胞质的荧光离子指示剂的制作方法
【专利摘要】用于结合水增溶官能团的荧光离子指示剂的新颖的荧光团。这些荧光团使得具有不溶于水或难溶于水的螯合剂的离子浓度的波长分析可见。该荧光团的绿色版本包括具有羧酸盐附属物的一种假定的荧光素。该荧光团的橙色版本包括也具有羧酸盐附属物的一种假定的碱性玫瑰精。将该荧光团附接到12-冠醚-4、15-冠醚-5、18-冠醚-6、21-冠醚-7、或24-冠醚-8上从而分别产生锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。将该荧光团附接到二氮杂[1,1,1]、[1,1,2]、[1,2,2]、[2,2,2]、[2,2,3]、[2,3,3]、或[3,3,3]穴醚上从而分别产生更具选择性的锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。将该荧光团附接到BAPTA、APTRA、或半-BAPTA或它们的类似物上，产生强烈地抗自该细胞的泄漏的新的钙、镁以及其他金属离子指示剂家族。
【专利说明】胞质的荧光离子指示剂
[0001]作者:阿夸西(AKWASIMINTA)和P.罗格里奥艾斯卡梅拉(P.R0GEL10 ESCAMILLA)
[0002]代理人:阿桑特研究公司(ASANTE RESEARCH, LLC)
[0003]提交日期:2011年9月20日
[0004]相关申请
[0005]本申请涉及于2010年9月20日提交的美国临时专利申请号61/384，695，并且要求来自这个申请的优先权。本申请涉及于2011年3月17日提交的美国临时专利申请号61/453，664，并且将其通过引用结合在此。
发明领域
[0006]本发明涉及一种荧光团以及该荧光团与一个螯合部分组合以提供新荧光离子指示剂的用途。
[0007]发明背景
[0008]荧光离子指示剂典型地包括一个连接到一个荧光团上的螯合部分，使得激发和/或发射波长的变化，或激发和/或发射强度的变化，或这两者在结合该离子时发生。为了感测水介质中的离子浓度，该荧光离子指示剂应当是水溶的。对于细胞内的测量，该指示剂不应当以将干扰该分析的速率从该细胞泄漏出。为了方便起见，应当将该指示剂以无创性的方式加载，例如，作为一种乙酰氧基甲基酯。
[0009]许多螯合剂，如冠醚和穴醚，缺点在于很差的水溶解度，由此限制了对有机溶剂的离子测量。然而，如果将这些螯合剂连接到一个水溶性的荧光团上，它们可以产生一种用于水介质的荧光离子指示剂。
[0010]对于易溶于水的螯合剂，如BAPTA，该水溶性的荧光团可以增强水溶性并且，对于细胞内的测量，可以增强荧光离子指示剂的细胞保留。
[0011]两种此类水溶性的突光团，羟基咕吨酮变体和rosamine变体,是Asante Green(绿)?(I)以及 Asante Orange (橙)?(II)。
[0012]发明概述
[0013]本发明披露了新的用于测量金属离子的浓度的荧光离子指示剂。
[0014]该荧光离子指示剂包括一种结合水增溶官能团的、波长可见的荧光团，使得该指示剂的螯合部分不需要结合相同基团。这样一种荧光团因此使得具有不溶于水或难溶于水的螯合剂的离子浓度的波长分析可见。
[0015]由于这些指示剂的一个应用包括离子的胞质浓度的测量，该水增溶基团应当是作为可以透过该脂质细胞膜的疏水部分可掩蔽的。这样一个疏水部分典型地易于被细胞组分切割以使得该指示剂回到其水溶性形式。最普及的疏水性掩模是乙酰氧基甲基酯，它可由胞质溶胶中的非特异性酯酶切割。
[0016]对于相同的细胞应用，该荧光离子指示剂应当在该细胞中保留足够长的时间使得其泄漏不会对实验结果产生不利影响。水增溶羧酸盐有助于将该指示剂保留在细胞中。
[0017]对于钙离子，该指示剂的BAPTA螯合部分包括四种水增溶的且细胞-保留性的羧酸盐。对于碱土金属，该螯合部分典型地包括不具有羧酸盐官能团的冠醚或穴醚。在这种情况下，该荧光团提供所必需的羧酸盐官能团。
[0018]在螯合剂是如不包含水增溶的且细胞-保留性的部分的BAPTA的情况下，该荧光团只增加亲水性并增强该指示剂的保留。
[0019]一些现有技术的UV激发荧光团具有乙酰氧基甲基酯-可掩蔽的、水增溶的官能团；如在Fura-2、Indo-1、SBF1、PBFI或SBFO中的那些。很少有可见的激发荧光团存在有这些特性，并且甚至更少有已经共价连接到螯合剂上的。
[0020]该荧光团的绿色版本包括一种假定的荧光素，该荧光素是卤代的以确保在生理学PH处的pH不敏感性并且在生理学pH处展示了两种羧酸盐官能。
[0021]该荧光团的橙色版本包括具有经羧酸盐烷基化的氨基/亚氨基(immino)官能的一种假定的碱性玫瑰精。
[0022]将该荧光团附接到12-冠醚-4、15-冠醚-5、18-冠醚_6、21_冠醚-7、或24-冠醚-8上从而分别产生锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。
[0023]将该荧光团附接到二氮杂[I, I, I]、[I, I, 2]、[I, 2，2]、[2，2，2]、[2，2，3]、[2，3，3]、或[3，3，3]穴醚上从而分别产生更具选择性的锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。
