专利名称：一种脑靶向递药系统的制作方法
技术领域：
本发明属药物制剂领域，涉及一种脑靶向递药系统，具体涉及一种脂肪酸介导的 脑靶向递药系统。本递药系统能够跨越血脑屏障，将基因药物、诊断药物递送至脑内，对脑 部疾病进行防治和诊断。
背景技术：
脑部疾病如脑肿瘤、中枢神经系统感染、慢性疼痛、药物成隐性、癫痫、周期性偏头 痛、神经变性疾病、精神分裂症等对人的身体健康影响巨大。但大部分活性药物不能透过 血_脑屏障(BBB)，致使诸多脑内疾病的预防、诊断和治疗存在困难。血-脑屏障是位于血液与脑、脊髓的神经元细胞之间的一种调节界面，对中枢神 经系统(CNS)与外周血液之间物质交换起调节作用。BBB有三层结构内层为脑毛细血管内 皮细胞(BMEC)及其之间的紧密连接，中间为基膜和周细胞，外层为星形胶质细胞和细胞外 基质，其中BMEC及其紧密连接是构成BBB屏障的主要因素。由于BBB和脑脊液屏障(BCSFB) 的存在，使几乎所有大分子药物和98%的治疗、诊断脑部疾病药物无法进入大脑及中枢神 经系统。除了药物本身的脂溶性、相对分子质量和形成氢键的能力等是造成药物难以通过 BBB的原因外，BBB还具有外向通量机制，即通过BBB上的P-糖肽将一些药物从大脑内运 出；此外，BBB上存在的“酶化血脑屏障”，即高活性的神经肽降解酶，如与毛细血管结合的 胺肽酶、内肽酶、血管紧张素转化酶(ACE)等，也使得与肽偶联的药物因代谢不稳定而影响 了对脑部疾病的治疗。BBB既有效保护了脑组织，同时也给药物治疗脑部疾病制造了难以逾 越的屏障。目前，有关克服BBB增加药物脑内递送的方法有按给药方式划分为侵袭性和非 侵袭性两大类。侵袭性的给药方法包括高渗休克、颈动脉注射血管活性物质和直接脑内注 射给药。该方法虽然有效，但可能造成脑部感染、BBB的损伤以及外科性损伤，而且给药方 式复杂，病人顺应性差，不适宜作为常规的治疗和诊断方案。相比而言，非侵袭性给药方法 具有更广阔的临床应用前景。非侵袭性的给药方法主要包括药物的结构修饰、化学传递系 统、载体介导转运、胞吞转运和鼻腔给药系统。前三种方法都需要对药物进行一定的化学修 饰，这对于药物的化学结构、理化性质等要求较高，具有较大的局限性。胞吞转运是利用细胞膜内陷形成有被小窝，胞吞药物或载药系统进入细胞，然后 以胞吐的方式将药物或载药系统排出细胞的一种转运机制，是细胞对较大颗粒、液体和溶 质或大分子复合物吞入吐出的过程，其又分为受体介导胞吞转运和吸附介导的胞吞转运。 受体介导胞吞入脑是利用BBB内皮细胞上有大量的受体，通过克隆得出其对应的特异性抗 体，并以之为药物载体，实现药物的脑内转运。如通过基因工程手段，克隆出BBB内皮细胞 膜上胰岛素受体的单克隆抗体，并以此为药物载体，把不能通过BBB的神经诊断药物和神 经中枢治疗药物输送到脑部，在动物身上已取得成功；利用BBB上新发现的转铁蛋白受体 单克隆抗体(0X26)，把神经生长因子(NGF)连到鼠源性0X26上，实现了神经生长因子的脑 内转运，且已证实了 0X26-NGF复合物对哈丁氏舞蹈病大鼠有良好的治疗效果。该方法的缺点是，免疫原性和动物种属选择性强，应用到人体上时需要通过基因工程技术制备人源化 抗体，制备技术和设备要求高且过程复杂。吸附介导的胞吞转运是利用阳离子修饰的蛋白 (如阳离子白蛋白)通过静电吸附在BBB上(包括腔面侧的唾液酸部分和基膜侧的硫酸肝 素)。这种静电引力能够激发吸附介导的胞吞转运而将蛋白导入脑内。另有报道将NGF与 一种多胺(如腐胺)共价结合后，能够增加NGF穿过大鼠BBB的能力。肉豆蔻酸为含十四个碳原子的饱和脂肪酸，目前已知约有100多个蛋白是肉豆蔻 酸化的，且大多数这些蛋白可以与细胞膜结合，肉豆蔻酸化可为这些蛋白嵌入细胞膜的磷 脂双分子层提供足够的能量。尽管目前还不能确定细胞膜上是否存在肉豆蔻酸受体，但是 大量实验数据表明肉豆蔻酸化有利于蛋白与膜结合，这种结合可以简单解释为(一)肉豆 蔻酸化提高了疏水性，有利于蛋白嵌入磷脂双分子层，每一个CH2单位可以提供0. Skcal/ mol的能量，大约十个CH2单位的能量就可以将其从水相渗入油相；(二)肉豆蔻酸化影响 G糖蛋白受体结合，G糖蛋白α亚单位是G糖蛋白受体的结合部位，其N端含有肉豆蔻酸化 的甘氨酸_棕榈酸半胱氨酸残基。