专利名称：：酵母浓度和存活率的测定的制作方法
技术领域：
：本发明一般地涉及分析酵母存活率。更具体地，本发明涉及用于获取和测定酵母细胞的存活率和浓度的高效的和有效的方法和组合物。
背景技术：
：在过去的二十到三十年间，生物燃料的开发和生产取得了显著的增长。随着化石燃料的持续消耗和对全球气候变暧的日益关注，在巴西、美国和许多其他欧洲国家已引入大规模生物燃料生产以促进可再生能源的更替。目前，最大的生物燃料工艺严重依赖于乙醇生产，其米用面包酵母、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，对甘鹿、玉米粉、多糖和废水进行发酵。由于其高乙醇耐受性、最终乙醇浓度、葡萄糖转化率以及工业发酵的历史可靠性，酵母是用于生物乙醇生产的理想成分。(Antoni等人，“Biofuelfrommicrobes”，AppliedMicrobiologyBiotechnology，第77卷，第23-35页，2007年;Vertes等人，“TechnologicalOptionsforBiologicalFuelEthanol，，，JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology，第15卷，第16-30页，2008年；Basso等人，“YeastselectionforfuelethanolproductioninBrazil，，FEMSYeastResearch，第8卷，第1155-1163页，2008年；Nikoli6等人，“EffectofdifferentfermentationparametersonbioethanolproductionfromcornmealhydrolyzatesbyfreeandimmobilizedcellsofSaccharomycescerevisiaevar.ellipsoideus，，，JournalofChemicalTechnologicalBiotechnology，第84卷，第497-503页，2009年；Gibbons等人，“Integratedbiorefinerieswithengineeredmicrobesandhigh-valueco-productsforprofitablebiofuelsproduction，，，InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant，第45卷，第218-228页，2009年；Hu等人，“GeneticDissectionofEthanolToleranceintheBuddingYeastSaccharomycescerevisiae，，，Genetics，第175卷，第1479-1487页，2007年；Argueso等人，“GenomestructureofaSaccharomycescerevisiaestrainwidelyusedinbioethanolproduction，，，GenomeResearch，第19卷，第2258-2270页，2009年；Ekst`een等人，“StarchFermentationbyRecombinantSaccharomycescerevisiaeStrainsExpressingthea-AmylaseandGlucoamylaseGenesFromLipomycesKononenkoaeandSaccharomycopsisfibuligera，，，BiotechnologyandBioengineering，第84卷，第639-646页，2003年。)在美国，标准的基于酵母的发酵工艺利用从玉米淀粉中提取的葡萄糖。对玉米(整株植物，包括玉米粒)进行干式研磨处理，并与a-淀粉酶一起在pH6下加热至100°C。醪液(mash)与葡糖淀粉酶一起在pH4.5下冷却到65°C，以将淀粉降解为葡萄糖，其然后可能用野生型面包酵母消化。然后将最终的组合物冷却至32°C并转移到发酵罐中，向其中添加酵母以启动乙醇生产。通常，整个发酵过程需要约48-72小时，以达到10-12%的最终乙醇浓度。所添加的酵母的浓度和存活率是获得最大量乙醇产生的关键因素。因此，用于测定酵母浓度和存活率的方法对于提供一致的乙醇产出是非常重要的。有几种用于测定纯酵母样品的浓度和存活率的方法，如使用手动细胞计数器的光学和焚光显微镜术和流式细胞术。(Trevors等人，“AComparisonofMethodsforAssessingYeastViability，，，BiotechnologyLetters，第5卷，第131-134页，1983年；Hernlem等人，“DualFluorochromeFlowCytometricAssessmentofYeastViability,”CurrentMicrobiology,在线出版，2010年；Chang等人，“Flowcytometricquantitationofyeastanoveltechniqueforuseinanimalmodelworkandinvitroimmunologicassays，，，JournalofImmunologicalMethods，第211卷，第51-63页，1998年；Deere等人，“FlowCytometryandCellSortingforYeastViabilityAssessmentandCellSelection，”Yeast，第14卷，第147-160页，1998年；Bouchez等人，“PhysiologicalSignificanceoftheCytometricDistributionofFluorescentYeastsAfterViabilityStaining，，，BiotechnologyandBioengineering，第86卷，第520-530页，2004年；Malacrin0等人，“Rapiddetectionofviableyeastsandbacteriainwinebyflowcytometry，，，JournalofMicrobiologicalMethods，第45卷，第127-134页，2001年。)手动细胞计数器成本低廉，但繁琐且容易出现人为错误，从而导致大的不一致性。