[0024]将该荧光团附接到BAPTA或其类似物上从而产生一种新的、强烈地抗自该细胞的泄漏的钙指示剂家族，这归功于该荧光团上的另外的羧酸盐。这些钙指示剂展示出比现有技术的指示剂(例如Fluo-4)更大的亮度以及动态范围。
[0025]将该荧光团附接到APTRA或其类似物上从而产生一种新的、强烈地抗自该细胞的泄漏的镁指示剂家族，这归功于该荧光团上的另外的羧酸盐。
`[0026]将该荧光团附接到半-BAPTA或其类似物上从而产生一种新的、强烈地抗自该细胞的泄漏的指示剂家族，这归功于该荧光团上的另外的羧酸盐。
[0027]附图简要说明
[0028]图1示出了在一个非细胞的水滴定中，钠荧光指示剂ANG-1对不断增加的钠浓度的响应。
[0029]图2示出了在一个非细胞的水滴定中，钠荧光指示剂ANG-2对不断增加的钠浓度的响应。
[0030]图3示出了在一个非细胞的水滴定中，钠荧光指示剂ANG-3对不断增加的钠浓度的响应。
[0031]图4示出了在一个非细胞的水滴定中，钾荧光指示剂APG-1对不断增加的钾浓度的响应。
[0032]图5示出了在一个非细胞的水滴定中，钾荧光指示剂APG-2对不断增加的钾浓度的响应。
[0033]图6示出了在一个非细胞的水滴定中，钙荧光指示剂ACG-1对不断增加的钙浓度的响应。
[0034]图7示出了在HEK293细胞中，由于TRPVl通道的辣椒素激动作用(capsaicinagonization),钠突光指示剂ANG-1对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。
[0035]图8示出了在REF52细胞中，由于Na+离子载体短杆菌肽_促进的内流，钠荧光指示剂ANG-1对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。[0036]图9示出了在星形细胞中，由于钠泵的乌巴苷抑制，钠荧光指示剂ANG-1对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。
[0037]图10示出了在REF52成纤维细胞中，由于Na+离子载体SQ1-Pr-促进的内流，钠荧光指示剂ANG-2对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。
[0038]图11示出了在REF52成纤维细胞中，钠荧光指示剂ANG-2对细胞内Na+的两性霉素-B消耗，并且然后对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。
[0039]图12示出了在REF52成纤维细胞中，钠荧光指示剂APG-1对细胞内K+的两性霉素-B消耗，并且然后对不断增加的细胞内K+浓度的响应。
[0040]图13比较了 Ca2+-饱和的ACG-1对荧光素的量子效率。
[0041 ] 图14示出了在大鼠迷走神经的感觉神经元中，钙突光指示剂ACG-1对从1-1OOOmsec范围的去极化步骤的响应。
[0042]图1示出了在一个非细胞的水滴定中，钠荧光指示剂(二氮杂-15-冠醚-5螯合剂！Z1=CT+TMA ；Z2=0 !R1=Cl ;R2= (CH2)nCOCT+TMA, n=2 ;R3=R6=R7=R8=R9=H)对不断增加的钠浓度的响应。
[0043]图边示出了在一个非细胞的水滴定中，钠荧光指示剂(二氮杂-15-冠醚-5螯合剂！Z1=CT+TMA ；Z2=0 !R1=H ;R2= (CH2)nC00—TMA，n=2 ；R3=R7=R8=R9=H, R6=OMe)对不断增加的钠浓度的响应。
[0044]实施方案的说明
[0045]将Asante Green `(绿)?和Asante Orange (橙)?共价连接到某些螯合剂上从而产生水溶性且细胞-保留性的荧光离子指示剂，包括用于锂、钠、钾、铷、铯、镁、钙、和铊的那些。
[0046]
【权利要求】
1.一种荧光离子指示剂，包括具有以下结构的一个第一羟基咕吨酮荧光团
2.如权利要求1所述的荧光离子指示剂，其中R5°是到一种螯合剂上或到共价键合到一种螯合剂上的一个第一连接物上的一个共价键。
3.如权利要求2所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个第一非环状连接物，到一种非环状螯合剂上的一个共价键。
4.如权利要求3所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个非环状连接物，到一种螯合剂上的一个共价键，该第一非环状连接物包括
5.如权利要求4所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是一种冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:单氮杂-12-冠醚-4、单氮杂-15-冠醚-5、单氮杂-18-冠醚-6、单氮杂-21-冠醚-7、或单氮杂-24-冠醚-8 ;并且R52 =该冠醚的氮杂官能。