与该亚单位对应的脂肪酸化二肽可以影响M胆碱受体结 合，肉豆蔻酸_甘氨酸丝氨酸二肽可以竞争抑制M1J2胆碱受体；棕榈酸-丝氨酸类似物只 能影响M2受体结合，不影响M1受体结合。聚乙烯亚胺(PEI)为富含N原子的带正电荷的高分子材料，与聚赖氨酸(PLL)J^i 枝状高分子ΡΑΜΑΜ、阳离子脂质体具有类似的性质，可以与DNA、RNA通过静电作用形成纳米 粒，广泛用于基因转染和基因治疗。PEI、PAMAM等可以与细胞膜上带负电荷的毛细管上皮 细胞非特异的结合，广泛用于靶向递药系统的构建，目前已有转铁蛋白-PEG-PAMAM、乳铁蛋 白-PEG-PAMAM脑靶向递药系统的相关报道；叶酸、甲状腺激素、成纤维细胞生长因子也已 用于修饰PEI实现肿瘤、肝等部位的靶向治疗系统的构建。目前国内外未见脂肪酸化修饰 的PEI靶向载体构建的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脑靶向递药系统，具体涉及一种脂肪酸介导的脑靶向 递药系统。本发明构建了一种能够穿透血脑屏障，实现脑内递药的脂肪酸_聚乙烯亚胺递 药系统。本递药系统能通过静脉给药途径将基因药物、诊断药物递送入脑内，发挥预防、治 疗和诊断作用。本发明的脑靶向递药系统，包括介导分子、载体和药物，所述的介导分子为脂肪 酸，聚阳离子大分子作为载体，两者共价结合成纳米粒或胶束，通过包载或吸附方式载 药，能够明显提高药物透过血脑屏障的入脑量。所述的递药系统纳米粒或胶束其粒径为 10-500nm。本发明中，聚阳离子大分子载体选用以下高分子材料制备聚乙烯亚胺(PEI)和聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物(PEG-PEI)，其中PEI为 线性或枝状，优选为枝状，分子量为600-1 OOOOODa，优选10000-30000Da ；PEG分子量为 1000-20000Da,优选分子量2000_5000Da ；上述PTO-PEI的聚乙二醇部分可以是单甲氧
基聚乙二醇，也可以是一端为甲氧基，另一端为其它活性基团的聚乙二醇衍生物，PEI和 PEG-PEI可以单独使用也可以任意比例混合使用；树枝状高分子PAMAM和聚乙二醇-PAMAM共聚物(PEG-PAMAM)，其中PAMAM分子分为G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9代，优选G5-G7代；PEG分子量为1000_20000Da，优选分子量 2000-5000Da ；上述PTO-PAMAM的聚乙二醇部分可以是单甲氧基聚乙二醇，也可以是一端为 甲氧基，另外一端为其它活性基团的聚乙二醇衍生物，PAMAM和PEG-PAMAM可以单独使用也 可以任意比例混合使用；在生理条件下，其它表面具有高密度的正电荷的化合物及其聚乙二醇共聚物。上述的活性基团是马来酰亚胺基、巯基、酰胺基、氨基、羧基、生物素或亲和素中的一种。本发明采用含6-20个碳原子脂肪酸及其衍生物为脑靶向分子，优选含14和16个 碳原子的脂肪酸及其衍生物。本发明中，所述的脂肪酸选自肉豆蔻酸、月桂酸、硬脂酸、辛酸 或/和棕榈酸。在本发明的递药系统中，载药方式是包裹或者静电吸附。本发明所递送的药物可以是诊断药物、基因药物中的一种或几种。其中诊断药物包括核医学诊断试剂，放射治疗药物。基因药物是指含有治疗基因 的质粒DNA。治疗基因包括脑源性神经营养因子基因，用于治疗神经退行疾病，中风和脑 创伤；酪氨酸羟化酶和芳香性氨基酸脱羧酶基因，用于治疗帕金森病；β “葡萄糖醛酸苷酶 基因；氨基己糖苷酶A基因；肿瘤凋亡基因；单纯疱疹病毒胸苷激酶基因；或者是编码表皮 生长因子受体基因的反义RNA ；编码获得性免疫缺陷综合症基因的反义RNA。除治疗基因 外，质粒DNA还包括治疗基因前后的DNA序列，可以是启动子、增强子，促进治疗基因转录的 mRNA蛋白翻译和稳定的DNA序列，能够使游离基因在被转染的细胞中复制的DNA序列。本发明递药系统通过脂肪酸-聚乙烯亚胺脑内递药系统，新吲哚菁绿、罗丹明荧 光标记脑靶向示踪系统，放射性125I标记脑靶向示踪系统进行了活体、离体表征1、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺的荧光标记将肉豆蔻酸酰氯与聚乙烯亚胺置于室温下反应，产物通过凝胶色谱法纯化处理。