旋-2，3-双(正丁氧基)丁烷-1，4-二硫醇
[0199] 实施例7b:内消旋-2，3-双(4-壬基苯基甲氧基)丁烷-1，4-二硫醇
[0200] 实施例7c:内消旋-2，3-双(二苯基-4-甲氧基)丁烷-1，4-二硫醇
[0201 ] 实施例7d: 4，6_双(癸氧基)苯-1，3-二甲硫醇
[0202] 实施例7e:4,5_双(癸氧基)苯_1，2_二甲硫醇
[0203] 实施例7f: 3，4-双(癸氧基)噻吩-2，5-二甲硫醇
[0204]实施例8A:取代的PEG琥珀酸酯
[0205]除了使用2-十二碳烯-1-基琥珀酸酐替代马来酸酐外，遵照实施例1的方法。十二 碳烯基取代基提供了最终的聚合物中的悬垂的C链。
[0206] 通过这一方法，将下列取代的琥珀酸酐用PEG酯化：
[0207]实施例8Aa:异丁烯基琥珀酸酐 [0208] 实施例8Ab:2_辛烯-1-基琥珀酸酐
[0209]实施例8Ac:十八烯基琥珀酸酐 [0210] 实施例8Ad: 3-氧杂二环-己烷-2，4-二酮
[0211] 实施例8Ae:环己烷二羧酸酐
[0212] 实施例8Af:邻苯二甲酸酐
[0213] 实施例8Ag: 4-癸基邻苯二甲酸酐 [0214] 实施例8Ah:六氢甲基邻苯二甲酸酐 [0215]实施例8Ai:四氢邻苯二甲酸酐 [0216]实施例8Aj :降冰片烯二羧酸酐 [0217]实施例8Ak:斑蜜素
[0218]实施例8A1:二环辛烯二羧酸酐
[0219] 实施例8Am:外_3,6_环氧-1，2,3,6_四氢邻苯二甲酸酐
[0220] 实施例8An: S-乙酰基巯基琥珀酸酐
[0221] 实施例8B:具有悬垂的烷基基团的PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚
[0222] 通过实施例1的方法，将如实施例8A和8Aa至8An中的描述所得到的取代的PEG琥珀 酸酯与DTT反应。
[0223] 通过这一方法，将下列二硫醇与如实施例8A和8Aa至8An中的描述所得到的取代的 PEG琥珀酸酯的任何一种反应：
[0224] 实施例8Ba:乙烷_1，2_二硫醇
[0225] 实施例8Bb:丙烷-1，3-二硫醇
[0226] 实施例8Bc: 丁烷_1，4_二硫醇
[0227] 实施例8Bd:戊烷_1，5_二硫醇
[0228] 实施例8Be:己烷-1，6_二硫醇
[0229] 实施例8Bf:l，4_苯二硫醇
[0230] 实施例8Bg: 1，3-苯二硫醇
[0231] 实施例8Bh:l，4_苯二甲硫醇
[0232] 实施例8Bi:l，3_苯二甲硫醇
[0233] 实施例8Bj:l，2_苯二甲硫醇
[0234] 实施例8C:具有悬垂的烷基基团的PEG-二胺共聚物
[0235] 通过实施例6B的方法，将如实施例8A中的描述所得到的取代的PEG琥珀酸酯与1， 4_二氨基丁烷共聚。
[0236] 通过这一方法，将下列二胺与实施例8A和8Aa至8An中的取代的PEG琥珀酸酯的任 何一种共聚：
[0237] 实施例8Ca:2 0-B0C_l，3-二氨基-2-丙醇
[0238] 实施例803:1/，N〃_二(B0C)六亚乙基四胺
[0239] 实施例SCc:^，N"_二(B0C)精胺
[0240] 实施例SCcUY-BOC亚精胺
[0241 ] 实施例SCe:^，，，^/〃-三(B0C)六亚乙基六胺
[0242]实施例8Cf:胍基丁胺 [0243]实施例8Cg:赖氨酸叔丁酯
[0244] 实施例8Ch:l，6_二氨基己烷
[0245] 实施例8Ci:l，4_苯二胺
[0246] 实施例8Cj:l，3_苯二胺
[0247] 实施例8Ck: 1，4-二氨基丁烷-2，3-二醇丙酮化合物
[0248] 实施例9:使用取代的酸的PEG酯交换反应
[0249] PEG二甲苯磺酸酯：在氩气下搅拌的同时向lmol的PEG(溶解于DMF或为熔化的）中 加入2. lmol的甲苯磺酰氯(5 %的摩尔过量）。向反应混合物中加入2.2mo 1的四甲基乙二胺 (TEMED)。之后将反应于45°C孵育2h。用乙酸乙酯、甲苯或乙醇作为TLC溶剂通过TLC分离产 物。可用甲苯从反应混合物中萃取PEG二甲苯磺酸酯。代替甲苯磺酰氯，也可使用其他的磺 酰化剂例如甲磺酰氯(参见实施例4)、三氟甲磺酸酐或三氟代乙烷磺酰氯(参见美国专利申 请 10/397332,公开第 20040006051号）。