6.如权利要求5所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是单氮杂-15-冠醚-5，R1 = Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ；R3 = R6 = R7 = R8 = R9 = H ；R50 =自该羟基咕吨酮荧光团到该非环状连接物上的R51的键；R52是该单氮杂-15-冠醚-5上的氮杂:
7.如权利要求4所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是一种冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二氮杂-12-冠醚-4、二氮杂-15-冠醚-5、二氮杂-18-冠醚-6、二氮杂-21-冠醚-7、或二氮杂-24-冠醚-8，使得该螯合剂具有一个第一氮杂官能以及一个第二氮杂官能；该第一非环状连接物在R52处键合到该螯合剂的第一氮杂官能上并且在R51处键合到该第一羟基咕吨酮荧光团上；并且存在一个第二连接物以及一个第二荧光团，该第二连接物包括:
8.如权利要求7所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是二氮杂-15-冠醚-5并且该第二荧光团与该第一羟基咕吨酮荧光团相同# = Cl ；R2 = (CH2)nC02R4,n = 2 ；R3 =R7 = R8 = R9 = H ；R6 = OMe ；R50 =自该荧光团到该非环状连接物上的R51的键；R52各自是该二氮杂-15-冠醚-5上的这些氮杂:
9.如权利要求4所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是一种冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二氮杂-12-冠醚-4、二氮杂-15-冠醚-5、二氮杂-18-冠醚-6、二氮杂-21-冠醚-7、或二氮杂-24-冠醚-8 ；R52 =该冠醚的一个第一氮杂官能，R53 =该冠醚的一个第二氮杂官能，作为一个帽上的一个取代基，该帽包括:
10.如权利要求9所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是二氮杂-15-冠S1-5，R1 = Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ；R3 = R7 = R8 = R9 = R11 = R13 = R14 = H ；R6 = R10=OMe ；R12 = CHO ；R50 =到该非环状连接物上的R51的键；R52是该二氮杂_15_冠醚-5上的一个第一氮杂；R53是该二氮杂-15-冠醚-5上的一个第二氮杂:
11.如权利要求9所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是二氮杂-15-冠SI _5，R1 = Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ；R3 = R7 = R8 = R9 = R11 = R13 = R14 = H ；R6 = R10=OMe ；R12 = Me ；R50 =到该非环状连接物上的R51的键；R52是该二氮杂_15_冠醚-5上的一个第一氮杂；R53是该二氮杂-15-冠醚-5上的一个第二氮杂:
12.如权利要求2所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个环状连接物到一种环状螯合剂上的一个共价键。
13.如权利要求12所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个环状连接物到一种螯合剂上的一个共价键，该环状连接物包括
14.如权利要求13所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并环状冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二苯并-二氮杂-12-冠醚_4、二苯并-二氮杂-15-冠醚-5、二苯并-二氮杂-18-冠醚-6、二苯并-二氮杂-21-冠醚-7、或二苯并-二氮杂-24-冠醚-8 ;使得存在两个相同的羟基咕吨酮荧光团，每个通过R5°共价键合到其对应的环状连接物的R51上，在该冠醚中的每个环状连接物结合其对应的氮杂/氧杂部分，使得这两个氮杂官能的每一个共价键合到其对应的R22上，其中R22 = H或(CH2)nCH3Oi = O、1、2)。
15.如权利要求14所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是二苯并-二氮杂-15-冠醚-5，R1 = Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ；R3 = R15 = R16 = R17 = H ；R22 = (CH2)nCH3，n = 1，并且R51 =到该羟基咕吨酮荧光团上的共价键R5q:
16.如权利要求13所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并环状冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二苯并-二氮杂-12-冠醚_4、二苯并-二氮杂-15-冠醚-5、二苯并-二氮杂-18-冠醚-6、二苯并-二氮杂-21-冠醚-7、或二苯并-二氮杂-24-冠醚-8 ;使得该羟基咕吨酮荧光团通过Rsi共价键合到其环状连接物的R51上，所述环状连接物结合该冠醚的一个第一氮杂/氧杂部分；并且该冠醚的一个第二氮杂/氧杂部分被结合在一个环状帽上，该帽包括:
17.如权利要求16所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是二苯并-二氮杂-15-冠醚-5，R1 = Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ；R3 = R15 = R16 = R17 = R18 = R19 = R21=H ；R20 = Me ；R22 = (CH2)nCH3, n = 1，并且R51 =到该羟基咕吨酮荧光团上的共价键R50:
18.如权利要求13所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并-穴醚，该二苯并-穴醚选自下组，该组包括:二苯并_[1，1，1]、二苯并_[1，1，2]、二苯并-[1，2，2]、二苯并-[2，2，2]、二苯并-[2，2，3]、二苯并-[2，3，3]、和二苯并-[3，3，3]穴醚，使得存在两个相同的羟基咕吨酮荧光团，每个通过R5tl共价键合到其对应的环状连接物的R51上，在该穴醚中的每个环状连接物结合其对应的氮杂/氧杂部分。
19.如权利要求18所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是二苯并-[1，1，2]_穴醚，R1 = Cl ；R2 = (CH2)nC02R4，n = 2 ；R3 = R15 = R16 = R17 = H ;并且 R51 =到该羟基咕吨酮荧光团上的共价键R5tl:
20.如权利要求13所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并环状穴醚，该二苯并环状穴醚选自下组，该组包括:二苯并-[1，1，I]、二苯并-[1，1，2]、二苯并-[1，2，2]、二苯并-[2，2，2]、二苯并-[2，2，3]、二苯并-[2，3，3]、和二苯并-[3，3，3]穴醚；使得该羟基咕吨酮荧光团通过R5°共价键合到其环状连接物的R51上，所述环状连接物结合该穴醚的一个第一氮杂/氧杂部分；并且该穴醚的一个第二氮杂/氧杂部分被结合在该环状帽上:
21.如权利要求20所述的荧光离子指示剂，其中R1= Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ；R3=R15 = R16 = R17 = R18 = R19 = R21 = H ；R20 = Me ;并且R51 =到该羟基咕吨酮荧光团上的共价键R5q:
22.如权利要求2所述的荧光离子指示剂，其中该螯合剂是BAPTA及其衍生物:
23.如权利要求22所述的荧光离子指示剂，其中R1= Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ；R3=R24 = R26 = H ；R25 = Me ；R51 =在R50处到该羟基咕吨酮荧光团上的共价键:
24.如权利要求2所述的荧光离子指示剂，其中该螯合剂是APTRA及其衍生物:
25.如权利要求24所述的荧光离子指示剂，其中R1= Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ;并且R5I =在处到该羟基咕吨酮荧光团上的共价键:
26.如权利要求2所述的荧光离子指示剂，其中该螯合剂是半-BAPTA及其衍生物:
27.如权利要求26所述的荧光离子指示剂，其中R1= Cl ；R2 = (CH2)nCO2R4, n = 2 ;并且R5I =在处到该羟基咕吨酮荧光团上的共价键:
28.—种突光离子指示剂,包括具有以下结构的一个第一 rosamine突光团
29.如权利要求28所述的荧光离子指示剂，其中R5°是到一种螯合剂上或到共价键合到一种螯合剂上的一个第一连接物上的一个共价键。
30.如权利要求29所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个第一非环状连接物到一种非环状螯合剂上的一个共价键。
31.如权利要求30所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个非环状连接物到一种螯合剂上的一个共价键，该第一非环状连接物包括