将6-氨基己酸和新吲哚菁绿(IR820)在碱性条件下85C反应，产物用快速色谱纯 化。将肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺与6-氨基己酸-IR820在碱性条件下室温反应过夜，产 物通过凝胶色谱法纯化处理。2、其它脂肪酸-聚乙烯亚胺的荧光标记分别将月桂酸、棕榈酸酸、硬脂酸、辛酸的酰氯与聚乙烯亚胺置于室温下反应，产 物通过凝胶色谱法纯化处理。后续标记新吲哚菁绿(IR820)和纯化条件同上。3、肉豆蔻酸_聚乙烯亚胺的125I标记将对羟基苯甲酸与肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺室温下反应，产物用凝胶色谱法纯化处理。将对羟基苯甲酸-肉豆蔻酸_聚乙烯亚胺与Na125I溶液在40°C反应5分钟，产物 用凝胶色谱法纯化处理。4、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-DNA纳米粒的制备将鲑鱼精DNA与异硫氰基罗丹明(RITC)在碳酸钠缓冲液中4°C反应，产物用凝胶 色谱法纯化处理。将肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺与RITC-DNA混合，制备得到肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-RITC-DNA纳米粒。5、动物组织分布试验1)肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820利用整体动物荧光成像系统，观察荧光素标记的递药系统在正常大鼠、小鼠体内 的分布情况，并处死小鼠后观察各个脏器内荧光分布情况。小鼠全脑冷冻切片观察递药系 统脑内分布情况。2)月桂酸/棕榈酸/辛酸/硬脂酸-聚乙烯亚胺-IR820利用整体动物荧光成像系统，观察荧光素标记的递药系统在正常小鼠体内的分布 情况，并处死小鼠后观察各个脏器内荧光分布情况。3)肉豆蔻酸_聚乙烯亚胺的125I标记物利用Y闪烁计数仪，观察125I标记的肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺在小鼠脑内分布情况。4)包载DNA的肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺利用整体动物荧光成像系统，观察包载DNA后的脑靶向递药系统正常小鼠脑内分 布情况。结果显示了上述物质在正常小鼠、大鼠体内分布情况，表明本发明的脂肪酸-聚 乙烯亚胺递药系统具有良好的穿透血脑屏障和脑部聚集效果。本发明以静脉注射给药方式实现将药物递送入脑的功能，避免了侵袭性给药方式 潜在的风险和复杂的给药过程；与鼻腔给药途径比较，具有给药量大、给药方式简单、病人 顺应性强等优点。与目前具有脑靶向功能的单克隆抗体、转铁蛋白、乳铁蛋白、阳离子白蛋白、RVG等 多肽脑靶向头基相比，本发明所采用的肉豆蔻酸等脂肪酸具有分子量小、无免疫原性、制备 方法简单、价廉易得等优点。
图 1 :MC-PEI-IR820、PEI-IR820、IR820 小鼠活体组织荧光分布图，其中显示，小鼠尾静脉分别注射PEI-IR820、MC_PEI_IR820、IR820后24小 时，10 %水合氯醛麻醉后的活体荧光成像图，IA为IR820染料，IB为PEI_IR820、1C为 MC-PEI-IR820。图 2 :MC-PEI-IR820、PEI-IR820、IR820 小鼠离体组织荧光分布图，其中显示，小鼠尾静脉分别注射MC-PEI-IR820、PEI-IR820、IR820后24小时， 10%水合氯醛麻醉，生理盐水心脏灌流后小鼠离体各脏器荧光分布图，2A为空白对照、2B 为IR820染料、2C为PEI-IR820、2D为MC-PEI-IR820的组织分布，2E为以上各组脑内荧光 分布图。图3 :MC-PEI-IR820小鼠脑切片荧光分布图，其中显示，小鼠尾静脉注射MC-PEI-IR820后24小时，10%水合氯醛麻醉，生理盐 水、4% PA心脏灌流，脑组织经20%和30%蔗糖PA溶液脱水、固定，冰冻切片后的荧光分布 图。