醇发酵过程中醇酯的生产和原位产物移出的制作方法

醇发酵过程中醇酯的生产和原位产物移出的制作方法
【专利摘要】醇发酵过程和组合物，其包括通过产物醇在发酵培养基中与羧酸（例如，脂肪酸）的酯化作用产生醇酯，和能够使产物醇例如丁醇与羧酸酯化形成醇酯的催化剂（例如脂肪酶）。可从发酵培养基提取所述醇酯，并且从所述醇酯回收产物醇。所述羧酸还可作为提取剂用于从发酵培养基移出所述醇酯。
【专利说明】醇发酵过程中醇酯的生产和原位产物移出
[0001]本专利申请要求于2010年6月18日提交的美国临时申请61/356，290 ;2010年7月28日提交的美国临时申请61/368，451 ;2010年7月28日提交的美国临时申请61/368,436 ;2010年7月28日提交的美国临时申请61/368，444 ;2010年7月28日提交的美国临时申请61/368，429 ;2010年9月2日提交的美国临时申请61/379，546 ;和2011年2月7日提交的美国临时申请61/440,034 ;2011年6月15日提交的美国专利申请13/160，766的权益，它们的全部内容以引用方式并入本文。
[0002] 与本专利申请相关的序列表以电子形式通过美国专利商标局网上电子专利申请系统(EFS-Web)提交，并以引用方式并入本说明书。
发明领域
[0003]本发明涉及包括乙醇和丁醇的醇的发酵生产和全部相关的共产物、以及采用原位产物移出方法的用于改善醇发酵的方法。
_4]发明背景
[0005]醇在工业上和科学上具有多种应用，例如饮料(即，酒精)、燃料、试剂、溶剂和防腐剂。例如，丁醇是一种作为重要工业化学品和燃料添加组分的醇，其具有多种应用，包括被用作可再生的燃料添加剂、在塑料工业中用作原料化学品和在食品和调味剂工业中用作食品级的提取剂。相应地，存在对醇例如丁醇以及对有效的和环境友好的生产方法的高度需求。
[0006]通过微生物利用发酵生产醇是此类环境友好的生产方法之一。在丁醇的生产中，具体地一些以高产率生产丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性阈值。在丁醇被生产的同时将其从发酵容器中移出是处理这些低的丁醇毒性阈值问题的一种方法。因此，存在对开发用于以高产率生产丁醇(尽管生产丁醇的微生物在发酵培养基中有低的丁醇毒性阈值)的有效方法和体系的持续需求。
[0007]原位产物移出(ISPR)(也被称为萃取发酵)可被用于在丁醇(或其他发酵的醇)被生产的同时将其从发酵容器移出，从而允许微生物以高产率生产丁醇。本领域中已被描述的一种用于移出发酵的醇的ISPR方法是液-液提取(美国专利申请公布2009/0305370)。概括地讲，就丁醇发酵而言，在丁醇浓度达到毒性水平之前的某个时间，使包含微生物的发酵培养基与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。丁醇分配至所述有机提取剂相，降低了包含微生物的水相中的丁醇浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。为了在技术上和经济上可行，液-液提取需要:提取剂和发酵培养液之间的接触，使得产物醇有效传质到提取剂中；所述提取剂与所述发酵培养液的相分离(发酵过程期间和/或之后)；所述提取剂的有效回收和循环利用；以及所述提取剂经过长期运行之后分配系数最低程度的降低。
[0008]每一个循环，提取剂可随着时间进行而被污染，例如通过作为可水解的淀粉的原料被进料至发酵容器中的生物质中存在的脂质的积累。例如，在葡萄糖转化为丁醇的过程中以30重量％干燥玉米固体加载至发酵容器的液化的玉米醪可产生包含约1.2重量％玉米油的发酵培养液，其通过同时的糖化和发酵产生(所述液化的醪的糖化在发酵过程中通过用于产生葡萄糖的葡糖淀粉酶的添加而发生)。在ISPR过程中，玉米油脂质溶解于用作提取剂的油醇(OA)中可导致脂质浓度随着每次OA的循环利用而积累，这使得产物醇在OA中的分配系数降低，因为OA中的脂质浓度随着每次OA的循环利用而升高。
[0009]此外，未溶解的固体在萃取发酵过程中的存在可不利地影响醇的生产效率。例如，未溶解的固体的存在可降低发酵容器内的传质系数、阻碍发酵容器内的相分离、导致玉米油从未溶解的固体向提取剂中的积累从而导致提取效率随时间降低、因溶剂被限制在固体中并最终作为干酒糟及可溶物(DDGS)被移除而使得溶剂的损失增加、减慢提取剂液滴与发酵培养液的分离和/或导致更低的发酵容器体积效率。
[0010]用于减少萃取发酵中所用提取剂的分配系数的下降的若干方法包括湿磨、分级和固体的移除。湿磨是高成本、多步骤的方法，它将生物质(例如玉米)分离为其关键组分(胚芽、果皮纤维、淀粉和谷蛋白)以便从每一联产品分别地获得价值。该方法提供了纯化的淀粉流；然而，它成本高昂并且包括生物质向其非淀粉组分的分离，而这对于醇的发酵生产是不必要的。分级移除了纤维和包含了研碎全玉米中所存在的大部分脂质的胚芽，产生了具有较高淀粉(胚乳)含量的分级的玉米。干燥分级没有将胚芽与纤维分离，因此它比湿磨更便宜。但是，分级没有移除全部的纤维或胚芽，并且没有导致固体的全部除去。此外，在分级中存在淀粉的一些损失。玉米的湿磨比干燥分级更昂贵，但干燥分级比未分级的玉米的干磨更昂贵。在用于发酵之前从液化的醪中移除固体(包括包含脂质的胚芽)可基本上除去未溶解的固体，例如于2010年6月18日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时申请序列序列号61/356，290所述。然而，如果可降低由脂质污染导致的提取剂分配系数的下降而甚至不用分级或移除基本上全部的未溶解固体，那将会是有利的。将液化的醪中存在的脂质转化为可被用于ISPR中的提取剂 是降低进料至发酵容器的脂质的量的另一种方法，例如均于2010年7月28日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时申请序列号61/368，436和美国临时申请序列号61/368，444所述。
[0011]存在对替代性的萃取发酵方法的持续需求，所述方法使得不必将产物醇在发酵培养基和ISPR提取剂之间进行分配以降低产物醇如丁醇对微生物的毒性效应并且还可减少发酵产物提取剂的分配系数的下降。
[0012]发明概沭