32.如权利要求31所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是一种冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:单氮杂-12-冠醚-4、单氮杂-15-冠醚-5、单氮杂-18-冠醚-6、单氮杂-21-冠醚-7、或单氮杂-24-冠醚-8 ;并且R52 =该冠醚的氮杂官能。
33.如权利要求32所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是单氮杂-15-冠SI _5，R1 = R2 = R3 = R6 = R7 = R8 = R9 = H ；R5a = (CH2)nCO2R4, n = I ；R5b = (CH2)nCO2R4,n = I ；R50 =自该rosamine突光团到该非环状连接物上的R51的键；R52是该单氮杂_15_冠醚-5上的氮杂:
34.如权利要求31所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是一种冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二氮杂-12-冠醚-4、二氮杂-15-冠醚-5、二氮杂-18-冠醚-6、二氮杂-21-冠醚-7、或二氮杂-24-冠醚-8，使得该螯合剂具有一个第一氮杂官能以及一个第二氮杂官能；该第一非环状连接物在R52处键合到该螯合剂的第一氮杂官能上并且在R51处键合到该第一 rosamine荧光团上；并且存在一个第二连接物以及一个第二荧光团，该第二连接物包括:
35.如权利要求34所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是二氮杂-15-冠醚-5并且该第二荧光团与该第一 rosamine荧光团相同# = R2 = R3 = R6 = R7 = R8 = R9=H ；R5a = (CH2)nCO2R4, n = I ；R5b = (CH2)nCO2R4, n = I ；R50 =自该荧光团到该非环状连接物上的R51的键；R52各自是该二氮杂-15-冠醚-5上的这些氮杂:
36.如权利要求31所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是一种冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二氮杂-12-冠醚-4、二氮杂-15-冠醚-5、二氮杂-18-冠醚-6、二氮杂-21-冠醚-7、或二氮杂-24-冠醚-8 ；R52 =该冠醚的一个第一氮杂官能，R53 =该冠醚的一个第二氮杂官能，作为一个帽上的一个取代基，该帽包括:
37.如权利要求36所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是二氮杂-15-冠醚-5，R1 = R2 = R3 = R6 = R7 = R8 = R9 = R11 = R13 = R14 = H ；R6 = R10 = OMe ；R12 = CHO ；R5a = (CH2)nCO2R4, n = I ；R5b = (CH2)nCO2R4, n = I ；R50 =到该非环状连接物上的 R51 的键；R52是该二氮杂-15-冠醚-5上的一个第一氮杂；R53是该二氮杂-15-冠醚-5上的一个第二氮杂:
38.如权利要求36所述的荧光离子指示剂，其中该非环状螯合剂是二氮杂-15-冠醚-5，R1 = R2 = R3 = R6 = R7 = R8 = R9 = R11 = R13 = R14 = H ；R6 = R10 = OMe ；R12 = Me ；R5a = (CH2)nCO2R4, n = I ；R5b = (CH2)nCO2R4, n = I ；R50 =到该非环状连接物上的 R51 的键；R52是该二氮杂-15-冠醚-5上的一个第一氮杂；R53是该二氮杂-15-冠醚-5上的一个第二氮杂:
39.如权利要求29所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个环状连接物到一种环状螯合剂上的一个共价键。
40.如权利要求39所述的荧光离子指示剂，其中R5°是通过一个环状连接物到一种螯合剂上的一个共价键，该环状连接物包括
41.如权利要求40所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并环状冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二苯并-二氮杂-12-冠醚_4、二苯并-二氮杂-15-冠醚-5、二苯并-二氮杂-18-冠醚-6、二苯并-二氮杂-21-冠醚-7、或二苯并-二氮杂-24-冠醚-8 ;使得存在两个相同的rosamine荧光团，每个通过R5°共价键合到其对应的环状连接物的R51上，在该冠醚中的每个环状连接物结合其对应的氮杂/氧杂部分，使得这两个氮杂官能的每一个共价键合到其对应的R22上，其中R22 = H或(CH2)nCH3Oi = 0、1、2)。