图4 :MC-PEI-IR820、PEI-IR820大鼠活体组织荧光分布图，其中显示，大鼠尾静脉分别注射MC-PEI-IR820、PEI-IR820后24小时，10%水合氯醛麻醉后的活体荧光成像图，4A为PEI-IR820，4B为MC-PEI-IR820。图5 :MC-PEI-IR820、PEI-IR820大鼠离体组织荧光分布图，其中显示，大鼠尾静脉分别注射MC-PEI-IR820、PEI-IR82024小时后，10%水合 氯醛麻醉，生理盐水心脏灌流后大鼠离体各脏器荧光分布图，5A为MC-PEI-IR820、5B为 PEI-IR820的组织分布，5C为以上2组脑内荧光分布图。图6 其它脂肪酸-聚乙烯亚胺-IR820小鼠活体组织荧光分布图其中显示，小鼠尾静脉分别注射SC-PEI-IR820、0C-PEI-IR820、LC-PEI-IR820、 PC-PEI-IR820、MC-PEI1800-IR820后24小时，10%水合氯醛麻醉后的活体荧光成像图，6A 为 SC-PEI-IR820，6B 为 0C-PEI_IR820、6C 为 LC-PEI-IR820，6D PC-PEI_IR820、6E 为 MC-PEI 1800-IR820。图7 其它脂肪酸-聚乙烯亚胺-IR820小鼠脑内荧光分布图其中显示，小鼠尾静脉分别注射SC-PEI-IR820、0C-PEI-IR820、LC-PEI-IR820、 PC-PEI-IR820、MC-PEI1800-IR820 后 0. 5，4，24，48 小时，10%水合氯醛麻醉，生理盐水心 脏灌流后小鼠离体全脑，7A 为 SC-PEI-IR820，7B 为 0C-PEI_IR820、7C 为 LC-PEI-IR820，7D PC-PEI-IR820、7E 为 MC-PEI1800-IR820。图 8 :MC-PEI/RITC-DNA 纳米粒电镜图其中显示，MC-PEI与RITC-DNA形成的纳米粒粒径圆整，平均粒径为330nm。图9 :MC-PEI/RITC-DNA纳米粒脑内荧光分布图其中显示，小鼠尾静脉注射MC-PEI/RITC-DNA纳米粒后24小时，用10%水合氯醛 麻醉小鼠，依次用生理盐水，4 % PA心脏灌流，脑组织经20 %和30 %蔗糖PA溶液中脱水、固 定，冰冻切片后的荧光分布图，9A为全脑RITC-DNA荧光分布图，9B为脑切片RITC-DNA荧光 分布图。图10 :MC-PEI-PHBA-125I小鼠体内组织分布其中显示，小鼠尾静脉注射MC-PEI-PHBA-125I溶液，分别与给药后0. 5、1、2和4小 时用10%水合氯醛麻醉小鼠，心脏灌流生理盐水，取心、肺、肝、脾、肾和脑等脏器或组织，称 重，进行放射性计数，并计算单位重量组织占注射总放射性计数的百分数(ID% /g)。
具体实施例方式通过以下实施例描述将有助于进一步理解本发明，但本发明并不限于如下描述范围。实施例1肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820 (MC_PEI_IR820)的制备1、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺(MC-PEI)的制备精密称取PEI (枝状，分子量为 25000) 0. 9247g (0. 03699mmol)溶于 5mlDMF 中，将 肉豆蔻酸酰氯20ul(0. 07398mmol)溶于ImlDMF中，搅拌状态下逐滴加入到PEI的DMF溶 液中，室温下磁力搅拌反应3小时，得到白色混悬液。离心后丢弃沉淀，上清液加入冷乙醚 IOOml沉淀处理，离心后丢弃上清液，沉淀再用冷乙醚洗涤3次，IOml/次。真空干燥24小 时，产物用少量双蒸水(dH20)溶解，上G-25凝胶柱以dH20洗脱，收集相应组分，冷冻干燥， 得到MC-PEI。核磁氢谱结果表明该化合物在2. 5-3. Oppm之间有聚乙烯亚胺的特征峰，而 且在1. 3-1. 4ppm之间有肉豆蔻酸的特征峰，MC-PEI得到确认。
