在约40~45 °C进行，而用十八烷胺，温度是大约55 °C_57 °C。通过TLC观察反 应直到观察到水平不变的剩余的烷基胺，通常在运行过夜之后。
[0113]将反应混合物酸化至从约3.0至约4.5的pH，并且于室温搅拌长达24小时以破坏未 反应的EDC，之后用IN NaOH和/或TEMED滴定至7.0的pH。以约800xg将最终的反应混合物离 心1至3小时以除去固体污染物和副产物。
[0114]离心后，可将上清液在 GPC 柱（ToyopearlTM、SephadexTM、SephacrylTM、Biogel? 以及 类似产品）上层析。然而Jr聚合物是两亲性物质，并且表现出对某些GPC柱填料的亲和力，其 使污染物的去除变得复杂。可选择地，可将聚合物在大孔的疏水相互作用柱（如， T0Y0PEARL? Phenyl 650C，Toshoh Biosciences，Montgomeryville，PA，U.S.A.)上层析，用 溶于水的梯度的甲醇洗脱。优选地，将反应混合物对酸性和中性水的数种变化透析以除去 低分子量的起始材料和反应副产物。
[0115] 还可用丁酮、异丙醇、丁醇或其他极性有机溶剂萃取反应混合物以除去有机杂质， 但显著量的两亲性聚合物损失至萃取溶剂。优选地，使用适当的膜将反应混合物进行超滤 以将产物分成不同的分子量级别，例如5kDa至10kDa、10kDa至30kDa、30kDa至50kDa等，取决 于所使用的滤膜的截留值。可将聚合物的水溶液进行死端式过滤以便产生无菌的或无病毒 的溶液(取决于滤膜或过滤介质的选择）。
[0116] 2. Jr-聚合物的合成
[0117] 实施例1: PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚的中等分子量聚合物(C16-JI-聚合物 A)
[0118] 将聚乙二醇(PEG-1500，Sigma Chemical Co.)在真空下于80°C干燥直到气泡停止 形成(8-12小时，取决于PEG的质量）。干燥的PEG可在氩气下无限期的干燥保存。
[0119] 将干燥的PEG在氩气下于油浴上熔化，并搅拌下逐渐加入马来酸酐(每摩尔PEG 2 摩尔，针对纯度校正）。将混合物在氩气下于90°C搅拌。由于马来酸酐容易升华，将顶端空间 最小化并且将整个反应容器保持在反应温度。任何冷凝在容器壁上的马来酸酐将被刮回反 应混合物。用UV可视化和碘染色，通过硅胶板上的TLC监测反应的过程，分别使用乙醇和己 烷作为溶剂。在马来酸酐消失后将反应持续一小时。
[0120] 将粗制的PEG二马来酸酯用两体积的水稀释。之后搅拌下向反应混合物加入溶于 水(每体积TEMED的2体积水）的二硫苏糖醇(DTT，每当量PEG 1 ? 01当量)和N，N，MY -四甲 基乙二胺(TEMED，1.02当量）的溶液。在氩气下于70 °C搅拌反应2.5小时，置于室温过夜，并 且之后再次于70°C搅拌2小时。通过TLC监测反应并通过DTT的完全消失判定反应完成。
[0121] 向上文的反应混合物加入水以降低粘度直到混合物可被搅拌（以大约25%固体）， 在氩气下于65°C搅拌混合物，并加入N-羟基琥珀酰亚胺(每mol PEG-二马来酸酯-DTT聚合 物中的羧酸基团O.lmol)，之后是十六烷胺(每mol聚合物中的羧酸基团1.05mol)和N-(3-二 甲氨基丙基)-N~乙基碳二亚胺(EDC，每mol聚合物中的羧酸基团0.56mol)。将混合物在氩 气下搅拌1小时并加入第二份EDC(每mo 1聚合物中的羧酸基团0.56mo 1)。另一小时后，进一 步加入第三份EDC(每mol聚合物中的羧酸基团0.28mol，总共每mol羧酸基团1.4mol EDC)以 补充EDC水解的损失。当所加入的固体使悬浮液难以搅拌时，如保持流动性所必需的加入另 外的水，并如所需要的话，通过加入IN NaOH或IN HC1将pH保持在3.5和7.5之间（优选地在 4.5和6.5之间）。在氩气下于65°C将混合物搅拌过夜，并用TLC(硅胶，以乙醇显层)监测直到 烷基胺显示出已经达到稳定的浓度，并且之后是另外4小时的搅拌。（用十二烷胺，反应在约 40-45°C进行，而用十八烷胺，温度优选是55°C_57°C)。之后用IN HC1将反应混合物酸化至 约4.0-4.5的pH，搅拌24h以破坏未反应的EDC，并且通过滴加IN NaOH调整至pH 7.0。
[0122] 将混合物转移至离心瓶并且在台式离心机中于约800xg离心2小时以分离残留固 体。离心后，将反应混合物用异丙醇萃取以除去有机杂质。作为异丙醇萃取的替代方法，超 滤是优选的。