(Ng等人，“TheChallengetoMeasureCellProliferationinTwoandThreeDimensions，，，TissueEngineering，第11卷，第182-191页，2005年；Szabo等人，“EvaluationofanAutomatedInstrumentforViabilityandConcentrationMeasurementsofCryopreservedHematopoieticCells，，，LaboratoryHematology,第10卷，第109-111页，2004年。)与之相比，流式细胞术自动釆集数据，但需要用于浓度测定的校准珠(calibrationbeads)，和彻底的清洁程序以防止样品之间的交叉污染。此外，流式细胞术的成本也阻碍了简单且具成本效益的酵母浓度测定方法的开发。(Davey等人，“FlowCytometryandCellSortingofHeterogeneousMicrobialPopulations:theImportanceofSingle-CellAnalyses，，，MicrobiologicalReviews,第60卷，第641-696页，1996年；Michelson，“FlowCytometry:AClinicalTestofPlateletFunction，’’Blood，第87卷，第4925-4936页，1996年。)虽然每种方法都有其缺点，但是荧光检测仍然可以对纯酵母样品提供相对精确的浓度和存活率的测定。(Henry-Stanley等人，“AdaptationofFUN-1andCalcofluorwhitestainstoassesstheabilityofviableandnonviableyeasttoadheretoandbeinternalizedbyculturedmammaliancells，，，JournalofMicrobiologicalMethods，第59卷，第289-292页，2004年；Zandycke等人，“DeterminationofYeastViabilityUsingFluorophores，，，JournalofAmericanSocietyofBrewingChemists，第61卷，第15-22页，2003年；King等人，“EpifluorescentMethodforDetectionofNonviableYeast，”JournalofAmericanSocietyofBrewingChemists，第39卷，第52-54页，1981年；McCaig，“EvaluationoftheFluorescentDye1-AniIino-8-NaphthaleneSulfonicAcidforYeastViabilityDetermination，’’JournalofAmericanSocietyofBrewingChemists，第48卷，第22-25页，1990年；Nikolova等人，“AnOptimisedMethodforInvestigationoftheYeastViabilitybyMeansofFluorescentMicroscopy，，，JournalofCultureCollections，第3卷，第66-71页，2002年；Zhang等人，“QuantificationofSaccharomycescerevisiaeviabilityusingBacLight,，，BiotechnologyLetters,第26卷，第989-992页，2004年；Slater,“RapidNuclearStainingMethodforSaccharomycescerevisiae,”JournalofBacteriology,第126卷，第1339-1341页，1976年;0h等人,“Rapidviabilityassessmentofyeastcellsusingvitalstainingwith2-NBDG,afluorescentderivativeofglucose,，，InternationalJournalofFoodMicrobiology,第76卷，第47-53页，2002年；Lloyd等人，“Vigour,vitalityandviabilityofmicroorganisms,，，FEMSMicrobiologyLetters,第133卷，第1-7页，1995年；Rodriguez-Porrata等人,“Vitalityenhancementoftherehydratedactivedrywineyeast,，，InternationalJournalofFoodMicrobiology，第126卷，第116-122页，2008年。)然而，更重要的是在发酵过程中能准确和高效地测定这些参数，以确保一致的过程。由于杂乱(messy)样品中的残渣会严重干扰使用细胞计数器、流式细胞术和荧光显微镜术的计数方法的一致性的事实，以前的出版物的一个共同特点是所有的测试样品均为脱水的酵母或已经经过纯化。因为玉米醪的残渣会阻止技术人员和流式细胞仪精确地测定浓度和存活率，上述方法将会造成很大的困难。(Abbott等人,“BufferingcapacityofwholecornmashaltersconcentrationsoforganicacidsrequiredtoinhibitgrowthofSaccharomycescerevisiaeandethanolproduction,，，BiotechnologyLetters,第26卷，第1313-1316页，2004年;Devantier等人，“Characterizationofveryhighgravityethanolfermentationofcornmash.Effectofglucoamylasedosage,pre-saccharificationandyeaststrain,”AppliedMicrobiologyandBiotechnology,第68卷，第622-629页，2005年。)先前出版的关于AO和PI的文章在其最佳pH6.5-7.4内使用两种染料，对于对哺乳动物细胞生物学上可行的缓冲液来说，这是最常见的PH值。在明视野(bright-field)方案中，手动和自动两种方法都受到成像视野中的残渣的阻碍，因此一致的测定经常是受限的。由于溶液中残渣的非特异性染色，使用荧光测量来特异性检测杂乱样品中的酵母也遇到了问题。此外，荧光检测会导致较弱的靶细胞信号和大量的玉米醪残渣的非特异性染色。只有通过从玉米醪中分离酵母的费力的过滤过程，才可以有效地利用上述方法。然而，当在其发酵环境中测定时，酵母的浓度和存活率能得到更精确地表示。因此，在杂乱的工业样品测定酵母存活率的需要没有得到满足。在此呈现的本发明描述了使用标准荧光染色剂和调整缓冲液的PH值，用于检测和测定酵母的浓度和存活率的新方法。