[0013]使在发酵培养基中由微生物产生的醇如丁醇转化为对所述微生物毒性较小的物质可允许对给定的发酵容器体积而言提高醇如丁醇的生产。醇酯可通过使醇在发酵培养基中与羧酸(例如，脂肪酸)和能够使所述醇与所述羧酸酯化的催化剂接触而形成。此外，羧酸可作为醇酯分配进入其中的ISPR提取剂。羧酸可被提供至发酵容器和/或来源于向发酵容器提供可发酵的碳原料的生物质。所述原料中存在的脂质可被催化水解为羧酸，并且相同的催化剂(例如酶)可使所述羧酸与醇(例如丁醇)酯化；脂质还可通过所述催化剂直接发生酯交换以产生醇酯。所述催化剂可在发酵之前被提供至所述原料，或者可在所述原料的提供之前或同时被提供至发酵容器。当催化剂被提供至发酵容器时，通过脂质水解为羧酸和同时发生的羧酸与所述发酵容器中存在的丁醇的酯化作用可获得醇酯。脂质还可通过所述催化剂直接与丁醇发生酯交换以产生醇酯。羧酸和/或并非来源于所述原料的天然的油也可被进料至发酵容器，所述天然的油被水解为羧酸。羧酸和/或并非来源于所述原料的天然的油能够以足够使得包括有机相和水相的两相混合物形成的量被进料至发酵容器中。如此，在一些实施方案中，任何未与醇酯化的羧酸可作为ISPR提取剂或作为其部分。包含醇酯的提取剂可与发酵培养基分离，而醇可从所述提取剂被回收。提取剂可被循环利用至发酵容器。因此，就丁醇的生产而言，例如，丁醇向酯的转化降低了发酵培养基中的游离丁醇浓度，保护了微生物免受提高的丁醇浓度的毒性作用影响。此外，未分级的谷物可被用作原料而不从其中分离脂质，因为脂质可被催化水解为羧酸，从而降低了脂质在ISPR提取剂中积累的速率。
[0014]本发明涉及用于生产丁酯的方法，包括使在发酵过程中产生的丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯；其中所述羧酸在所述发酵过程中以足够产生两相混合物的浓度存在。在一个实施方案中，丁醇的生产和丁酯的生产同时发生或顺序发生。在一个实施方案中，所述发酵过程中的原料包含一种或多种可发酵糖类。在一个实施方案中，所述发酵过程中的原料包含一种或多种来源于玉米粒、玉米棒、作物残留物如玉米壳、玉米秸杆、草、小麦、黑麦、小麦秸杆、大麦、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、从谷物的碾磨获得的组分、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物的可发酵糖类。在一个实施方案中，所述方法还包括提供天然的油和通过使所述油与一种或多种酶接触而使所述天然的油的至少一部分转化为羧酸。在一个实施方案中，所述羧酸包括脂肪酸。在另一个实施方案中，所述羧酸包括12至22个碳。在一个实施方案中，所述羧酸是不同羧酸的混合物。在另一个实施方案中，所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。在一个实施方案中，所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。在另一个实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
[0015]本发明还涉及从原料生产丁醇和丁酯的方法，所述方法包括：（a)提供原料；(b)使所述原料液化以产生包含低聚糖的液化的生物质；（c)分离所述原料浆液以产生包含含低聚糖的含水的流、油流和固体的产物；（d)将所述含水的流添加至包含发酵培养液的发酵容器；(e)使所述含水的流的低聚糖糖化；（f)使存在于所述含水的流中的低聚糖糖化的产物发酵以产生丁醇，并同时使丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯，其中所述羧酸以足够产生两相混合物的浓度存在；并且任选地，步骤（e)和（f)同时发生。在一个实施方案中，所述方法还包括从所述油流获得油和使所述油的至少一部分转化为羧酸。在一个实施方案中，所述原料浆液通过滗析瓶离心、三相卧螺沉降离心、叠片离心、过滤离心、滗析离心、过滤、真空过滤、带式过滤、加压过滤、筛网过滤、筛网分离、格栅、多孔格栅、浮选、水力旋流器、压滤、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器或它们的组合被分离。在另一个实施方案中，所述羧酸包括脂肪酸。在一个实施方案中，所述羧酸包括12至22个碳。在一个实施方案中，所述方法还包括在使所述油的至少一部分转化为羧酸的步骤之前，将所述油添加至发酵容器。在一个实施方案中，所述方法还包括将附加的羧酸添加至发酵容器。在一个实施方案中，所述油在添加附加的羧酸的步骤之后被转化为羧酸。在另一个实施方案中，所述羧酸是玉米油脂肪酸、大豆油脂肪酸或玉米油脂肪酸和大豆油脂肪酸的混合物。在一个实施方案中，从所述油流获得的油包括甘油酯，并且所述一种或多种催化剂使甘油酯水解为脂肪酸。在另一个实施方案中，所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。在一个实施方案中，所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。在一个实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。在一个实施方案中，所述方法还包括用溶剂洗涤所述固体的步骤。在一个实施方案中，所述溶剂选自己烷、异丁醇、异己烷、乙醇、石油馏出物如石油醚或它们的混合物。在另一个实施方案中，所述固体被加工形成动物饲料产品。在一个实施方案中，所述固体被加工形成动物饲料产品。在一个实施方案中，所述动物饲料产品包含一种或多种粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸异丁酯、赖氨酸、中性洗涤剂纤维(NDF)和酸性洗涤剂纤维(ADF)。在另一个实施方案中，所述动物饲料产品还包含一种或多种维生素、矿物质、调味品或着色剂。在一个实施方案中，所述动物饲料产品包含20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0-5重量％的甘油三酯、4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸异丁酯。在一个实施方案中，将所述固体与所述原料浆液分离的步骤通过提高丁醇从发酵培养液至提取剂的液-液传质系数提高了丁醇生产的效率；通过提高用提取剂提取丁醇的效率提高了丁醇生产的效率；通过提高发酵培养液和提取剂之间相分离的速率提高了丁醇生产的效率；通过提高提取剂的回收和循环利用提高了丁醇生产的效率；或通过降低提取剂的流速提高了丁醇生产的效率。