[0123] 通过这一方法，下列氨基化合物被辄合至聚合物：
[0124] 实施例la: ^烷胺
[0125] 实施例lb:十八烷胺
[0126] 实施例lc:4-壬基苄胺
[0127]实施例ld:3-[(4_苯氧基)苯基]丙胺
[0128] 实施例1 e: PEG-二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚(C16-JI-聚合物A，经由路线9替代路 线)。
[0129] 在熔化的条件下，如实施例1所描述的将PEG(1.5kD，如上文所描述的脱气和干燥 的）与过量的马来酸酐(每摩尔PEG多于2.2摩尔当量)反应，并且将反应产物溶于水并用lkD 截留膜对水透析。将渗余物蒸发至接近干燥以产生适用于酰胺化的PEG二马来酸酯。
[0130]在反应瓶中，将溶于最小体积的水的PEG二马来酸酯(每两份PEG二马来酸酯约1份 水)在氩气下加热至70-80°(：。用1￡1^0将口11调整至5.0-5.5。于70-80°(：，向这一溶液加入每 摩尔PEG二马来酸酯重复单元的2摩尔当量十六烷胺。之后缓慢流动加入溶于最小体积的水 中的N-羟基琥珀酰亚胺(每摩尔PEG二马来酸酯2摩尔当量)的溶液，之后是EDC ? HC1的水溶 液(每摩尔PEG二马来酸酯3摩尔当量）。将混合物于70-80°C搅拌直到TLC(硅胶，用EtOH显 层）显示反应的完成（十六烷胺的点不变化或不存在）。将反应混合物冷却并且通过加入乙 酸破坏过量的碳二亚胺直到pH在2.5和3之间保持稳定。将产物通过透析纯化，第一次对 EtOH水溶液之后对水，或者可选择地通过用异丙醇沉淀。
[0131] 将这样形成的PEG二酰胺溶解于水，用TEMED将反应混合物的pH调节至6.5和9之 间，并且将温度升至60-70°C。加入DTT溶液(每摩尔PEG二酰胺1.2摩尔当量），并且将反应混 合物搅拌过夜。用化学计量当量的氯乙酰胺和TEMED消耗过量的硫醇，以产生阴性的 Ellmar/s测试。之后将产物通过对水的透析纯化，并且通过蒸发浓缩渗余物。
[0132] 实施例2 :PEG_二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚高分子量聚合物
[0133] 除了使用每mol马来酸酐0.55mol DTT和0.55mol TEMED之外，遵循实施例1中列出 的步骤。由于粘度快速上升，有力的搅拌是必须的。表明大多数反应在5-10分钟内完成，之 后是当温度升高至55°C至80°C时经过4小时缓慢完成。
[0134] 实施例3 :PEG_二(烷基酰胺基琥珀酰)二硫醚聚合物
[0135]除了每mol聚合物中的羧酸基团使用1.5mol十二烷胺之外，遵循实施例1中列出的 步骤。加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，每mo 1羧酸基团1. Omol)和1，V -羰基二咪唑(CDI，每mo 1 羧酸基团3.Omol)，并且将反应于80°C搅拌4小时并如上文进行后处理。
[0136]通过这一方法，将下列氨基化合物与聚合物辄合：
[0137] 实施例3a: ^烷胺
[0138] 实施例3b:十四烷胺
[0139] 实施例3c:十八烷胺 [0140]实施例3d:脱氢枞胺
[0141] 实施例3e:胆固醇2-氨基乙醚
[0142] 实施例3f: 10-苯氧基癸烷胺
[0143] 实施例3g:癸二酸酰肼
[0144] 实施例3h:油酸酰肼
[0145] 实施例3i:脱氢枞酸酰肼
[0146] 实施例3 j:胆酸酰肼
[0147] 实施例3k:棕榈酸酰肼
[0148] 实施例4: PEG-共聚_(烷基酰胺基琥珀酸酯)聚合物
[0149] 将溶于无水乙醚中的PEG(6.66mmol)和三乙胺(2.32ml，16.65mmol)的溶液在氩气 下于0°C冷却并用甲磺酰氯（1.03 1111，13.32111111〇1)滴加处理。于0°(：持续搅拌111并且之后于室 温持续搅拌2h。将醚蒸发并向残留物中加入无水丙酮（15ml)以便沉淀盐酸三乙胺，将其从 溶液中过滤。将滤出液用溴化锂(2.31 g，26.64mmo 1)处理并加热至回流20h。之后用己烷稀 释混合物并通过由CeliteTM(0.5 Cm)封口的短的二氧化硅柱(3cm)过滤，并用己烷洗脱。将滤 出液干燥、过滤并蒸发以剩余油状的a，《_二溴-PEG。