42.如权利要求41所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是二苯并-二氮杂-15-冠醚-5，R1 = R2 = R3 = R15 = R16 = R17 = H ；R5a = (CH2) nC02R4，n = I ；R5b = (CH2)nC02R4，n = I ；R22 = (CH2)nCH3, n = I ;并且 R51 =到该 rosamine 荧光团上的共价键 R50:
43.如权利要求40所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并环状冠醚，该冠醚选自下组，该组包括:二苯并-二氮杂-12-冠醚_4、二苯并-二氮杂-15-冠醚-5、二苯并-二氮杂-18-冠醚-6、二苯并-二氮杂-21-冠醚-7、或二苯并-二氮杂-24-冠醚-8 ;使得该rosamine荧光团通过R5°共价键合到其环状连接物的R51上，所述环状连接物接合该冠醚的一个第一氮杂/氧杂部分；并且该冠醚的一个第二氮杂/氧杂部分被结合在一个环状帽上，该帽包括:
44..如权利要求16所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是二苯并-二氮杂-15-冠醚-5，R1 = R2 = R3 = R15 = R16 = R17 = R18 = R19 = R21 = H ；R20 = Me ；R5a = (CH2)nC02R4，n = I ；R5b = (CH2) nC02R4，n = I ；R22 = (CH2) nCH3，n = I ;并且 R51 =到该 rosamine 焚光团上的共价键R5c1:
45.如权利要求13所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并-穴醚，该二苯并-穴醚选自下组，该组包括:二苯并_[1，1，1]、二苯并_[1，1，2]、二苯并_[1，2，2]、二苯并-[2，2，2]、二苯并-[2，2，3]、二苯并-[2，3，3]、和二苯并-[3，3，3]穴醚，使得存在两个相同的rosamine荧光团，每个通过Rsi共价键合到其对应的环状连接物的R51上，在该穴醚中的每个环状连接物结合其对应的氮杂/氧杂部分。
46.如权利要求45所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是二苯并-[1，1，2]-穴醚，R1 = R2 = R3 = R15 = R16 = R17 = H ；R5a = (CH2)nC02R4，n = I ；R5b = (CH2)nC02R4，n = I ；并且R51 =到该rosamine荧光团上的共价键R50:
47.如权利要求40所述的荧光离子指示剂，其中该环状螯合剂是一种二苯并环状穴醚，该二苯并环状穴醚选自下组，该组包括:二苯并-[1，1，I]、二苯并-[1，1，2]、二苯并-[1，2，2]、二苯并-[2，2，2]、二苯并-[2，2，3]、二苯并-[2，3，3]、和二苯并-[3，3，3]穴醚；使得该rosamine荧光团通过R5°共价键合到其环状连接物的R51上，所述环状连接物结合该穴醚的一个第一氮杂/氧杂部分；并且该穴醚的一个第二氮杂/氧杂部分被结合在该环状帽上:
48.如权利要求47所述的荧光离子指示剂，其中R1= R2 = R3 = R15 = R16 = R17 = R18=R19 = R21 = H ；R20 = Me ；R5a = (CH2)nCO2R4, n = I ；R5b = (CH2)nCO2R4, n = I ；R22 = (CH2)nCH3, n = I ;并且R51 =到该rosamine突光团上的共价键R50:
49.如权利要求29所述的荧光离子指示剂，其中该螯合剂是BAPTA及其衍生物:
50.如权利要求49所述的荧光离子指示剂，其中R1= R2 = R3 = H ；R25 = Me ；R5a = (CH2)nC02R4，n = I ；R5b = (CH2)nCO2R4, n = I ；R51 =在 R50 处到该 rosamine 荧光团上的共价键:
51.如权利要求29所述的荧光离子指示剂，其中该螯合剂是APTRA及其衍生物: N(CH2CO2R4)2
52.如权利要求51所述的荧光离子指示剂，其中R1= R2 = R3 = H ；R5a = (CH2)nCO2R4,n = I ；R5b = (CH2)nCO2R4, n = I ;并且R51 =在R50处到该rosamine突光团上的共价键:
53.如权利要求29所述的荧光离子指示剂，其中该螯合剂是半-BAPTA及其衍生物: N(CH2CO2R4)2 R51 =在R50处到该rosamine突光团上的共价键。
R51
54.如权利要求53所述的荧光离子指示剂，其中R1= R2 = R3 = H ；R5a = (n
【文档编号】C07D413/14GK103687857SQ201180055664
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2011年9月20日 优先权日:2010年9月20日
【发明者】阿夸西·敏塔, 佩德罗·罗杰利奥·埃斯卡米利亚 申请人:阿桑特研究公司