[0016] 本发明还涉及从原料生产丁醇和丁酯的方法，所述方法包括:(a)提供原料；(b)使所述原料液化以产生包含低聚糖的液化的生物质；(c)分离所述原料浆液以产生包含低聚糖和油的流和固体；(d)将所述流添加至包含发酵培养液的发酵容器；(e)使所述流的低聚糖糖化；(f)使存在于所述流中的低聚糖糖化的产物发酵以产生丁醇，并同时使丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯，其中所述羧酸以足够产生两相混合物的浓度存在；并且任选地，步骤(e)和
(f)同时发生。在一个实施方案中，所述方法还包括使所述油的至少一部分转化为羧酸。在一个实施方案中，所述原料浆液通过滗析瓶离心、三相卧螺沉降离心、叠片离心、过滤离心、滗析离心、过滤、真空过滤、带式过滤、加压过滤、筛网过滤、筛网分离、格栅、多孔格栅、浮选、水力旋流器、压滤、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器或它们的组合被分离。在另一个实施方案中，所述羧酸包括脂肪酸。在一个实施方案中，所述羧酸包括12至22个碳。在一个实施方案中，所述方法还包括将油添加至发酵容器。在一个实施方案中，所述方法还包括将附加的羧酸添加至发酵容器。在一个实施方案中，所述油在添加附加的羧酸的步骤之后被转化为羧酸。在一个实施方案中，所述羧酸是玉米油脂肪酸、大豆油脂肪酸或玉米油脂肪酸和大豆油脂肪酸的混合物。在一个实施方案中，所述油包括甘油酯，并且所述一种或多种催化剂使甘油酯水解为脂肪酸。在一个实施方案中，所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。在一个实施方案中，所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。在一个实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。在一个实施方案中，所述方法还包括用溶剂洗涤所述固体的步骤。在一个实施方案中，所述溶剂选自己烷、异丁醇、异己烷、乙醇、石油馏出物如石油醚或它们的混合物。在一个实施方案中，所述固体被加工形成动物饲料产品。在一个实施方案中，所述固体被加工形成动物饲料产品。在一些实施方案中，所述动物饲料产品包含一种或多种粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸异丁酯、赖氨酸、中性洗涤剂纤维(NDF)和酸性洗涤剂纤维(ADF)。在一些实施方案中，所述动物饲料产品还包含一种或多种维生素、矿物质、调味品或着色剂。在一些实施方案中，所述动物饲料产品包含20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0-5重量％的甘油三酯、。4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸异丁酯。在一些实施方案中，将所述固体与所述原料浆液分离的步骤，通过提高丁醇从发酵培养液至提取剂的液-液传质系数提高了丁醇生产的效率；通过提高用提取剂提取丁醇的效率提高了丁醇生产的效率；通过提高发酵培养液和提取剂之间相分离的速率提高了丁醇生产的效率；通过提高提取剂的回收和循环利用提高了丁醇生产的效率；或通过降低提取剂的流速提高了丁醇生产的效率。
[0017]本发明还涉及用于生产丁醇的方法，所述方法包括（a)使在发酵过程中产生的丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯；其中所述羧酸在所述发酵过程中以足够产生包括水相和包含丁酯的有机相的两相混合物的浓度存在；(b)使包含丁酯的有机相与水相分离；和（c)从丁酯回收丁醇。在一些实施方案中，从丁酯回收丁醇包括使所述酯水解为羧酸和丁醇。在一些实施方案中，所述丁酯在水解催化剂的存在下被水解。在一些实施方案中，所述丁酯在水的存在下被水解，并且其中所述水解催化剂包括酸催化剂、有机酸、无机酸、水溶性酸或水不溶性酸。在一些实施方案中，所述水解催化剂包括能够使所述丁酯水解以形成羧酸和丁醇的酶。在一些实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。在一些实施方案中，酶反应条件更有利于酶水解而非酯化作用。在一些实施方案中，所述酶反应条件包括共溶剂。在一些实验方案中，脂肪酸丁酯、脂肪酸、异丁醇和水在所述共溶剂中可溶，并且其中游离脂肪酸不与所述共溶剂反应。在一些实验方案中，所述共溶剂选自丙酮、叔-丁醇、2-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-戊醇和3-甲基-3-戊醇。在一些实验方案中，所述酶反应条件包括终产物的移出。在一些实验方案中，所述终产物是异丁醇或脂肪酸。在一些实验方案中，异丁醇通过真空蒸馏、全蒸发、选择性渗透过滤或气体鼓泡搅拌被移出。在一些实验方案中，脂肪酸通过沉淀、选择性渗透过滤或电泳被移出。在一些实施方案中，所述水解反应在反应容器中发生。在一些实施方案中，从丁酯回收丁醇包括使所述丁酯酯交换为丁醇和脂肪酸烷基酯或酰基甘油酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或脂肪酸丙酯。在一些实施方案中，所述方法还包括提供天然的油和通过使所述油与一种或多种酶接触而使所述天然的油的至少一部分转化为羧酸。在一些实施方案中，所述酶是能够使丁酯水解或酯交换以形成丁醇的酶。在一些实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。在一些实施方案中，所述羧酸包括脂肪酸。在一些实施方案中，所述羧酸具有在12至22个碳范围内的碳链长度。在一些实施方案中，至少约10%的丁醇从丁酯回收。在一些实施方案中，至少约50%的丁醇从丁酯回收。在一些实施方案中，至少约90%的丁醇从丁酯回收。在一些实施方案中，羧酸从丁酯回收。在一些实施方案中，所述方法还包括从发酵罐移出丁醇作为提取剂流；和将所述提取剂流添加至两个或更多个蒸馏塔的步骤。在一些实施方案中，所述蒸馏塔是具有蒸汽加热的再沸器的超大气压力蒸馏塔。在一些实施方案中，所述方法还包括步骤：从所述蒸馏塔回收水和溶剂；和循环利用所述水和溶剂。在一些实施方案中，所述方法还包括从蒸馏过程回收热；和循环利用所述热以蒸发水的步骤。