发明内容本发明部分基于对用于获得和测定酵母细胞存活率和浓度的高效和有效的方法和组合物的发现。本发明解决了先前方法的缺点，因为可以通过本发明的方法容易并精确地分析实时样品，如包含玉米醪和其他残渣的来自生物燃料植物的样品。因为本发明允许高染色特异性，杂乱的样品可以得到有效地测定。除了玉米醪，甘蔗发酵中的酵母存活率也可以使用该方法进行测定。一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母细胞的浓度的方法。该方法包括:在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用染料对将要测定酵母细胞浓度的样品进行染色；获取经染料染色的样品的荧光图像；分析经染料染色的样品的荧光图像，以确定存活酵母细胞的浓度。另一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。该方法包括:在PH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的荧光图像；获取经第二染料染色的样品的荧光图像；并比较经第一染料染色的样品的荧光图像和经第二染料染色的样品的荧光图像以确定酵母存活率。又一方面，本发明一般地涉及用于测定存活酵母细胞的浓度的方法。该方法包括:在PH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像；获取经第二染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像；并分析该经第一染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像和该经第二染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像以确定样品中的存活酵母细胞的浓度。又一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母存活率的方法。该方法包括:在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；比较该经第一染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中活酵母细胞的特征；获取经第二染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；并比较该经第二染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中不存活的酵母细胞的特征。该方法可进一步包括确定存活酵母细胞的浓度。又一方面，本发明一般地涉及用于测定存活酵母细胞的浓度的方法。该方法包括:在PH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；获取经第二染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；并确定样品中的存活酵母细胞的浓度。又一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母存活率的方法。该方法包括:在pH为约10.5至约12.5的缓冲液条件下，用吖啶橙对将要测定酵母存活率的样品进行染色；通过将明视野光束指向样品获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态明视野图像；通过将激发光束指向样品获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态荧光图像；比较该经吖啶橙染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中的存活酵母的特征；在约10.5至约12.5的pH的缓冲液条件下，用碘化丙锭对将要测定酵母存活率的样品进行染色；通过将明视野光束指向样品获取经碘化丙锭染色的样品的至少一幅静态明视野图像；通过将激发光束指向样品获取经碘化丙锭染色的样品的至少一幅静态荧光图像；比较该经碘化丙锭染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中不存活的酵母的特征；并确定该样品的酵母存活率。这里给出的附图是一系列严格的荧光成像分析实验，用以发现用来直接从发酵罐中测定酵母存活率的工作模型，其中荧光试剂并不在优化条件的正常范围内。图1显示了在不同浓度下的一系列4种UV激发的染料，其中比较了酵母的荧光信号。图2显示了在不同浓度下的2种蓝光激发的染料，其中比较了酵母的荧光信号。图3显示了在不同浓度下的2种绿光激发的染料，其中比较了酵母的荧光信号。图4显示了对纯酵母样品使用SYTO9(活的)和碘化丙锭(不存活的)染色剂的明视野图像(左)、存活酵母(右)和不存活的酵母(下)的实例。图5显示了吖啶橙或SYTO9对玉米醪样品中的酵母的活细胞染色的荧光图像的实例，其中显示来自玉米醪残渣的大的非特异性荧光信号。图6显示了pH7-pH9的玉米醪中的酵母的一系列荧光图像，其中玉米醪仍然显示非特异性信号。图7显示了pH10-pH11.50的玉米醪中的酵母的一系列荧光图像，其中去除了玉米醪的非特异性信号。图8显示了在高pH水平下对碘化丙锭的一系列浓度调整，其中也消除了玉米醪的信号。图9显示了来自正在运行的发酵罐的真实发酵酵母样品的2个实例，其中使用所发现的荧光检测方法来清楚地区分玉米醪中存活的和不存活的酵母。图10显示了来自正在运行的发酵罐的真实发酵酵母样品的2个实例，其中使用所发现的荧光检测方法来清楚地区分玉米醪中存活的和不存活的酵母。图11显示了7个不同阶段的发酵样品的一系列荧光图像。