淋巴瘤的免疫放射疗法的钇-90。
[0017 ]其他临床上成功的靶向癌的抗体包括用于慢性淋巴细胞性白血病的阿伦单抗(抗 CD 5 2，Campa th?)，用于结肠癌和肺癌的贝伐单抗(抗VEGF，Ava s t i n?)，用于结肠、头颈癌的 西妥昔单抗(抗EGFR，Erbitux?)和帕尼单抗(抗EGFR，VeCtibi X?)，用于急性髓性白血病的 吉妥单抗(抗⑶33，Mylotarg?)，用于非霍奇金淋巴瘤的利妥昔单抗(抗-CD20，Rituxan?) 和依帕珠单抗（抗CD22，Lymphocide?)，以及用于乳腺癌的曲妥珠单抗（抗HER-2， Herceptin?)。具有特异的相关性的是免疫毒素Mylotarg?，其中抗CD33抗体与一种细胞毒 性的抗肿瘤药物卡奇霉素辄合。
[0018]仍然有对于稳定的、生物相容性的、易于连接各种靶向部分并且有效地将药物的 大致有效载荷递送至所期望的肿瘤细胞靶的药物递送系统的需求。还有对于类似地稳定 的、高效的并且生物相容性的靶向的抗癌剂的需求。
[0019] 发明概述
[0020] 本发明提供了生物相容性的梳型聚合物分子，其含有具有支化点部分的亲水主链 和在这些支化点部分处连接的疏水支链。支化点部分进一步以反应性官能团的形式提供连 接点，肿瘤细胞特异性的靶向部分可与其连接。本发明提供了由这些聚合物形成的聚合物 聚集体的水性悬浮液，并且提供了通过将抗肿瘤剂包封进聚合物聚集体的疏水核中来增溶 这些抗肿瘤剂的方法。用于包封药物的方法基本上包括将药物物质与本发明的聚合物在水 性溶剂或混合的水性溶剂中接触。所得到的药物有效载荷当在水性环境中悬浮时，在由梳 型聚合物形成的大分子聚合物聚集体的疏水核内被保持在增溶(solublized)状态。在优选 的实施方案中，聚合物聚集体及其包封的药物有效载荷通过靶向部分被选择性地递送至所 靶向的癌细胞。
[0021] 本发明还提供了杀死癌细胞或抑制癌细胞的生长或复制，或者治疗哺乳动物中癌 的方法，所述方法包括将所述癌细胞与包封在梳型聚合物内的抗癌药物接触或对所述哺乳 动物施用包封在梳型聚合物内的抗癌药物，所述梳型聚合物主要由下列结构组成：
[0022]
[0023] 该结构包括由交替的支化点部分B和亲水的、水溶性的聚合物嵌段A形成的主链。 疏水侧链C以及任选地靶向部分Z被连接到支化点部分。应当理解的是聚合物链具有末端基 团，通常为位于末端B部分处的H或聚合物嵌段A，以及通常位于末端A聚合物嵌段处的0H，但 是本发明包括所有常规的链末端。优选地，侧链C是任选地由一个或多个亲水的取代基取代 的直链或支链的烃，或任选地由一个或多个亲水取代基取代的C 6-C3Q环烃或多环烃。侧链C 还可以是疏水的氨基酸、肽或聚合物。对侧链C来说适合的亲水取代基是羟基、羧基和氨基 基团，以及酰胺、磺酰胺、亚砜和砜基团。优选的亲水取代基是极性的质子惰性的基团，例如 叔酰胺、亚讽和讽。
[0024] 任选的靶向部分Z是对癌细胞表面具有特异性结合亲和力的配体或抗体。在本发 明的一些实施方案中，两种或更多种不同的部分Z存在于给定的支化点或聚合物分子上，以 便作为增加特异性的方法而可以靶向多种细胞表面受体和抗原。"特异性结合亲和力"意指 配体或抗体在待治疗的哺乳动物的体内发现的许多其他细胞的表面和大分子存在的情况 下能够在体内与癌细胞表面结合。亲和力可以是单独对癌细胞特异性的，或者可以是对患 者内是癌性的细胞类型特异性的。例如，在B-细胞淋巴瘤中，配体可以是所有B-细胞上存在 的CD-20受体的抗体。特异性的程度不需要非常高，但是必须足以比单独的被增溶的药物有 效载荷更有效地治疗癌。由"s"表示的部分是键或者间隔基部分，并且当s是间隔基时每个 8 可带有1至4个基团Z。!!的值在1至约100的范围内；p的平均值在从1至2的范围内，并且在一 些实施方案中r可是零。在r为非零的那些实施方案中，r的平均值在1至4的范围内。
[0025] 支化点部分B是具有与两个聚合物嵌段A的键、与1-2个侧链C(平均）的键、以及当r 为非零时与间隔基"s"和/或配体Z的一个或多个键的多价部分。在特定的实施方案中，与B 和8和/或Z的键是经由多个能够作为连接点的反应性官能团建立的。在特定的优选的实施 方案中，将靶向部分与本发明的聚合物的支化点部分共价连接，并且将药物并入到聚集体 的核中，以便形成靶向的药物络合物。在其他的实施方案中，如果靶向部分是细胞表面受体 的激动剂或拮抗剂，那么靶向的聚合物或聚合物聚集体可表现出类似药物的作用，甚至是 在缺少所包封的抗癌药物的情况下。
[0026] 本发明进一步提供了用于制备本文所描述的梳型聚合物、聚集体、和靶向的聚合 物聚集体和药物络合物的方法。本发明的聚合物自组装为聚合物聚集体，该聚合物聚集体 足以体内增溶、分配和递送药物;是无毒性的、生物相容性的并且稳定的；以及能够在它们 的外表面上