2、6_氨基己酸-新吲哚菁绿(IR820)的制备精密称取IR820100mg(0. 177mmol)溶于5mlDMF中，加入6-氨基己酸 46. 4mg(0. 354mmol)，TFA(0. 354mmol)，氮气保护下85°C反应3小时，溶液由绿变蓝。反应 液用快速色谱纯化处理，乙酸乙酯/甲醇(70/30到0/100)梯度洗脱，收集相应组分。真空 干燥24小时，产物用少量dH20溶解，冷冻干燥得到6-氨基己酸-IR820。3、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820(MC-PEI-IR820)的制备精密称取EDC · HCL (4. 32mg，0. 023mmol)加到 6-氨基己酸 _IR820(19mg， 0. 020mmol)的无水DMF(2ml)溶液中，氮气保护下逐滴加入到MC-PEI (84mg,0. 0037mmol) 的无水DMF(5ml)中，室温下避光反应18小时，小心吸掉上清液，沉淀用冰乙醚洗涤3次， IOml/次。真空干燥24小时，产物用少量dH20溶解，上G-25凝胶柱以dH20洗脱，收集相应 组分，冷冻干燥，得到MC-PEI-IR820。核磁氢谱结果表明该化合物在2. 5-3. Oppm之间有 聚乙烯亚胺的特征峰，在1. 3-1. 4ppm之间有肉豆蔻酸的特征峰，而且在2. 1-2. 2ppm出现了 IR820的特征峰，MC-PEI-IR820得到确认。4、聚乙烯亚胺-IR820(PEI_IR820)的制备聚乙烯亚胺-IR820 (PEI-IR820)的制备同肉豆蔻酸-聚乙烯亚 胺-IR820 (MC-PEI-IR820)的制备方法。实施例2其它脂肪酸-聚乙烯亚胺-IR820的制备月桂酸-聚乙烯亚胺-IR820(LC-PEI-IR820)制备方法同实施例1.棕榈酸-聚乙烯亚胺-IR820 (PC_PEI_IR820)制备方法同实施例1。硬脂酸-聚乙烯亚胺-IR820(SC-PEI_IR820)制备方法同实施例1。辛酸-聚乙烯亚胺-IR820(0C-PEI_IR820)制备方法同实施例1。肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺1800-IR820(MC-PEI1800-IR820)制备方法同实施例1。实施例3肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820 (MC-PEI-IR820)脑内递药系统动物试验1、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820小鼠活体组织分布分别精密称取肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820和聚乙烯亚胺-IR820适量，用生理 盐水溶解配制成lmg/ml的溶液，小鼠尾静脉注射IOOul/只，分别于给药后6、12、24和48 小时用10%水合氯醛麻醉小鼠，在活体动物成像系统内观察小鼠体内荧光分布。由分布图 可以看出，MC-PEI-IR820在小鼠脑内有明显荧光分布，而IR820和PEI-IR820在脑内没有 荧光分布，提示MC-PEI-IR820可以通过MC介导穿透血脑屏障入脑(图1)。2、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820小鼠离体组织分布分别精密称取肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820和聚乙烯亚胺-IR820适量，用生理 盐水溶解配制成lmg/ml的溶液，小鼠尾静脉注射IOOul/只，分别于给药后6、12、24和48 小时用10%水合氯醛麻醉小鼠，心脏灌流生理盐水IOOml/只，取心、肺、肝、脾、肾和脑等脏 器置于活体动物成像系统内观察。各脏器荧光分布结果显示MC-PEI-IR820在小鼠脑内有 明显荧光分布，提示MC-PEI-IR820可以通过MC介导穿透血脑屏障入脑(图2)。