图12显示了本发明和手动计数方法两者的(a)浓度和(b)存活率相对于发酵持续时间的图。(C)该图显示发酵样品中的酵母的存活率与乙醇含量的百分比之间的关系。图13显示了玉米醪样品中的酵母的吖啶橙的非特异性弱荧光信号的实例和碘化丙锭的非特异性信号的实例。图14显示了主要与本发明结合使用以测定玉米醪中的酵母存活率的Cellometer(NexcelomBioscience)的图。图15显示了相对于不同缓冲液而言(a)吖啶橙和(b)碘化丙锭的信背比(signal-to-backgroundratio)的图。该方法在超过5小时的孵育期(c)是稳定的。图16显示了针对不同浓度的(a)吖啶橙和(b)碘化丙锭的信背比的图。具体实施例方式本发明解决了先前方法的缺点，因为可以通过本发明的方法容易并精确地分析实时样品，如包含玉米醪和其他残渣的来自生物燃料植物的样品。因为本发明允许高染色特异性，杂乱的样品可以得到有效地测定。因此，本发明在部分基于用于获得和测定酵母细胞的存活率和浓度的高效和有效的方法和组合物的发现。近来，NexcelomBioscience(Lawrence,MA)开发了一种新型的成像细胞计数方法，该方法允许使用仅需要20Ul样品的廉价的一次性计数室快速测定细胞浓度。(Lai等人，“IntratumoralEpidermalGrowthFactorReceptorAntisenseDNATherapyinHeadandNeckCancer:FirstHumanApplicationandPotentialAntitumorMechanisms,，，JournalofClinicalOncology,第27卷，第1235-1242页，2009年3月；Nott等人，“GenomicResponsesfromtheEstrogen-responsiveElement-dependentSignalingPathwayMediatedbyEstrogenReceptoralphaAreRequiredtoElicitCellularAlterations,，，JournalofBiologicalChemistry,第284卷,第15277-15288页，2009年5月;Qiao等人,“ThiolOxidativeStressInducedbyMetabolicDisordersAmplifiesMacrophageChemotacticResponsesandAcceleratesAtherogenesisandKidneyInjuryinLDLReceptor-DeficientMice,，，ArteriosclerosisThrombosisandVascularBiology,第29卷，第1779-U139页，2009年11月；Rounbehler等人，“TargetingOrnithineDecarboxylaseImpairsDevelopmentofMYCN-AmplifiedNeuroblastoma,，，CancerResearch,第69卷，第547-553页，2009年I月；Shanks等人，“QuantitativePCRforGeneticMarkersofHumanFecalPollution,，，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,第75卷，第5507-5513页，2009年9月；Stengel等人，“IdentificationandCharacterizationofNesfatin-1ImmunoreactivityinEndocrineCellTypesoftheRatGastricOxynticMucosa,，，Endocrinology,第150卷，第232-238页，2009年I月。)利用明视野和荧光成像的结合，该系统可以自动采集细胞图像，并使用用于精确和一致地测定多种细胞类型的细胞群体和存活率的新型计数算法进行处理。以前已经报道了下述应用，例如对免疫细胞、癌细胞、干细胞、昆虫细胞、脂肪细胞、肝细胞、血小板、藻类细胞和异质细胞的列举、GFP转染的定量、使用台盼蓝或碘化丙锭测定存活率、测量全血中的白细胞的应用。更重要的是，已证明该方法在生物燃料、饮料和烘焙业中产生了用于质量控制目的的、一致的纯酵母的浓度和存活率测定。(NexcelomBioscience,“Simpe,FastandConsistentDeterminationofYeastViabilityusingOxonoI,，，ApplicationFocus:CellometerVision10X,第1-2页。)本文公开了米用CellometerVision(NexcelomBioscience)测定来自正在运行的发酵罐的玉米醪中的酵母浓度和存活率的新型成像荧光细胞计数法。使用本发明的稀释缓冲液并用吖啶橙(AO)和碘化丙锭(PI)对样品进行染色，选择性地标记了存活的和不存活的酵母，同时消除了来自玉米醪的非特异性荧光信号。该方法使用直接来自加工中的发酵罐的样品，不需要进一步的过滤处理，可以高效地进行酵母质量控制，在美国过滤处理对监测稳定的生物乙醇生产可能具有显著的影响。除了玉米醪，甘蔗发酵中的酵母存活率也可以使用该方法测定。`一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母细胞的浓度的方法。该方法包括:在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用染料对将要测定酵母细胞浓度的样品进行染色；获取经染料染色的样品的荧光图像；分析经染料染色的样品的荧光图像，以确定存活酵母细胞的浓度。所述染料可选自，例如吖啶橙、SYTO9,DAPI,Hescht,Calcofluor白、碘化丙锭、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS0在一些实施方式中，染料是浓度为约Iμg/mL至约5μg/mL(例如，约Iμg/mL至约4μg/mL、约Iμg/mL至约3μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、约3μg/mL至约5μg/mL)的卩丫唳橙。在一些实施方式中，缓冲液条件具有约10至约12(例如，约10.5至约12、约10.5至约IL5、约10至约IL5、约10至约11)的pH。