[0250] PEG二甲苯磺酸酯的聚酯化:伴随着氩气下的搅拌，向lmol的熔化的PEG二甲苯磺 酸酯中加入lmo 1的S，S'-二癸基-内消旋-2，3-二巯基琥珀酸和2mo 1的TEMED。如维持流动性 所必需的加入DMF。将反应混合物加热至80°C并搅拌24h或直到通过TLC监测完成。
[0251] 实施例10:PEG_二(琥珀酰基)_二-(0_酰化)硫醚中等分子量聚合物(C16-JI-聚合 物B)
[0252]
[0253] 将如实施例1中所制备的PEG-二马来酸酯（10.248,6.1111111〇1)置于干燥的1251111烧 瓶中，并在氩气下加热至70 °C以熔化PEG-二马来酸酯。在搅拌下，向熔化的材料中加入水 (10111〇和溶于水（311^)的01'1'(0.9618,6.168_〇1)和1￡]\^0(0.7238,6.166111111〇1)的溶液。将 溶液于70 °C搅拌约4h。在真空中除去水以约90 %的产率获得固体聚合物。
[0254] 将干燥的聚合物（5g，2.7mmol)在氩气下加热至70_90°C以使其熔化，并且加入 TEMED(0.635g，5.5mmol)。伴随搅拌加入棕榈酰氯（1.689g，5.5mmol)并将混合物在氩气下 搅拌过夜。（可改变聚合物与酰基氯的比例以获得从0-100%的化学计量的取代度。）向反应 混合物加入水以分离"Cl6-JI-聚合物B"。
[0255] 通过这一方法将下列酸用二(琥珀酰基)PEG-DTT共聚物的羟基基团酯化：
[0256] 实施例10a:油酸
[0257] 实施例10b:胆固醇琥珀酸酯
[0258] 实施例10c:二苯基-4-羧酸
[0259] 实施例10d: 4-辛基苯乙酸
[0260] 实施例10e:十六碳-6-炔酸
[0261 ]作为使用酰基卤的替代，Jr-聚合物的DTT来源的羟基基团也可被1，3-双(2，2-二甲 基-1，3-二氧戊环-4-基甲基）碳二亚胺(BDDC)活化并直接与羧酸偶联；参见Handbook of Reagents for Organic Synthesis?Reagents for Glycoside^Nucleotide?and Peptide synthes i s (用于有机合成的试剂、用于糖苷、核苷酸和肽的合成的试剂的手册），David Crich编辑，Wiley，2005第107-108页及其参考文献）。
[0262] 实施例11 :C16-3t-聚合物A的羧基取代的酯.
[0263] 使用标准的肽键形成方法(例如通过碳二亚胺试剂），将羧酸取代的聚合物用于连 接具有反应性氨基基团的配体以将氨基基团连接至聚合物的羧酸官能度。通过以环酐酯化 聚合物羟基基团能容易地获得这些材料。例如通过将马来酸酐与C16-JI-聚合物A羟基基 团如下反应来制备C16-JI-聚合物A二马来酸酯：
[0264] 将C16-JI-聚合物A(2g)和马来酸酐(0.85g)在干燥研钵中研磨并转移到50mL圆底 烧瓶。将烧瓶于90°C在氩气下搅拌加热2-3h。之后将固体反应混合物研磨并用水调成浆，并 将混合物转移至透析袋(3.5kDa截留）。将混合物对水透析以除去过量的马来酸和低分子量 的副产物，并将渗余物从透析袋中取出，于60°C干燥至恒重，以获得C16-JI-聚合物A二马来 酸酯（1.79g)。可改变聚合物A与马来酸酐的比例以获得从0-100%的全化学计量酯化变化 的取代。
[0265] 实施例1 la: C16-JI-聚合物A二甘醇酸酯
[0266] 将C16-JI-聚合物A(2g)和二甘醇酸酐（l.Og)通过上文实施例11的方法反应以得到 C16-JI-聚合物A二甘醇酸酯。如同马来酸酐一样，可改变聚合物A与酸酐的比例以获得从0-100%的全化学计量酯化变化的取代。
[0267] 实施例1 lb: C16-JI-聚合物A双(乌头酸酯）
[0268] 将C16-JI-聚合物A(2g)和乌头酸酐（1.35g)通过上文实施例11的方法反应以得到 C16-JI-聚合物A双(乌头酸酯）。
[0269] 以相似的方式，下列酸酐与C16-JI-聚合物A偶联。当使用低溶解度的酸酐时，作为 对纯化的辅助，可在透析之前将pH调至4.5和6.5之间。如果需要，对0.1 N HC1第二次透析提 供了聚合物的酸性形式。
[0270] 实施例11c:琥珀酸酐 [0271]实施例lid:戊二酸酐 [0272] 实施例lie:邻苯二甲酸酐
[0273] 通过与马来酸酐或顺式乌头酸酐的酯化引入的反应性双键也可被用于将含硫醇 的配体加至聚合物，如下文实施例12中所描述的。