[0018]本发明还涉及从原料生产丁醇和丁酯的方法，所述方法包括：（a)提供原料；(b)使所述原料液化以产生原料浆液；（c)分离所述原料浆液以产生包含含水的流、油流和固体的产物； （d)将所述含水的流添加至包含发酵培养液的发酵容器；（e)使所述含水的流糖化；（f)使糖化的含水的流发酵以产生丁醇，并同时使丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯，其中所述羧酸以足够产生两相混合物的浓度存在；(g)使包含丁酯的有机相与水相分离；和(h)从丁酯回收丁醇；并且任选地，步骤(e)和(f)同时发生。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述油流获得油和使所述油的至少一部分转化为羧酸。在一些实施方案中，所述原料浆液通过离心、过滤或滗析被分离。在一些实施方案中，所述羧酸包括脂肪酸。在一些实施方案中，所述羧酸具有在12至22个碳范围内的碳链长度。在一些实施方案中，所述方法还包括在使所述油的至少一部分转化为羧酸的步骤之前，将所述油添加至发酵容器。在一些实施方案中，所述方法还包括将附加的羧酸添加至发酵容器。在一些实施方案中，所述油在添加附加的羧酸的步骤之后被转化为羧酸。在一些实施方案中，所述羧酸是玉米油脂肪酸、大豆油脂肪酸或玉米油脂肪酸和大豆油脂肪酸的混合物。在一些实施方案中，从所述油流获得的油包括甘油酯，并且所述一种或多种催化剂使甘油酯水解为脂肪酸。在一些实施方案中，所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。在一些实施方案中，所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。在一些实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。在一些实施方案中，所述固体被加工以形成动物饲料产品。在一些实施方案中，从丁酯回收丁醇包括使所述酯水解为羧酸和丁醇。在一些实施方案中，所述丁酯在水解催化剂的存在下被水解。在一些实施方案中，所述丁酯在水的存在下被水解，并且其中所述水解催化剂包括酸催化剂、有机酸、无机酸、水溶性酸或水不溶性酸。在一些实施方案中，所述水解催化剂包括能够使所述丁酯水解以形成羧酸和丁醇的酶。在一些实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。在一些实施方案中，所述水解反应在反应容器中发生。在一些实施方案中，从丁酯回收丁醇包括使所述丁酯酯交换为丁醇和脂肪酸烷基酯或酰基甘油酯。在一些实施方案中，所述脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或脂肪酸丙酯。在一些实施方案中，所述方法还包括提供天然的油和通过使所述油与一种或多种酶接触而使所述天然的油的至少一部分转化为羧酸。在一些实施方案中，所述酶是能够使丁酯水解或酯交换以形成丁醇的酶。在一些实施方案中，所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
[0019]在一些实施方案中，发酵方法可包括:提供从生物质获得的含水的原料流，其中所述含水的原料流包括水、来源于生物质的可发酵碳源和油；使所述含水的原料流与催化剂接触，从而所述油的至少一部分被水解为游离脂肪酸以形成包含所述游离脂肪酸和催化剂的经催化剂处理的原料流；使所述经催化剂处理的原料流在发酵容器中与发酵培养液接触；使所述可发酵碳源在发酵.容器中发酵以产生产物醇；和使所述产物醇在发酵过程中与所述游离脂肪酸和催化剂接触以便催化所述游离脂肪酸和产物醇在发酵容器中的酯化作用以产生脂肪酸的醇酯。在一些实施方案中，使所述原料流与催化剂和发酵培养液接触的步骤以及发酵和使产物醇与所述游离脂肪酸和催化剂接触的步骤可以同时发生。在一些实施方案中，所述产物醇是丁醇，并且所述脂肪酸的醇酯是脂肪酸的丁酯。
[0020]本发明提供了用于在发酵过程中从发酵培养基移出醇的方法，所述方法包括:提供包括在所述发酵培养基中生产醇的微生物的发酵培养基；和使所述发酵培养基在发酵过程中与羧酸和能够使所述醇与所述羧酸酯化以形成醇酯的催化剂接触。在一些实施方案中，由所述微生物生产的醇是丁醇，并且所述醇酯是丁酯。在一些实施方案中，所述发酵培养基与在所述发酵培养基中基本上不溶的羧酸和能够使所述醇与所述羧酸酯化以形成醇酯的催化剂接触。[0021]本发明还提供了用于在发酵过程中生产脂肪酸的醇酯的方法，所述方法包括：提供包含醇、可发酵碳源和游离脂肪酸的发酵培养基；和使所述发酵培养基与一种或多种能够使所述游离脂肪酸与所述醇酯化的酶接触，从而所述游离脂肪酸与所述醇酯化以形成脂肪酸的醇酯。在一些实施方案中，所述可发酵碳源来源于生物质。在一些实施方案中，所述发酵培养基的微生物是重组微生物。在一些实施方案中，所述醇是丁醇，并且所述脂肪酸的醇酯是脂肪酸的丁酯。
[0022]在另一个实施方案中，用于生产产物醇的方法可包括提供包含水、可发酵碳源和油的生物质原料，其中所述油包括酰基甘油酯；使所述生物质原料液化以产生包含低聚糖的液化的生物质；使所述生物质原料或所述液化的生物质与包含一种或多种能够使所述酰基甘油酯的至少一部分转化为游离脂肪酸的酶的组合物接触，所述游离脂肪酸由此形成提取剂，所述一种或多种酶还能够使游离脂肪酸与产物醇酯化为脂肪酸的醇酯；使所述液化的生物质与能够使低聚糖转化为可发酵糖的糖化酶接触；使所述液化的生物质与能够使所述可发酵糖转化为产物醇的重组微生物接触，从而包含产物醇的发酵产物被生产；使所述产物醇与所述游离脂肪酸和所述一种或多种酶接触以便催化所述游离脂肪酸和产物醇的酯化作用以产生脂肪酸的醇酯；和使所述发酵产物与提取剂接触。在实施方案中，与提取剂的接触导致包括水相和提取剂相的两相混合物的形成，和所述脂肪酸的醇酯分配至所述提取剂相中从而形成包含酯的提取剂相。在一些实施方案中，所述产物醇是丁醇，并且所述脂肪酸的醇酯是脂肪酸的丁酯。