所述样品可以是任何合适的样品，包括来自生物燃料发酵工艺(例如，用于生产包括乙醇和/或丁醇的生物燃料)的工业用样品。样品可包括残渣，如玉米醪和/或甘蔗的残渣。在某些实施方式中，酵母为酿酒酵母种。在另一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。该方法包括:在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的荧光图像；获取经第二染料染色的样品的荧光图像；并比较经第一染料染色的样品的荧光图像和经第二染料染色的样品的荧光图像以确定酵母存活率。例如，该第一染料可选自吖啶橙、SYTO9、DAP1、Hescht、Calcofluor白，且该第二染料可选自碘化丙锭、溴化乙锭、Oxono1、Mg-ANS。在某些实施方式中，第一染料为吖啶橙且第二染料为碘化丙锭。例如，吖啶橙的浓度可为约IUg/mL至约g/mL(例如，约Iiig/mL至约4yg/mL、约Iyg/mL至约3yg/mL、约2ug/mL至约5ug/mL、约3ug/mL至约5ug/mL)。碘化丙锭的浓度可为约IUg/mL至约5ug/mL(例如，约Iiig/mL至约4ug/mL、约Iyg/mL至约3ug/mL、约2ug/mL至约5ug/mL、约3iig/mL至约5ug/mL)。在又一方面，本发明一般地涉及用于确定存活酵母细胞的浓度的方法。该方法包括:在PH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像；获取经第二染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像；并分析该经第一染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像和该经第二染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像以确定样品中存活酵母细胞的浓度。在又一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。该方法包括:在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；比较该经第一染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中存活酵母细胞的特征；获取经第二染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；并比较该经第二染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中不存活的酵母细胞的特征。该方法可进一步包括确定存活酵母细胞的浓度。在又一方面，本发明一般地涉及用于确定活酵母细胞的浓度的方法。该方法包括:在PH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；获取经第二染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；并确定样品中存活酵母细胞的浓度。在又一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。该方法包括:在pH为约10.5至约12.5的缓冲液条件下，用吖啶橙对将要测定酵母存活率的样品进行染色；通过将明视野光束指向样品获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态明视野图像；通过将激发光束指向样品获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态荧光图像；比较该经吖啶橙染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中存活酵母的特征；在约10.5至约12.5的pH的缓冲液条件下，用碘化丙锭对将要测定酵母存活率的样品进行染色；通过将明视野光束指向样品获取经碘化丙锭染色的样品的至少一幅静态明视野图像；通过将激发光束指向样品获取经碘化丙锭染色的样品的至少一幅静态荧光图像；比较该经碘化丙锭染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中不存活的酵母的特征；并确定样品的酵母存活率。实施例荧光染色剂的选择为了优化酵母存活率测定的试验方案，所选择用来确定活或死细胞的荧光染色剂应该是明亮的并具有低背景信号。使用CellometerVision,利用375nm/450nm、470nm/525nm和527nm/595nm的激发/发射的对，对8种不同的荧光染色剂进行了比较。所述染料在稀释至约2XIO6个颗粒/mL的Munton脱水酵母上进行实验。吖啶橙(AO)、SYTO9,DAPI,Hoescht,CalcofIuor白是全细胞染色剂，而Mg-ANS、碘化丙锭(PI)、溴化乙锭(EB)为存活率染料，其可以进入膜受损的细胞。针对每种染料，进行系列浓度的测试以观察近似的最佳浓度并分析信背比。紫外线(375nm)所激发的染料为DAP1、Hoescht、Calcofluor白和Mg-ANS。DAP1、Hoescht和Calcofluor白染色所有细胞,但由于酵母包含内膜和外细胞壁的生物结构，使染色情况变得难以预知。如图1所示，UV染料的结果显示出酵母细胞的非均匀的荧光。对于Mg-ANS，一种存活性染料，它仅染色死酵母细胞，在较低浓度下具有均匀的荧光信号。总体而言，紫外染料具有很高的来自基底(substrate)的自体荧光背景，且低功耗、高亮度UVLED不易获得。蓝光(470nm)所激发的染料为吖啶橙和SYTO9，这两种染料均染色全部细胞，但类似于UV染料，它们会产生非均匀的荧光。在两种染料的较低浓度下，一些酵母细胞比其他细胞更明亮地染色，它们对应于膜受损的细胞。(图2)绿光(527nm)所激发的染料为溴化乙锭和碘化丙锭，它们是死细胞的存活性染色齐U。在高浓度下，每一个细胞中都诱导产生背景荧光。随着浓度的降低，死细胞的信号增加(图3)。PI具有比EB低得多的背景荧光。总体而言，AO>SYTO9更适合于全细胞染色而PI更适合于死细胞染色。因此，为针对杂乱样品进行优化，进一步探讨了这三种染料。