3、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820小鼠脑内分布精密称取肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820适量，用生理盐水溶解配制成lmg/ml的 溶液，小鼠尾静脉注射IOOul/只，分别于给药后6、12、24和48小时用10%水合氯醛麻醉小鼠，依次用生理盐水(100ml/只)、4%PA(100ml/只)心脏灌流，取全脑，PBS漂洗，依次置 于20%和30%蔗糖PA溶液中脱水、固定，冰冻切片，用磷酸甘油封片，放置在活体动物成像 系统内观察脑内各部位的荧光分布情况。结果显示，鼠小脑、中脑、大脑内均有荧光分布，进 一步确认了 MC-PEI-IR820可以穿透血脑屏障入脑(图3)。4、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820大鼠活体组织分布精密称取肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820适量，用生理盐水溶解配制成lmg/ml的 溶液，大鼠尾静脉注射300ul/只，分别于给药后12、24小时用10%水合氯醛麻醉大鼠，在活 体动物成像系统内观察小鼠体内荧光分布。由分布图可以看出，MC-PEI-IR820在大鼠脑内 有明显荧光分布，而PEI-IR820在脑内没有荧光分布，提示MC-PEI-IR820可以通过MC介导 穿透血脑屏障入脑(图4)。5、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820大鼠离体组织分布精密称取肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-IR820适量，用生理盐水溶解配制成lmg/ml的 溶液，大鼠尾静脉注射300ul/只，分别于给药后12、24小时用10%水合氯醛麻醉大鼠，心脏 灌流生理盐水IOOml/只，取心、肺、肝、脾、肾和脑等脏器置于活体动物成像系统内观察。各 脏器荧光分布结果，MC-PEI-IR820在大鼠脑内有明显荧光分布，表明MC-PEI-IR820可以通 过MC介导穿透血脑屏障入脑(图5)。实施例4其它脂肪酸-聚乙烯亚胺-IR820脑内递药系统的动物试验1、其它脂肪酸-聚乙烯亚胺-IR820小鼠活体组织分布分别精密称取其它脂肪酸_聚乙烯亚胺-IR820适量，用生理盐水溶解配制成Img/ ml的溶液，小鼠尾静脉注射IOOul/只，分别于给药后6、12、24和48小时用10%水合氯醛 麻醉小鼠，在活体动物成像系统内观察小鼠体内荧光分布。由分布图可以看出，所述各脂肪 酸-聚乙烯亚胺-IR820在小鼠脑内有明显荧光分布，提示聚乙烯亚胺可以通过脂肪酸修饰 穿透血脑屏障入脑(图6)。2、其它脂肪酸-聚乙烯亚胺-IR820小鼠脑内分布分别精密称取其它脂肪酸_聚乙烯亚胺-IR820适量，用生理盐水溶解配制成Img/ ml的溶液，小鼠尾静脉注射IOOul/只，分别于给药后6、12、24和48小时用10%水合氯醛 麻醉小鼠，心脏灌流生理盐水100ml/只，剥离全脑器置于活体动物成像系统内观察。荧光 分布结果显示，各脂肪酸-聚乙烯亚胺-IR820在给药后0. 5-48小时内小鼠脑内均有明显 荧光分布，提示聚乙烯亚胺可以通过脂肪酸修饰穿透血脑屏障入脑(图7)。实施例5肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺包载DNA的脑内递药系统(MC-PEI/RITC-DNA)动物试验1、罗丹明标记DNA的制备精密称取BDNF/⑶NF IOmg溶解在0. 2M的碳酸钠缓冲液IOml中(ρΗ9· 7)，加入 RITC 10mg，4°C反应12小时，反应液上G-25凝胶柱以dH20洗脱，收集相应组分，用70%乙 醇沉淀DNA，得到RITC-DNA，避光保存。2、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺/RITC-DNA纳米粒(MC-PEI/RITC-DNA)的制备将MC-PEI和RITC-DNA分别配成lmg/ml的溶液，精密吸取40ug MC-PEI，逐滴加入 到25ug RITC-DNA溶液中，吹打均勻，制备得到MC-PEI/RITC-DNA纳米粒。取制备得到的MC-PEI/RITC-DNA纳米粒，用电子显微镜观察纳米粒。纳米粒外观圆整、光滑，平均粒径330nm左右(图8)。