专利名称：肺靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法
技术领域：
本发明涉及肺靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法，具体涉及能稳定表达红色 荧光蛋白(RFP)、具肺靶向转移能力的人肝癌细胞株HCCLM3-R-LM1及其建立方法，属于微 生物动物细胞系技术领域。
背景技术：
原发性肝细胞癌是我国乃至全球的高发恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位列 恶性肿瘤第二位。临床上有多种方法治疗肝癌，如手术切除、TACE、瘤内酒精注射、射频治疗 和放射治疗等，但长期疗效有限。根据复旦大学肝癌研究所对9，800多例肝癌手术患者的 临床长期随访资料统计发现，肝癌患者手术后5年的生存率仍低于50%，其主要死亡原因 为肝癌的复发与转移。临床上肝癌患者常出现肝外淋巴结和肺脏转移，而目前国内外缺乏相应的研究 对象，对肝癌细胞的器官靶向性转移分子机理知之甚少，也缺乏必要的干预手段。为此， 复旦大学肝癌研究所在世界上率先建立了具有自主知识产权和国家专利的裸鼠人肝癌转 移模型(LCI-D20) (Sun FX, et al. Int J Cancer. 1996 ;66 :239_243.)，克隆到了具有高 转移潜能的人肝癌细胞系(MHCC97) (Tian J，et al. Br J Cancer. 1999 ；81 814-821.), 筛选出了具有相同遗传背景的、不同转移潜能的系列肝癌细胞株(MHCC97-H，MHCC97-L) (LiY, et al. World J Gastroenterol. 2001 ；7 630-636.专利号 WO 2003/087766 A3, ZL2003 1 0122611. 5)和高转移特性的人肝细胞癌细胞系HCCLM3和HCCLM6(J Cancer ResClin Oncol. 2004 ；130 :187_196 J Cancer Res Clin Oncol. 2004 ；130 :460_468 ； 中华医学杂志.2004 ；84 675-679 ；Cancer Genet Cytogenet. 2005 ；158 180-183 ； Clin CancerRes. 2006 ；12 :7140_7148)，并进一步发展了 RFP 和 GFP 荧光标记的肝癌 细胞(HCCLM3RFP/GFP，HCCLM6RFP/GFP)和相应的荧光可视肝癌转移模型(Yang Bff, et al. EurJ Gastroenterol Hepatol. 2008 ；20-1077-1084.专利申请号200710045676. 2 ；和 200710045675. 8)。国内外文献中均未见到关于能稳定表达荧光的肺靶向转移性人肝癌细胞株的报道。
发明内容
本发明的目的是提供稳定表达荧光的肺靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法， 更具体的是建立染色体整合型、稳定表达红色荧光蛋白编码基因的、具有肺靶向转移能力 的人肝癌细胞系。本发明以红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R为母细胞，采用裸鼠皮下及肝脏 原位移植瘤模型自发性肺转移筛选，肺转移人肝癌细胞再进行体外克隆扩增纯化的方法， 建立了一种肺靶向转移性人肝癌细胞株(HCCLM3-R-LM1)。已于2010年3月3日保藏，保藏 单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号3644，分类命名肺靶向转移人肝癌细胞株(HCCLM3-R-LM1)。所述红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R参见中国专利200710045676. 2。已于 2010年3月3日保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号3643，分类命名表达红色荧光蛋白的人肝 癌细胞株(HCCLM3-R)。所述裸鼠皮下及肝脏原位移植瘤模型参见中国专利200710045675. 8。