pH值的优化以前，已经采用SYTO9和PI测定酵母的存活率(Invitrogen)，且通过使用CellometerVision，可得到一致的结果。SYTO9和PI的最佳浓度分别为约3μM和41μg/mL。(图4)SYTO9和PI对脱水的酵母均很好地染色，但当测试玉米醪中的酵母时，AO和SYTO9均不能很好地染色活细胞。此外，如图5所示，显示了高荧光背景，其中残渣明亮地发光，使自动计数不可能进行。通常，由AO所产生的荧光信号要比SYTO9所产生的好得多，因此将进行pH系列试验(图6和图7)。结果显示，在pH大于8时，残渣的背景荧光被消除(类似于蜜蜂孢子)且活细胞被明亮地染色。AO和PI混合物的浓度优化活细胞的AO染色可以通过优化缓冲液的pH值来调整，但同时，也必须补偿PI浓度以淬灭死细胞中的AO荧光。此外，PI也染色残渣，因此可调整浓度以减少残渣信号。(图8)发酵样品的测定对玉米醪中的酵母的几个发酵阶段测试在调整的pH下的AOPI混合物。对发酵2测试了大量的计数以检查该方案的一致性。首先将10yL的发酵样品与5uL的各为5ug/mL的AO和PI混合，最后用5iiL的0.05M的NaOH调节pH。对发酵2进行了超过11次试验，计算得到19.24%+/-2.35%存活率的平均值。此外，酵母样品用所调整的pH值进行预稀释，然后将10对10iiL的样品和AOPI染色剂1:1混合I分钟。在孵育I分钟后，将溶液吸移到低FL背景片中并插入CellometerVision中。经过2-3分钟,背景残洛突光扩散出去，在AO通道中只留下明亮的活细胞，而低浓度的PI将明亮地染色死细胞，而残渣也未染色。(图9)缓冲液的选择通过使用NaOH将酵母样品和染色剂的pH直接改变为约10而进行了某些试验，但选择在对于一致的荧光检测和浓度测定最佳的pH值和离子强度下稳定的缓冲液是必要的。选择Trizma碱和Trizma8.8来测试在没有最低背景的情况下染色酵母的能力。(图10)Trizma碱产生pH值约为10的缓冲液并用水稀释至0.1M，其对于AO和PI通道都产生干净的背景。然而Trizma8.8没有高到足以最小化背景以及增强酵母信号。残渣的背景信号仍然可以观察到，在AO通道中也可以观察到死酵母，这造成了活细胞和死细胞之间的一定的混淆。玉米醪中的酵母的表征所提供的酵母和玉米醪的混合物首先通过测定各个样品的pH值和乙醇含量进行表征。样品1-7的平均pH值为4.45+/-0.18，乙醇含量分别从1.8%至14.7%递增。由于酵母的PH耐受性高，在每个样品中的低pH值可以防止细菌污染。一般而言，在发酵过程中，随着发酵罐中乙醇百分比的增加，酵母的存活率降低，这最终终止生物乙醇的产生。因此，如果在不同发酵阶段可以容易地监测酵母的存活率，则当试图延长酵母的生命周期时，可实现较高的最终乙醇产出。将本发明的稀释缓冲液与细胞培养级的H2O和PBS相比，以获得最高的荧光信号以及低背景水平。图12a显示了对于AO和PI，酵母的信背比。对于PI染色，所有三种溶液对于不存活的细胞显示了相当的信背比，但对于H2O和PBS，玉米醪残渣的非特异性荧光较高。AO荧光在稀释缓冲液之间具有最大差异，其中,H2O和PBS对活细胞不显示任何的荧光信号。与此相反，在本文所公开的缓冲液中稀释的酵母表现出强烈的AO荧光并且对于不存活的细胞表现出最小的信号，这证实了AO到PI的荧光共振能量转移。浓度系列的结果显示于图12b中，其中对于AO和PI在每个浓度都显示出高信背t匕。也比较了来自残渣的非特异性荧光和背景荧光。随着两种染料浓度的下降，来自玉米醪残渣的非特异性荧光也下降。出于其显示出高信背比和低非特异性荧光信号这一事实，对于AO和PI优化的浓度为约1.25ug/mL。通过增加或降低AO:PI的浓度比，可改变酵母的荧光响应(数据未示出)。如果AO的浓度高于PI，则随着残渣非特异性信号的增加，AO将发出更明亮的荧光。更重要的是，PI不足以淬灭来自不存活的细胞的AO信号，该信号导致活酵母和死酵母之间较差的区分。然而，如果AO的浓度超过20ug/mL,则由于抑制自身荧光的二聚体的形成，可能发生AO分子的自淬灭。另一方面，如果AO的浓度低于PI，AO信号会变弱，但会在活酵母和死酵母之间提供良好的区分。因此，通过保持AO和PI在同一浓度消除了AOPI混合物不平衡的问题。使用所选择的缓冲液和优化的染料浓度，按照Cellometer成像细胞计数法测定每种酵母样品的浓度和存活率。图13显示了七个酵母样品的明视野图像和荧光图像的实例。每个荧光图像分别为来自AO和PI通道的荧光信号与伪颜色(pseudocolors)绿色和橙色的组合。计过数的酵母细胞被软件圈出来，这明确地区分了活细胞、不存活的细胞和残渣。被有效染色的酵母细胞具有高荧光强度，而玉米醪非特异性信号被最小化。对样品1-7计算的平均总细胞浓度分别为0.41、1.33、1.20,0.94、1.31、1.32和0.97XIO8个颗粒/mL，而平均存活率测定值分别为83.8%,90.4%,94.0%,75.9%,80.8%,60.9%和24.1%.使用手动细胞计数法测定的样品1-7的平均总细胞浓度分别为0.54、1.43、1.31,0.78、1.18、1.14,0.85XIO8个颗粒/mL，且平均存活率测定值分别为80.0%,90.7%,85.9%,72.3%,80.5%,60.3%和19.5%(图13)。虽然由于稠混合物的移液不足，两个样品(I和4)显示出较低的细胞浓度，但从Cellometer和细胞计数器两者中所获得的结果是一致的。除样品I和样品4以外，其他样品对Cellometer和细胞计数器分别表现出1.18XIO8和1.22XIO8个颗粒/mL的平均值，这显示了新型成像细胞计数方法在样品之间的一致性。由于初始酵母和玉米醪样品用稀释缓冲液进行了1:20(v/v)的稀释，因此得到的计数结果自动乘以因子20。浓度测定的移液误差并不影响本试验中的存活率测定，因为存活细胞和不存活细胞的细胞计数比得到了适当地测定。由于乙醇百分比的增加，存在存活率降低的总趋势，这在图14中绘制出来。在本实验中，Cellometer能够证明在整个发酵过程中存活率的降低。在细胞培养级H2O中稀释的对照样品，由于弱的活细胞荧光信号和来自玉米醪的非特异性荧光信号，显示出很差的成像结果(图15)。利用CellometerVision和本发明的稀释缓冲液的结合直接测定发酵罐中的酵母浓度和存活率对美国的生物燃料产业具有十分重要的意义。