[0023]在另一个实施方案中，用于生产产物醇的方法可包括提供包含水、可发酵碳源和油的生物质原料，其中所述油包括酰基甘油酯；使所述生物质原料液化以产生包含低聚糖的液化的生物质；使所述液化的生物质与包含一种或多种能够使所述酰基甘油酯的至少一部分转化为游离脂肪酸的酶的组合物接触，所述一种或多种酶还能够使游离脂肪酸与产物醇酯化为脂肪酸的醇酯；使所述液化的生物质与能够使低聚糖转化为可发酵糖的糖化酶接触；使糖化的生物质与能够使所述可发酵糖在发酵过程中转化为产物醇的重组微生物接触，从而产生包含产物醇的发酵培养基；使所述发酵培养基在发酵过程中与羧酸提取剂接触，其中所述发酵培养基包含一种或多种能够使游离脂肪酸与产物醇酯化形成脂肪酸的醇酯的酶。在本方法的附加的实施方案中，所述发酵培养基与在所述发酵培养基中基本上不溶的羧酸和能够使所述醇与所述羧酸酯化以形成醇酯的催化剂接触。在本方法的其他实施方案中，由所述微生物生产的醇是丁醇，并且所述醇酯是丁酯。
[0024]本发明还提供了从原料生产产物醇的方法，所述方法包括：使原料中的淀粉或可发酵碳源液化以产生具有低聚糖的浆液；离心所述原料浆液以产生包含（i)包含低聚糖的水层、（ii)油层和（iii)固体的离心产物；将所述水层进料至包含发酵培养液的发酵容器；和使所述水层发酵以生产产物醇。然后使所述产物醇与所述羧酸和催化剂接触，从而所述羧酸与产物醇酯化，形成醇酯。在一些实施方案中，所述油是植物来源的油。在其他实施方案中，所述产物醇是丁醇，并且所述羧酸的醇酯是脂肪酸的丁酯。
[0025]在一些实施方案中，用于生产产物醇的方法包括：提供包含水、淀粉和/或可发酵碳源的分级的生物质原料，并且在所述生物质的分级仅剩余残留量的油，所述残留的油包括酰基甘油酯；使所述分级的生物质原料液化以产生包含低聚糖的液化的分级的生物质 ；使所述液化的分级的生物质与包含一种或多种能够使所述残留的酰基甘油酯的至少一部分转化为游离脂肪酸的酶的组合物接触，所述一种或多种酶还能够使游离脂肪酸与产物醇酯化以形成脂肪酸的醇酯；使所述液化的分级的生物质与能够使低聚糖转化为可发酵糖的糖化酶接触；使糖化的生物质与能够使所述可发酵糖在发酵过程中转化为产物醇的重组微生物接触，从而产生包含产物醇的发酵培养基；使所述发酵培养基在发酵过程中与羧酸提取剂接触，其中所述发酵培养基包含一种或多种能够使游离脂肪酸与产物醇酯化形成脂肪酸的醇酯的酶。在本方法的附加的实施方案中，所述发酵培养基与所述发酵培养基中的羧酸和能够使所述醇与所述羧酸酯化以形成醇酯的催化剂接触。在另一个实施方案中，所述羧酸可以是在所述发酵培养基中基本上不溶的。在本方法的其他实施方案中，由所述微生物生产的醇是丁醇，并且所述醇酯是丁酯。
[0026]本发明还提供了组合物，所述组合物包含:从生物质形成并且包含水和可发酵糖的醪；能够使游离脂肪酸与醇酯化为脂肪酸烷基酯并且任选地能够使酰基甘油酯水解为游离脂肪酸的催化剂；醇；游离脂肪酸；和从所述游离脂肪酸与所述醇通过所述催化剂的酯化作用原位形成的脂肪酸醇酯。在一些实施方案中，所述醇是丁醇并且所述脂肪酸醇酯是脂肪酸丁酯。
[0027]本发明还提供了发酵培养液，所述发酵培养液包含:能够生产醇的重组微生物；可发酵碳源；和脂肪酸醇酯，其中所述脂肪酸醇酯是在发酵过程中产生的。在一些实施方案中，所述重组微生物能够生产丁醇。在一些实施方案中，所述脂肪酸醇酯是脂肪酸丁酯。在一些实施方案中，所述可发酵碳源包括糖。在一些实施方案中，所述可发酵碳源包括甲烷，所述重组微生物能够生产甲醇，并且所述脂肪酸醇酯是脂肪酸甲酯。
[0028]本文还提供了对于产物醇的生产有用的重组酵母细胞。在实施方案中，本文所公开的重组宿主细胞可以是对遗传修饰和重组基因的表达有用的任何细菌、酵母或真菌宿主。在其他实施方案中，重组宿主细胞可以是下列属的成员:梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、志贺氏菌属(Shigella)、红球 菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽胞杆菌属(PaenibaciIIus)、节杆菌属(Arthrobacter )、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)或糖酵母属(Saccharomyces)。在其他实施方案中，所述宿主细胞可以是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、白假丝酵母(Candida albicans)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、大肠杆菌(E.coli)或植物乳杆菌(L.PIantarum)ο在另一些实施方案中，所述宿主细胞是酵母宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是糖酵母属(Saccharomyces)的成员。在一些实施方案中，所述宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)。啤酒糖酵母（S. cerevisiae)是本领域已知的，并且可得自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD)、皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心（CBS)真菌生物多样性中心（Centraalbureau voorSchimmelcultures(CBS)Fungal Biodiversity Centre)、LeSaffre、Gert Strand AB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、Martrex 和 Lallemand0 啤酒糖酵母(S. cerevisiae)包括但不限于 BY4741、CEN. PK113-7D、Ethanoi Red酵母、 Gert Strand