本细胞株具有以下生物学特性1、与母细胞具有相同的遗传背景，细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑 制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，均分泌AFP蛋白；2、可稳定表达高强度红色荧光转染的红色荧光蛋白编码基因与中国专利 200710045676. 2中所述具有序列1的红色荧光蛋白RFP相同，经过基因改造，能够有效延缓 荧光淬灭时间，增加荧光表达强度，在激发波长为560nm、发射波长为585nm的条件下，可用 荧光显微镜进行观察；3、遗传性状稳定、可在常规条件下连续传代。4、与母细胞相比，除了具有母细胞所具有的生物学特性以外，还表现出另外两个 特征，其一，比母细胞具有更强的转移能力；其二，与母细胞包含不同靶向转移亚克隆的高 异质性相比，本细胞异质性更低，具有肺靶向转移克隆选择优势，在裸鼠肝脏原位移植后第 2周首先出现肺转移，转移率约为42. 9%，第3周约为85. 7%，至第4周100%出现肺转移， 而腹腔淋巴结转移在第3周开始出现，约57. 1%，第4周约71. 5%，晚期可全身转移。所述的肺靶向转移性人肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，具体步骤为以红 色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R为母细胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，得到皮下肿瘤小 块；建立裸鼠肝脏移植瘤模型，将皮下肿瘤小块植入裸鼠的肝脏表面；42天后，处死裸鼠， 开胸取出完整两肺，将肺转移灶组织碾磨、离心得到细胞沉淀，经培养和逐级克隆，分选获 得肺靶向转移性人肝癌细胞株。本发明以高转移特性肝癌细胞株HCCLM3R为母本细胞，采用裸鼠肝脏原位肿瘤移 植模型(参见申请专利200710045675. 8)中的肺转移灶肝癌细胞作为克隆对象，经体外培 养扩增获得；肺靶向转移人肝癌细胞HCCLM3-R-LM1经裸鼠肝脏原位肿瘤移植模型确认首 先发生肺转移；所获肝癌细胞HCCLM3-R-LM1与母本肝癌细胞HCCLM3R具有相同的遗传背 景；具有表达高强度红色荧光、遗传性状稳定、可连续传代、肺靶向转移克隆选择优势等特 性。本发明获得红色荧光表达的肺靶向转移性人肝癌细胞HCCLM3-R-LM1在体外常规 的二维及三维细胞培养体系中生长良好，可用于肝癌转移尤其是器官靶向转移分子机理的 研究；或作为抗肝癌转移新药疗效判别的效应细胞。此外，还可作为裸鼠皮下接种的肝癌细 胞，用于裸鼠皮下和肝脏原位荧光示踪肝癌模型的建立，为尽早发现裸鼠体内人肝癌器官 靶向转移等生物学行为的变化提供参考，以及为在体抗肿瘤转移新药或其他干预治疗的效 果评估提供便利。本发明在肝癌基础研究及药物临床前期研究中具有广阔的应用前景和潜在的社 会与经济价值。
图1为不同时间节点裸鼠肺中的肝癌细胞转移情况示意图；图2为不同时间节点裸鼠腹腔淋巴结中的肝癌细胞转移情况示意图；
图3为不同时间节点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌细胞转移数量示意图；图4为不同时间节点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌细胞荧光面积示意图。
具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本发明。实施例11、建立HCCLM3R裸鼠皮下移植瘤模型BALB/c nu/nu雄性裸鼠，5_6周龄，体重 15-18克，饲养在无特定病原体的我所裸鼠室中。背部左侧皮下注射体外培养的肝癌高转移 荧光细胞HCCLM3R，剂量为2X107细胞/只，生长4周后无菌取皮下肿瘤，切成Imm3左右的 肿瘤小块、供后续实验。2、建立HCCLM3R裸鼠肝脏移植瘤模型定位裸鼠肝脏、消毒肝脏外皮肤、无菌切开 皮肤暴露小鼠肝脏、用镊子分离肝包膜并划开一个小口，将肿瘤小块植入肝脏表面，缝合肝 包膜和皮肤。3、肺转移性肝癌细胞的获取原位移植瘤生长至第42天，处死裸鼠，开胸取出完 整两肺，观察肺转移灶大小和数目(Leica荧光体视显微镜，IPP软件)，经荧光定位取5_10 个2mm3的肺转移灶组织。4、肺转移性肝癌细胞的克隆和扩增用200目的滤网，将肺转移灶组织碾磨成细 胞悬液，离心(1500rpmX5min)取细胞沉淀。