准确地测定发酵罐中的酵母的存活率将使生物燃料工厂能够产生一致的生物乙醇产出。此外，这将促进发酵罐之间的一致性并提高乙醇生产的效率。另一个优点是缩短花费在手工细胞计数上的时间，通过使用成像细胞计数法，训练有素的技术人员可以很容易地在不到10分钟内安装和运行多个样品。一般而言，仅在发酵过程的前2-3小时计数酵母浓度。可以容易地引入这种新型成像细胞计数方法的效率和有效性以在整个发酵过程中监测酵母存活率。以前已经证明了CellometerVision是准确和稳定的纯酵母浓度和存活率测定(http://www.nexcelom.com/Applications/Yeast-Viability.html),例如，测定玉米醪中的酵母浓度和存活率的能力，其中从存活酵母细胞和不存活的酵母细胞检测和计数强荧光信号，而玉米醪的非特异性染色得到最小化，以促进有效的自动细胞计数算法。结合使用CellometerVision和稀释缓冲液的计数试验的开发为美国生物燃料工业提供了在发酵过程中一致且精确地监测酵母存活率以确保高质量的生物乙醇产出的新方法。此夕卜，在生物燃料工厂引入这种新型成像细胞计数方法可以支持提高生物乙醇生产的研究，随着化石燃料的减少和全球变暖问题的加剧，这将成为一个重要的发展。(Pretorius等人，“DesignerYeastsfortheFermentationIndustryofthe21stCentury,，，FoodTechnologyBiotechnology,第41卷，第3-10页，2003年；Graves等人，“EffectofpHandlacticoraceticacidonethanolproductivitybySaccharomycescerevisiaeincornmash，，，JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,第33卷，第469-474页，2006年；Graves等人，“InteractioneffectsoflacticacidandaceticacidatdifferenttemperaturesonethanolproductionbySaccharomycescerevisiaeincornmash,”AppliedMicrobiologyandBiotechnology,第73卷，第1190-1196页，2007年。)示例性方法稀释缓冲液和荧光试剂0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)(SigmaAldrich)和细胞培养级H2O也用来同本发明的缓冲液进行比较。荧光染色剂AO和PI均为核染色剂并购自Biolegend(SanDiego,CA)0AO是阳离子膜透性染料，单独使用时，以绿色荧光标记所有细胞，而PI是完整膜不透性染料，其容易渗透膜受损的不存活的细胞，产生橙色焚光。(Foglieni等人，“Fluorescentdyesforcellviability:anapplicationonprefixedconditions，，，HistochemicalCellBiology,第115卷，第223-229页，2001年；Ling等人，“ClassificationoflarvalcirculatinghemocytesofthesilkwormBombyxmori，byacridineorangeandpropidiumiodidestaining，，，HistochemicalCellBiology,第120卷，第505-511页，2003年；Mascotti等人，“HPCviabilitymeasurement:trypanblueversusacridineorangeandpropidiumiodide，，’Transfusion，第40卷，第693-696页，2000年；So1mon等人，“Factorsinfluencingcordbloodviabilityassessmentbeforecryopreservation，，，Transfusion，第50卷，第820-830页，2010年；Wallen等人，“ComparisonofTwoFlowCytometricAssaysforCellularRNA-AcridineOrangeandPropidium1dide，”Cytometry，第3卷，第155-160页，1980年。)由于AO发射光谱的相当一部分与PI激发光谱重叠且两种染料均位于不存活细胞的细胞核中，因此当AO和PI同时使用时会发生荧光共振能量转移(FRET)。FRET是一种量子力学现象，其中无辐射的能量从供体(AO)转移到受体(PI)。在这种情况下，当AO以高量子产率被激发时，荧光能量转移，从而激发不存活的细胞中的PI，这淬灭了它们的AO信号。(Gordon等人，“QuantitativeFluorescenceResonanceEnergyTransferMeasurmentsUsingFluorescenceMicroscopy,”BiophysicalJournal,第74卷，第2702-2713页，1998年；Koksch等人，“Fluorescenceresonanceenergytransferasanewmethodfortheepitope-specificcharacterizationofant1-plateletantibodies，，’JournalofImmunologicalMethods，第187卷，第53-67页，1995年；Periasamy，“Fluorescenceresonanceenergytransfermicroscopy:aminireview，，，JournalofBiomedicalOptics，第6卷，第287-291页，2201年；Selvin等人，“Luminescenceenergytransferusingaterbiumchelate:Improvementsonfluorescenceenergytransfer,ProceedingsNationalAcademyofScience，第91卷，第10024-10028页，1994年。)Α0ΡΙ组合的特殊光学性质使得可以明确地区分存活细胞和不存活的细胞。