Prestige Turbo 酵母、Ferm Pro? 酵母、Bio-FeiTO? XR 酵母、Gert Strand Distillers
酵母、FerMax? Green 酵母、FerMax? Gold 酵母、Thermosac# 酵母、BG-1、PE-2、CAT-UCBS7959、CBS7960 和 CBS7961。
[0029]还提供了生产异丁醇的方法，所述方法包括：提供包含异丁醇生物合成途径的重组宿主细胞 ，其中至少一种催化α-酮异戊酸至异丁醛的底物至产物的转化的酶或催化异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化的酶由整合在其染色体中的异源性多核苷酸编码；和在异丁醇被生产的条件下，使所述重组宿主细胞与可发酵碳源接触以形成发酵培养液。在一些实施方案中，所述方法还包括：添加提取剂以形成两相混合物。在其他实施方案中，所述提取剂包括羧酸。在一些实施方案中，所述提取剂包括脂肪酸。在其他实施方案中，所述方法还包括添加能够催化异丁醇与所述羧酸的酯化作用的酯化酶。
[0030]本文还提供了方法，所述方法包括：提供包含产物醇、水、可发酵碳源和生产所述产物醇的微生物的发酵培养基；使所述发酵培养基在发酵过程中与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物；和使所述发酵培养基与羧酸和能够使所述羧酸与所述产物醇酯化的酶接触。在一些实施方案中，所述提取剂包括所述羧酸。在一些实施方案中，所述羧酸通过来自生物质原料的油的水解产生。在一些实施方案中，所述可发酵的碳和所述羧酸来源于相同的生物质原料来源。在一些实施方案中，所述羧酸包括具有12至22个碳的饱和的、单不饱和的、多不饱和的羧酸、以及它们的混合物。在一些实施方案中，使所述发酵培养基与提取剂和与羧酸和酶的接触同时发生。在一些实施方案中，所述微生物是经遗传修饰的微生物(例如，重组微生物或宿主细胞如重组酵母细胞)。
[0031]本文还提供了组合物，所述组合物包含：ΡΝΥ1504、ΡΝΥ2205或重组宿主细胞；提取剂；和任选的酯化酶。本文还提供了组合物，所述组合物包含ΡΝΥ1504、ΡΝΥ2205或重组宿主细胞和丁酯。
[0032]本文还提供了 ΡΝΥ1504、ΡΝΥ2205或其他重组酵母细胞和包含用于生产异丁醇的重组酵母细胞的组合物的使用。
[0033]附图简沭
[0034]并入本文并成为说明书的一部分的附图示出了本发明，并且与说明书一起进一步用来解释本发明的原理并使得本领域的技术人员能够利用本发明。
[0035]图I示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中针对醇的酯化作用的催化剂与羧酸和/或天然的油一起被提供至发酵容器。
[0036]图2示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中使用催化剂将天然的油转化为羧酸，并且所述羧酸和所述催化剂被提供至发酵容器。[0037]图3示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中液化的生物质在发酵之前与用于脂质水解的催化剂接触。
[0038]图4示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中液化并糖化的生物质在发酵之前与用于脂质水解的催化剂接触。
[0039]图5示意性地示出了本发明的示例性方法和体系，其中一定量的脂质和未溶解的固体在发酵之前从液化的生物质移出，并且在其中使用催化剂将所移出的脂质转化为羧酸，并且所述羧酸和所述催化剂被提供至发酵容器。
[0040]图6显示了通过以蔗糖作为碳源的发酵生产的异丁醇的水和溶剂相浓度。水相滴度（组A)以g/L报道，而溶剂相物质（异丁醇，组B和异丁醇作为FABE，组C。组D是溶剂相中的总的异丁醇）以重量百分比报道。
[0041]图7显示了异丁醇随时间的有效滴度，g/L。在该实施例中的有效滴度如正文中所述计算，基于接种之后含水的发酵器肉汤的初始体积计。
[0042]图8显示了糖的消耗以葡萄糖等同物随时间报道 。
[0043]发明详沭
[0044]除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾以本专利申请(包括其定义）为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。
[0045]除非另外指明，当本文中使用下列缩略语时，它们具有下列含义：
[0046]ADH醇脱氢酶
[0047]ALS乙酰乳酸合酶
[0048]AQ含水的级分
[0049]BuO-COFA玉米油脂肪酸的丁酯
[0050]CALB南极假丝酵母（Candida antarctica)脂肪酶 B
[0051]COFA玉米油脂肪酸
[0052]DDGS干酒糟及可溶物
[0053]DG甘油二酯
[0054]DHAD二羟酸脱水酶
[0055]EOR运行结束
[0056]EtOH乙醇
[0057]EtO-COFA玉米油脂肪酸的乙酯
[0058]FABE脂肪酸丁酯
[0059]FAEE脂肪酸乙酯
[0060]FAME脂肪酸甲酯
[0061]FFA游离脂肪酸
[0062]FOA氟乳清酸
[0063]HADH马肝脏乙醇脱氢酶
[0064]IBA异丁醇
[0065]i-BuOH异丁醇[0066]i-BuO-COFA 玉米油脂肪酸的异丁酯
[0067]i-BuO-oleate 油酸异丁酯
[0068]i-PrOH异丙醇
[0069]i-PrO-COFA 玉米油脂肪酸的异丙酯
[0070]ISPR原位产物移出
[0071]KARI酮醇酸还原异构酶
[0072]KivD酮异戊酸脱羧酶
[0073]MAG单酰甘油
[0074]MeBOH2_ 甲基-1-丁醇
[0075]MeBO-COFA 玉米油脂肪酸的2_甲基_1_ 丁酯
[0076]MeOH甲醇
[0077]MeO-COFA玉米油脂肪酸的甲酯
[0078]MG甘油单酯
[0079]n-BuOH正丁醇
[0080]OA油醇
[0081]ORG有机级分
[0082]PenOH1-戊醇