用1 XPBS液洗涤3次后，转移性肝癌细胞重 悬于含10% FBS的DMEM完全培养液中，置37°C、5% CO2孵箱中培养和逐级克隆，直至分选 获得单克隆肝癌细胞，常规液氮保存备用。5、肺靶向转移性人肝癌细胞HCCLM3-R-LM1的功能鉴定制备肺转移性 HCCLM3-R-LM1肝癌细胞裸鼠皮下和肝脏原位移植瘤。每隔一周处死肝癌原位移植瘤的裸 鼠，观察不同时间节点裸鼠肺和淋巴结中的肝癌转移情况。图1和图2分别为不同时间节 点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌细胞转移情况示意图；图3为不同时间节点裸鼠肺和腹腔 淋巴结中的肝癌细胞转移数量示意图；图4为不同时间节点裸鼠肺和腹腔淋巴结中的肝癌 细胞荧光面积示意图。结果表明，本发明所获的肺靶向转移人肝癌细胞HCCLM3-R-LM1经裸鼠肝脏原位 肿瘤移植模型确认首先发生肺转移，随后陆续出现全身其它部位转移；其与母本肝癌细胞 HCCLM3R具有相同的遗传背景；具有表达高强度红色荧光、遗传性状稳定、可连续传代、肺 靶向转移克隆选择优势等特性。经体外长期连续培养发现，红色荧光表达强度高、荧光不易 被淬灭，荧光表达稳定，是较为理想的荧光示踪、器官靶向转移性人肝癌细胞。可在体外二 维及三维细胞培养体系中作为荧光标记的实验细胞，用于肝癌转移的分子机理研究；也可 作为疗效判别细胞用于抗肝癌转移新药的疗效观察；也可作为裸鼠皮下接种的荧光标记肝 癌细胞，用于荧光可视人肺靶向转移性人肝癌裸鼠皮下模型和肝脏原位模型的建立，用于 肝癌转移早期生物学行为的监视，以及在体药物或其他干预治疗效果的评估。
权利要求
一种肺靶向转移性人肝癌细胞株，母细胞为红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R，其特征在于，所述细胞为分类命名肺靶向转移人肝癌细胞株HCCLM3-R-LM1，保藏编号3644，具有以下生物学特性细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，均分泌AFP蛋白，可稳定表达高强度红色荧光，遗传性状稳定、可在常规条件下连续传代、肺靶向转移克隆选择优势，在裸鼠肝脏原位移植后第2周42.9％出现肺转移，第3周有85.7％出现肺转移，第4周达100％，而腹腔淋巴结转移发生率第3周57.1％，第4周为71.5％，晚期可全身转移。
2.如权利要求1所述的肺靶向转移性人肝癌细胞株，其特征在于，所述肺靶向转移性 人肝癌细胞HCCLM3-R-LM1的荧光显微镜观察条件是激发波长560nm，发射波长585nm。
3.权利要求1所述的肺靶向转移性人肝癌细胞株的建立方法，其特征在于，具体步骤 为以红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R为母细胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型，得到皮 下肿瘤小块；建立裸鼠肝脏移植瘤模型，将皮下肿瘤小块植入裸鼠的肝脏表面；42天后，处 死裸鼠，开胸取出完整两肺，将肺转移灶组织碾磨、离心得到细胞沉淀，经培养和逐级克隆， 分选获得肺靶向转移性人肝癌细胞株。
全文摘要
本发明提供了肺靶向转移性人肝癌细胞株及其建立方法。所述的肺靶向转移性人肝癌细胞株，其特征在于，母细胞为红色荧光蛋白表达肝癌细胞HCCLM3-R，所述细胞为分类命名肺靶向转移人肝癌细胞株HCCLM3-R-LM1，保藏编号3644，具有以下生物学特性细胞呈多边形上皮样，贴壁生长，接触性生长抑制丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-58条，均分泌AFP蛋白、肺靶向转移克隆选择优势。所述的建立方法包括采用裸鼠皮下及肝脏原位移植瘤模型自发性肺转移筛选，肺转移人肝癌细胞再进行体外克隆扩增纯化。本发明在肝癌基础研究及药物临床前期研究中具有广阔的应用前景和潜在的社会与经济价值。
文档编号C12R1/91GK101831405SQ20101015328
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月22日 优先权日2010年4月22日
发明者吴伟忠, 孙惠川, 李薇薇, 樊嘉, 汤钊猷, 王鲁, 钦伦秀, 陶中华 申请人:复旦大学附属中山医院