酵母样品制备酵母和玉米醪的混合物由LincolnwayEnergy(Nevada,IA)提供。在发酵前[2.65h和8h(样品1-2)]以及发酵过程中[2.5h、10h、39h、45h和55h(样品3-7)]，从各个发酵罐中收集七种酵母和玉米醪混合物置于500mL聚丙烯瓶中用于浓度和存活率测定[来自生物燃料联系者的信息]。针对每个样品测定乙醇百分比和PH值，S卩[所需信息]。每个样品用稀释缓冲液、PBS及细胞培养级H2O以1:20(v/v)稀释并装入50mL离心管中。由于酵母混合物为泥浆状溶液，在稀释前必须充分振荡瓶子。CellometerVision平台和一次性计数室CellometerVision采用一个明视野和两个突光通道进行图像细胞计数分析(图11)。对于AO通道，激发和发射滤波片组分别为475nm和535nm。对于PI通道，激发和发射滤波片组分别为540nm和670nm。Cellometer系统自动在两个通道之间切换以测定存活细胞和不存活细胞的浓度，并生成每个样品的存活率。一次性计数室正好容纳20yL样品(图12)。四个独立的区域在计数室上进行成像和分析，这通过计数算法进行，从而产生准确和一致的浓度结果。缓冲液的选择比较在Nexcelom稀释缓冲液、PBS和细胞培养级H2O(如上所述)中稀释的酵母和玉米醪混合物的荧光信号，以便为浓度和存活率测定选择最佳的缓冲液。随机选择酵母样品2(10iiL)并用10iig/mL的AOPI混合物(10yL)染色以检查信背比。荧光染料浓度优化通过在所选定的优化缓冲液中进行两种染料的浓度系列测试来对AO和PI的浓度进行优化。使用酵母样品2，通过混合10uL酵母和10uL染料，以20、10、5、2.5和1.25iig/mL(终浓度)测试这两种染料，其中最佳浓度应该对活细胞产生明亮的AO荧光信号或高信背比，而由于PI的淬灭效应对不存活的细胞产生暗淡的信号。不存活的细胞在PI通道中应该是明亮的，而存活细胞应该是暗淡的。浓度和存活率测定方案在预混酵母样品和稀释缓冲液后，通过上下颠倒10次在离心管中混合。然后将每个酵母样品(10yL)与10iiL的2.5iig/mL的AOPI混合物混合，并将其孵育2_3分钟。然后将染色的酵母样品(20UL)吸移到细胞计数室内并使之沉降。然后，使用CellometerVision一式三份计数和分析每个样品。手动细胞计数仪计数方法针对7个样品中的每一个，从CellometerVision平台捕获的图像在两个Cellometer计数室中进行手动计数。然后将所得的浓度和存活率结果与用软件自动计数的结果进行比较。参考文献[1]D.Antoni,V.V.Zverlov和W.H.Schwarz,“Biofuelfrommicrobes,，，AppliedMicrobiologyBiotechnology,第77卷，第23-35页,2007年。[2]A.A.Vert色s,M.1nui和H.Yukawa,“TechnologicalOptionsforBiologicalFuelEthanol,，，JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology,第15卷，第16-30页，2008年。[3]L.C.Basso,H.V.d.Amorim,A.J.d.0liveira和M.L.Lopes,“YeastselectionforfuelethanolproductioninBraziljnFEMSYeastResearch，第8卷，第1155-1163页，2008年。[4]S.Nikolic9L.Mojovic5M.Rakin，D.Pejin和V.NedOVlC,iiEffectofdifferentfermentationparametersonbioethanolproductionfromcornmealhydrolyzatesbyfreeandimmobilizedcellsofSaccharomycescerevisiaevar.ellipsoideus，，，JournalofChemicalTechnologicalBiotechnology,第84卷，第497-503页，2009年。[5]W.R.Gibbons和S.R.Hughes，“Integratedbiorefinerieswithengineeredmicrobesandhigh-valueco-productsforprofitablebiofuelsproduction，，’InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Plant，第45卷，第218-228页，2009年。[6]Χ.H.Hu，Μ.H.Wang,Τ.Tan，J.R.Li，H.Yang，LLeach,R.M.Zhang和Z.W.Luo,“GeneticDissectionofEthanolToleranceintheBuddingYeastSaccharomycescerevisiae,”Genetics，第175卷，第1479-1487页，2007年。[7]J.LArgueso,M.F.Carazzolle,P.A.Mieczkowski,F.M.Duarte,0.V.C.Netto，S.K.Missawa，F.Galzerani,G.G.L.Costa,R.0.Vidal,M.F.Noronha，M.Dominska，M.G.S.Andrietta，S.R.Andrietta，A.F.Cunha,LH.Gomes，F.C.A.Tavares,A.R.Alcarde，F.S.Dietrich,J.H.McCusker,T.D.Petes和G.A.G.Pereira，“GenomestructureofaSaccharomycescerevisiaestrainwidelyusedinbioethanolproduction，，，GenomeResearch，第19卷，第2258-2270页，2009年。[8]J.Μ.Eksteen，P.v.Rensburg,R.R.C.0tero和1.S.Pretorius，“StarchFermentationbyRecombinantSaccharomycescerevisiaeStrainsExpressingthe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