[0150] 通过Godjoian等人，Tetrahedron Letters，37:433_6(1996)的方法将a，二溴-PEG与一当量的2,2_二丁基-4,5-双（甲氧基羰基）-1，3,2_二氧杂锡杂环戊烷 (dioxastannolane)反应。将所得的酒石酸二甲酯-PEG聚醚用溶于甲醇的K0H阜化，并且之 后用如上文实施例1和3中的十二烷胺或十六烷胺对其酰胺化，或用实施例3a-3k中的胺对 其酰胺化。
[0151] 实施例5: PEG与EDTA双酐共聚
[0152] 通过实施例1中描述的方法将无水PEG与乙二胺四乙酸二酐反应，并且之后用如实 施例1中的十二烷胺或用如实施例3中的十六烷胺或用实施例3a-3k中的胺对其酰胺化。
[0153] 以同样的方法，将下列双酐与PEG共聚并随后对其酰胺化：
[0154] 实施例5a:萘四羧酸双酐
[0155] 实施例5b:茈四羧酸双酐
[0156] 实施例5c:二苯甲酮四羧酸双酐
[0157] 实施例5d:4，f-(六氟异亚丙基)二酞酸酐
[0158] 实施例5e: 丁烧四甲酸双酐
[0159] 实施例5f:双环(2，2，2)辛-7-烯-2，3，5，6-四羧酸双酐
[0160] 实施例5g:二亚乙基四胺五乙酸双酐
[0161] 实施例511:3,4,3/，4/-二苯基砜四羧酸双酐
[0162] 实施例5i: 3，4,3人V-二苯基醚四羧酸双酐
[0163] 实施例5 j:苯均四酸二酐
[0164] 实施例6A:具有悬垂的硫醚的PEG-二胺共聚物
[0165] 用与实施例1中用于DTT的同样的步骤将如实施例1中制备的PEG二马来酸酯与十 二烷硫醇(每当量PEG二马来酸酯二当量)反应。没有聚合发生时，则不必稀释，并且在熔化 的PEG-二马来酸酯中进行反应。加入TEMED催化剂并且之后加入硫醇。使用TLC通过起始材 料的消失来观察反应。可使用直到由于蒸发损失的烷基硫醇变得显著的点的温度(直到约 100°C)。使用稍微过量的烷基硫醇以充分饱和马来酸基团。在反应最后，将过量的烷基硫醇 通过用氮气或氩气喷射和/或在真空中加热来去除，直到通过气味或通过TLC检测不到烷基 硫醇。
[0166] 以此方法，将下列硫醇与PEG二马来酸酯辄合：
[0167] 实施例6Aa:巯基琥珀酸二叔丁酯
[0168] 实施例6Ab:十四烷硫醇
[0169] 实施例6Ac:十六烷硫醇 [0170] 实施例6Ad: 2-巯基乙磺酸
[0171] 实施例6Ae: 3-巯基丙磺酸
[0172] 实施例6Af: 6-巯基己酸叔丁酯 [0173]实施例6Ag: 4-疏基苯甲酸叔丁酯
[0174] 实施例6Ah:巯基乙酸叔丁酯
[0175] 实施例6Ai:4_(叔丁氧基羰基氨基)丁烷硫醇
[0176] 实施例6Aj:3_(叔丁氧基羰基氨基)苄硫醇
[0177] 实施例6Ak: 4-癸基苄硫醇
[0178] 具有反应性官能团的硫醇是适用于连接C链的，和/或反应性官能团可用作靶向部 分的连接点(X)。
[0179] 实施例6B:具有悬垂的硫醚的PEG-二胺共聚物
[0180]
[0181 ]使用与实施例1中用于十二烷胺的同样的步骤将在实施例6A中得到的硫醇加合物 用1，4_二氨基丁烷(每两C00H基团一当量的二胺)酰胺化，同时当对于维持反应混合物的流 动性来说必需时用水稀释。当对于确保完成聚合来说必需时加入另外等份的H)C。通过这一 方法，实施例6A和6Aa到6Ak的硫醇加合物被转化为PEG-二氨基丁烷聚酰胺。
[0182] 通过此方法，可将下列二胺转化为PEG聚酰胺(B0C =叔丁氧基羰基）：
[0183] 实施例6Ba: 2-(0-B0C)_l，3-二氨基-2-丙醇
[0184] 实施例eBbW，N〃_二(B0C)六亚乙基四胺
[0185] 实施例eBc:^，N〃_二(B0C)精胺
[0186] 实施例eBcUN'-BOC亚精胺
[0187] 实施例eBe:^，?/〃-三(B0C)五亚乙基六胺
[0188] 实施例6Bf:胍基丁胺 [0189]实施例6Bg:赖氨酸叔丁酯 [0190] 实施例6Bh:l，6_二氨基己烷
[0191] 实施例6Bi:l，4_苯二胺
[0192] 实施例6Bj:l，3_苯二胺
[0193] 实施例6Bk: 1，4-二氨基丁烷-2，3-二醇丙酮化合物
[0194] 实施例7: PEG-二（烷基琥珀酸酯）二硫醚
[0195]
[0196] 通过S ? Sasaki等人，Chem. Pharm? Bui 1 ? 33( 10): 4247-4266(1985)的步骤的变体制 备DTT的2,3_双-0-十六烷基醚（内消旋_2,3_双(十六烷氧基)丁烷_1，4_二硫醇）。通过实施 例1的方法将其加至PEG-二马来酸酯。
[0197]通过这一方法，将下列醚二硫醇偶联至PEG聚合物：
[0198] 实施例7a:内消