[0083]PenO-COFA 玉米油脂肪酸的1-戊酯
[0084]PrOH1-丙醇
[0085]PrO-COFA玉米油脂肪酸的1-丙酯
[0086]SOFA大豆油脂肪酸
[0087]SSF同时糖化和发酵
[0088]t-BuOH叔-丁醇
[0089]TG甘油三酯
[0090]3M3P3-甲基-3-戊醇
[0091 ] 为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。
[0092]如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的‘或’，而不是指排他性的‘或’。例如以下任何一个均表示满足条件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
[0093]同样，涉及元素或组分实例(即次数)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0094]如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如专利申请所述的所有可能的实施方案。
[0095]如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化:在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”指在报告数值的10%范围内，或者在报告数值的5%范围内。
[0096]如本文所用，“生物质”指包含可水解的多糖的天然产物，所述可水解的多糖提供可发酵糖，包括来源于天然来源如玉米、甘蔗、小麦、纤维素或木质纤维素材料以及包含纤维素、半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖、二糖和/或单糖、以及它们的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物质还可包含附加组分如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源，或者生物质可包括来源于多于一种的来源的混合物。例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸杆的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物能源作物、农业残留物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤渣、庭院垃圾、废弃糖、木材和林业垃圾。生物质的实例包括但不限于:玉米粒、玉米棒、作物残余物如玉米壳、玉米秸杆、草、小麦、黑麦、小麦秸杆、大麦、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、获取自谷物、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木及灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥、以及它们的混合物的研磨物的组分。例如,可通过本领域已知的任何加工方法,例如研磨、处理和/或液化,利用发酵加工生物质以从生物质中形成醪、汁液、糖蜜或水解产物，并且它们包含可发酵糖并可包含一定量的水。例如，可通过本领域技术人员已知的任何方法来加工纤维素和/或木质纤维素生物质以获得包含可发酵糖的水解产物。尤其有用的是如美国专利申请公布2007/0031918A1所公开的低氨预处理，该文献以引用方式并入本文。纤维素和/或木质纤维素生物质的酶促糖化通常利用酶聚生体来降解纤维素和半纤维素以产生包含糖的水解产物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(适用于纤维素和/或木质纤维素生物质的糖化酶综述于Lynd等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.66:506-577, 2002)中。 [0097]醪、汁液、糖蜜或水解产物可包括原料12和原料浆液16，如本文所述。可通过本领域已知的任何加工方法，例如研磨、处理和/或液化，利用发酵加工生物质以从生物质中形成或衍生出含水的原料流，并且其包含可发酵的碳底物(例如糖)并可包含水。含水的原料流可包括原料12和原料浆液16，如本文所述。
[0098]如本文所用，“生物质产率”是指所生产的生物质克数(即，细胞生物质生产)每克所生产的碳底物。
[0099]如本文所用，“原料”是指发酵过程中的原料，所述原料包含具有或不具有未溶解固体的可发酵碳源，并且如果适用，所述原料在通过进一步加工(例如通过液化、糖化或其它方法)已经从淀粉中释放可发酵碳源或从复糖降解中获取可发酵碳源之前或之后包含可发酵碳源。原料包括或来源于生物质。适合的原料包括但不限于黑麦、小麦、玉米、玉米醪、甘蔗、甘蔗醪、大麦、纤维素材料、木质纤维素材料或它们的混合物。当涉及“原料油”时，应当理解该术语包括从给定原料产生的油。
[0100]如本文所用，“发酵培养基”是指水、糖、溶解固体、任选的生产醇的微生物、产物醇和发酵容器内具有的所有其他物质组分的混合物，其中产物醇通过在微生物的存在下使糖反应生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有时，如本文所用，术语“发酵培养液”和“发酵混合物”可与“发酵培养基”同义使用。[0101]如本文所用，“可发酵碳源”或“可发酵的碳底物”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的碳源。适当的可发酵碳源包括但不限于单糖，如葡萄糖或果糖；二糖，如乳糖和蔗糖；低聚糖；多糖如淀粉或纤维素；C5糖如木糖和阿拉伯糖；一碳底物包括甲烷；以及它们的混合物。
[0102]如本文所用，“可发酵糖”是指能够由本文所公开的微生物代谢以产生发酵醇的一种或多种糖。
[0103]如本文所用，“发酵容器”指在其中进行发酵反应的容器，由此产物醇如丁醇由糖制成。