3、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺/RITC-DNA纳米粒的小鼠脑内分布试验小鼠尾静脉注射MC-PEI/RITC-DNA纳米粒IOOul/只，给药后24小时用10%水合 氯醛麻醉小鼠，依次用生理盐水(100ml/只)、4% PAdOOml/只)心脏灌流，取全脑，PBS漂 洗，依次置于20%和30%蔗糖PA溶液中脱水、固定，冰冻切片，用磷酸甘油封片，放置在活 体动物成像系统内观察脑内各部位的荧光分布情况。结果可见，MC-PEI可以递送DNA穿透 血脑屏障入脑，且小鼠小脑、中脑、大脑内均有RITC-DNA荧光分布(图9)。实施例6肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺125I标记物的小鼠体内分布试验1、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-对羟基苯甲酸(mc-pei-phba)的制备精密称取对羟基苯甲酸7. 5mg，溶于2ml DMF中，加入EDC · HCL 9mg，逐滴加入到 MC-PEI (84mg)的2ml DMF中，氮气保护下，室温反应12小时，小心吸掉上清液，沉淀用冷乙 醚洗涤3次，IOml/次。真空干燥24小时，产物用少量dH20溶解，上G-25凝胶柱以dH20洗脱， 收集相应组分，冷冻干燥，得到MC-PEI-PHBA。核磁氢谱结果表明该化合物在2. 5-3. Oppm 之间有聚乙烯亚胺的特征峰，在1. 3-1. 4ppm之间有肉豆蔻酸的特征峰，而且在6. 8-7. 8ppm 出现了对羟基苯甲酸的特征峰，MC-PEI-PHBA得到确认。2、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-对羟基苯甲酸的125I标记(MC-PEI-PHBA-125I)MC-PEI-PHBA(35ug/ul)50ul JnANa125I 1. 52mCi，40°C水浴反应 5 分钟，G-25 凝 胶柱纯化，HPLC梯度洗脱，C-18色谱柱检测，标记率为100%，产品活度为1. 45mCi。3、1251标记的肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-对羟基苯甲酸小鼠体内分布试验小鼠尾静脉注射MC-PEI-PHBA-125〗溶液 IOOul/ 只(0. 7657uCi/ul，1. Oug/uL)，分 别于给药后0. 5、1、2和4小时用10%水合氯醛麻醉小鼠，心脏灌流生理盐水IOOml/只，取 心、肺、肝、脾、肾和脑等脏器或组织，称重，测定放射性计数，并计算单位重量组织占注射总 放射性计数的百分数(ID% /g)。组织分布结果显示，MC-PEi-PHBA-125I在脑内有一定的富 集(图10)。实施例7钆标记肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺的制备1、肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺-二乙三胺五醋酸(MC-PEI-DTPA)的制备精密称取MC-PEI181mg，溶于2毫升DMF中，滴加到含有异硫氰基取代的二乙三胺 五醋酸(SCN-DTPA) 20毫克的2毫升DMF溶液中，搅拌反应12小时，将乳白色反应液离心， 沉淀留用，上清液加乙醚沉淀，合并两次沉淀，真空干燥除尽乙醚，加适量水冷冻干燥。2、钆标记的肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺(MC-PEI-DTPA-Gd)的制备精密称取MC-PEI-DTPA100毫克，溶于适量水中，加入14. 5毫克三氧化二钆，用 稀盐酸调节PH(3-4)，搅拌反应三十分钟，反应液上葡聚糖凝胶G25色谱柱，纯化，得到 Gd-MC-PEI。实施例8异硫氰酸荧光素标记肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺(MC-PEI-FITC)的制备精密称取MC-PEI250毫克，溶于3毫升0. OlMPBS中，搅拌下滴加入含有4毫克异 硫氰酸荧光素(FITC)的DMSO溶液，搅拌反应2小时，反应液葡聚糖凝胶G25色谱柱纯化， 得到 FITC-MC-PEI。