[0274] 实施例12:C16-3t-聚合物A二马来酸酯的半胱氨酸加合物：
[0275]将粉末的C16-JI-聚合物A二马来酸酯（实施例ll)(253mg)加至水(5mL)并且有力地 搅拌混合物。向反应混合物加入半胱氨酸(24mg)和TEMED(30.5ul)，并且于室温在氩气气氛 下搅拌混合物。通过TLC(硅胶板，正丁醇-乙酸-水，3:1:1)使用茚三酮的检测来监测反应的 过程。反应混合物显示出与聚合物共迀移的阳性的茚三酮点。半胱氨酸也产生阳性的茚三 酮点，然而起始聚合物与茚三酮不产生任何颜色。
[0276] 使用具有多个羧基取代基的硫醇，上文所描述的方法被用于引入用作连接点的另 外的羧基基团。例如将巯基琥珀酸加至下列C16-JI-聚合物A二酯：
[0277] 实施例12a:C16-Ji-聚合物A二马来酸酯
[0278] 实施例12b:C16-Ji-聚合物A二丙烯酸酯 [0279]实施例12c :C16-3t-聚合物A(双)乌头酸酯
[0280]
[0281] 实施例12c
[0282] 以相似的方式，3-巯基戊二酸被加至下列C16-JI-聚合物A二酯：
[0283] 实施例12d:C16-Ji-聚合物A马来酸氢酯
[0284] 实施例12e:C16-Ji-聚合物A二丙烯酸酯
[0285] 实施例12f:C16-Ji-聚合物A(双)乌头酸酯
[0286] 3.靶向部分到31-聚合物的连接
[0287] 实施例1:叶酸到C16-JI-聚合物A的连接
[0288] 将叶酸(2mmol)溶于无水DMS0,并与二环己基碳二亚胺(DCC)于环境温度反应以形 成内酐。之后向这一反应混合物加入等摩尔量的盐酸半胱胺和TEMED，并将反应混合物在氩 气下于环境温度搅拌24h，通过TLC监测反应。反应完成后，将反应混合物在真空下过滤以除 去反应副产物。将滤出液用甲醇稀释以沉淀橘黄色产物。将沉淀物用甲醇调成浆并过滤，以 除去残留的二环己脲和DMS0。用El lman试剂，叶酸-半胱胺辄合物（S . Atkinson， J. Biol. Chem.，276(30): 27930-27935)产生自由巯基基团的阳性测试，并且TLC没有显示半 胱胺的存在。
[0289]之后将叶酸-半胱胺辄合物在氩气下与C16-JI-聚合物A的二马来酸酯（实施例11， 由具有约1500分子量的PEG制备）反应。为了保持聚合物聚集体的亲水性，将足以消耗仅 50 %的可用的马来酸酯基团的量的叶酸-半胱胺辄合物加至聚合物。用TEMED将反应混合物 的pH调至6.5-7.5，并且将混合物在氩气气氛下搅拌过夜。之后使用3.5kD截留膜将反应混 合物对水透析以除去任何小分子量副产物和杂质。取出渗余物并将其用于下文描述的药物 包封和细胞培养测定。
[0290]实施例2:表皮生长因子(EGF)到C16-JI-聚合物A的连接
[0291] 将表皮生长因子(Sigma)用溶于pH 7.4的roS-EDTA缓冲液中的2个当量的2-亚氨 基硫烷(Sigma)硫醇化，并将硫醇化的EGF通过实施例1中描述的方法连接到C16-JI-聚合物A 的二马来酸酯。将辄合EGF的聚合物通过超滤纯化并用PBS清洗，并且渗余物被用于制备靶 向的包封聚合物。
[0292] 实施例3:抗-EGFR单克隆抗体到C16-JI-聚合物A的连接
[0293]将为腹水的鼠科的抗EGFR单克隆抗体（Sigma)根据制造商的说明书通过在 AffinityPak?固定蛋白A(Pierce)柱上层析来纯化。在pH 7.4的PBS缓冲液中，通过实施例1 中描述的方法将纯化的抗体硫醇化并辄合至C16-JI-聚合物A的二马来酸酯，并通过超滤纯 化。
[0294] 4.抗癌化合物的包封
[0295] 实施例1:将喜树碱包封在C16-JI-聚合物A中：
[0296] 将喜树碱（10mg，Sigma)溶解于DMS0中并与溶于DMS0的C16-JI-聚合物A(100mg，来 源于PEG 1.5kD)的溶液混合。将凝胶状的混合物超声波约10-30分钟，用水稀释，并离心以 除去任何固体。通过TLC测试澄清的上清液中包封的喜树碱的存在为阳性。
[0297] 实施例2:将多柔比星包封在C16-JI-聚合物A中：
[0298] 将盐酸多柔比星(5mg，Sigma)溶解于水中并用当量的TEMED处理以将盐酸盐转化 为自由胺形式。之后向所得的自由胺形式加入溶于DMS0的C16-JI-聚合物A( 100mg，来源于 PEG 1.5kD)的溶液，并且如上文实施例1中所描述的将混合物加