异硫氰酸罗丹明标记肉豆蔻酸-聚乙烯亚胺(MC-PEI-RITC)的制备精密称取MC-PEI250毫克，溶于3毫升0. OlMPBS中，搅拌下滴加入含有4毫克异硫氰酸荧光素(RITC)的DMSO溶液，搅拌反应2小时，反应液葡聚糖凝胶G25色谱柱纯化， 得到 MC-PEI-RITC。实施例9肉豆蔻酸-PAMAM-(MC-PAMAM)的制备精密称取PAMAM (G5) 0. 5g溶于5mlDMF中，将肉豆蔻酸酰氯20ul溶于ImlDMF中，搅 拌状态下逐滴加入到PAMAM的DMF溶液中，室温下磁力搅拌反应3小时，得到白色混悬液。 离心后丢弃沉淀，上清液加入冷乙醚IOOml沉淀处理，离心后丢弃上清液，沉淀再用冷乙醚 洗涤3次，IOml/次。真空干燥24小时，产物用少量双蒸水(dH20)溶解，上G-25凝胶柱以 dH20洗脱，收集相应组分，冷冻干燥，得到MC-PAMAM。
权利要求
一种脑靶向递药系统，其特征在于，其包括介导分子、载体和药物，所述的介导分子为脂肪酸，聚阳离子大分子作为载体，两者共价结合成纳米粒或胶束，包载或吸附载药。
2.按权利要求1所述的脑内递药系统，其特征在于所述的介导分子为介导脑靶向分子。
3.按权利要求1所述的脑内递药系统，其特征在于所述的脂肪酸选自肉豆蔻酸、月桂 酸、硬脂酸、辛酸或/和棕榈酸。
4.按权利要求1所述的脑内递药系统，其特征在于所述的聚阳离子大分子载体选自 聚乙烯亚胺类化合物及其衍生物、聚乙烯亚胺-聚乙二醇共聚物的衍生物、树枝状大分子 PAMAM及其衍生物或/和PAMAM-聚7 二醇共聚物的衍生物。
5.按权利要求4所述的脑内递药系统，其特征在于所述的聚乙烯亚胺类化合物及其衍 生物是线性或枝状。
6.按权利要求4所述的脑内递药系统，其特征在于所述的聚乙烯亚胺_聚乙二醇共聚 物的衍生物、PAMAM-聚乙二醇共聚物的衍生物中的聚乙二醇部分是单甲氧醚聚乙二醇，或 是带有其它功能基团的聚乙二醇衍生物。
7.按权利要求6所述的脑内递药系统，其特征在于所述的功能基团是马来酰亚胺基、 巯基、酰胺基、氨基、羧基、生物素或亲和素中的一种。
8.按权利要求4所述的脑内递药系统，其特征在于所述的聚乙烯亚胺_聚乙二醇共聚 物的衍生物是二乙三胺五醋酸-聚乙烯亚胺-聚乙二醇共聚物；PAMAM-聚乙二醇共聚物的 衍生物是二乙三胺五醋酸-PAMAM-聚乙二醇共聚物。
9.按权利要求1所述的脑内递药系统，其特征在于所述的递药系统纳米粒或胶束其粒 径为 10-500nm。
10.按权利要求1所述的脑内递药系统，其特征在于所述的递药系统所包载或吸附的 药物是基因药物或诊断药物。
11.按权利要求10所述的脑内递药系统，其特征在于所述的基因药物选自脑源性神经 营养因子或胶质细胞源性神经营养因子。
12.按权利要求10所述的脑内递药系统，其特征在于所述的诊断药物选自金属离子 钆、异硫氰酸荧光素或异硫氰酸罗丹明。
13.按权利要求1所述的脑内递药系统，其特征在于所述的递药系统中的共价结合是 直接共价结合，或以聚乙二醇桥连共价结合。
14.按权利要求3或4所述的脑内递药系统，其特征在于所述的递药系统中的脂肪酸与 聚阳离子大分子载体任意两两共价结合。
全文摘要
本发明属药物制剂领域，涉及一种脑靶向递药系统，包括介导分子、载体和药物，所述的介导分子为脂肪酸，聚阳离子大分子作为载体，两者共价结合成纳米粒或胶束，通过包载或吸附方式载药。本发明通过脑靶向示踪系统进行了活体、离体表征，结果表明能够明显提高药物透过血脑屏障的入脑量，能够跨越血脑屏障，将基因药物、诊断药物递送至脑内，对脑部疾病进行防治和诊断。本发明能避免侵袭性给药方式潜在的风险和复杂的给药过程，且分子量小、无免疫原性；与鼻腔给药途径比较，具有给药量大、给药方式简单、病人顺应性强等优点。
文档编号A61K47/32GK101897669SQ200910051970
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月25日 优先权日2009年5月25日
发明者余梅, 孟庆刚, 李瑾, 谢操, 陆伟跃, 顾炳 申请人:复旦大学