[0104]如本文所用，“液化容器”是指液化在其中发生的容器。液化是低聚糖在其中从原料中释放的过程。在一些原料为玉米的实施方案中，低聚糖在液化过程中从玉米淀粉内容物中释放。
[0105]如本文所用，“糖化容器”是指糖化(即，低聚糖被分解为单糖）在其中发生的容器。当发酵和糖化同时发生时，所述糖化容器和所述发酵容器可以是相同容器中的一个。
[0106]如本文所用，“糖”是指低聚糖、二塘、单糖和/或它们的混合物。术语“糖类”还包括碳水化合物，包括淀粉、葡聚糖、糖原、纤维素、戊聚糖、以及糖。
[0107]如本文所用，“糖化酶”是指能够使多糖和/或低聚糖，例如糖原或淀粉的α -I, 4-糖苷键，水解的一种或多种酶。糖化酶还可包括能够使纤维素或木质纤维素材料水解的酶。
[0108]如本文所用，“未溶解的固体”是指原料的不可发酵的部分，例如，胚芽、纤维和谷蛋白。例如，所述原料的不可发酵的部分包括保持为固体并且可从发酵培养液吸收液体的原料的部分。
[0109]如本文所用，干酒糟及可溶物（DDGS)是指来自原料或生物质的发酵(例如，谷物或谷物混合物产生产物醇的发酵）的联产物或副产物。在一些实施方案中，DDGS还可以指从制备产物醇(例如，丁醇、异丁醇等）的过程产生的动物饲料产品。
[0110]如本文所用，“产物醇”是指可在利用生物质作为可发酵的碳底物来源的发酵过程中由微生物产生的任何醇。产物醇包括但不限于C1-C8烷基醇。在一些实施方案中，所述产物醇是C2-C8烷基醇。在其他实施方案中，所述产物醇是C2-C5烷基醇。应当理解，C1-C8烷基醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇。同样地，C2-C8烷基醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇、戊醇。“醇”在本文中也被用于指产物醇。
[0111]如本文所用，“丁醇”具体是指单独的丁醇异构体I-丁醇（I-BuOH)、2_ 丁醇(2-BuOH)、叔-丁醇(t-BuOH)和 / 或异丁醇(iBuOH 或 i-BuOH 或 I-BU0H，也被称为 2-甲基-I-丙醇），或它们的混合物。有时，当涉及丁醇的酯时，术语“丁酯”和“丁醇酯”可互换使用。
[0112]如本文所用，“丙醇”是指丙醇异构体异丙醇或I-丙醇。
[0113]如本文所用，“戊醇”是指戊醇异构体I-戊醇、3-甲基-I- 丁醇、2-甲基-I- 丁醇、2，2- 二甲基-I-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2- 丁醇或2-甲基-2- 丁醇。
[0114]如本文所用，术语“醇 等同物”是指通过完全的醇酯的水解和随后对来自一定量的醇酯的醇的回收，将会获得的醇的重量。
[0115]如本文所用，术语“水相滴度”是指发酵培养液中特定醇(例如丁醇）的浓度。[0116]如本文所用，术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇(例如丁醇)或通过醇的酯化作用产生的醇酯的醇等同物的总量。例如，单位发酵体积中丁醇的有效滴度包括：（i)发酵培养基中的丁醇量；（ii)由有机萃取剂回收的丁醇量；（iii)如果利用汽提，由气相回收的丁醇量；和（iv)有机相或水相中的丁酯的醇等同物。[0117]如本文所用，术语“有效速率”是指有效滴度除以发酵时间。
[0118]如本文所用，术语“有效收率”是指总的产物醇克数每克消耗的葡萄糖。
[0119]如本文所用，“原位产物移出”是指从诸如发酵的生物过程中选择性移出特定发酵产物以随着产物的产生控制生物过程中的产物浓度。
[0120]如本文所用，“提取剂”或“ISPR提取剂”是指用于提取任何产物醇如丁醇，或用于提取通过催化剂从产物醇和羧酸或脂质产生的任何产物醇酯的有机溶剂。有时，如本文所用，术语“溶剂”可与“提取剂”同义使用。就本文所述的过程而言，提取剂是与水不混溶的。
[0121]术语“与水不混溶的”或“不溶的”是指化学组分如提取剂或溶剂不能够以形成单一液相的形式与水溶液如发酵培养液混合。
[0122]如本文所用，术语“水相”是指通过使发酵培养液接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述的包括发酵提取的过程的实施方案中，术语“发酵培养液”具体地指两相发酵提取中的水相。
[0123]如本文所用，术语“有机相”是指通过使发酵培养液接触与水不混溶的有机提取剂而获得的两相混合物中的非水相。
[0124]如本文所用，术语“羧酸”是指具有化学通式-COOH的任何有机化合物，其中碳原子通过双键与氧原子键合形成羰基（-C=O)并且通过单键形成羟基（-0H)。羧酸可以是质子化的羧酸的形式、羧酸的盐的形式(例如，铵盐、钠盐或钾盐）或是质子化的羧酸和羧酸的盐的混合物。术语羧酸可以描述单种化学物质(例如，油酸)，或者是如可通过例如生物质来源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂的水解产生的脂肪酸的混合物。
[0125]如本文所用，术语“脂肪酸”是指具有C4-C28碳原子（通常是C12-C24碳原子）的、饱和或不饱和的羧酸(例如，脂肪族一元羧酸)。脂肪酸还可以是支化的或非支化的。脂肪酸可以以酯化的形式来源于或包含于动物或植物的脂肪、油或蜡中。脂肪酸可以以甘油酯的形式天然存在于脂肪中，或者可通过脂肪的水解或通过合成获得。术语脂肪酸可以描述单种化学物质或脂肪酸的混合物。此外，术语脂肪酸还包括游离脂肪酸。
[0126]如本文所用，术语“脂肪醇”是指具有C4-C22碳原子的脂族链的醇，所述脂族链为饱和或不饱和的。
[0127]如本文所用，术语“脂肪醛”是指具有C4-C22碳原子的脂族链的醛，所述脂族链为饱和的或不饱和的。
[0128]如本文所用，术语“脂肪酰胺”是指具有C4-C22碳原子的长脂肪链的酰胺，所述脂族链为饱和的或不饱和的。
[0129]如本文所用，术语“脂肪酸酯”是指具有C4-C22碳原子的长脂族链的酯，所述脂族链为饱和的或不饱和的。
[0130]如本文所用，“天然的油”是指从植物(例如生物质）或动物获得的脂质。如本文所用，“植物来源的油”特别地指从植物获得的脂质。有时，“脂质”可以与“油”和“酰基甘油酯”同义使用。天然的油包括但不限于牛油、玉米、卡诺拉、癸/辛酸的甘油三酯、蓖麻、椰子、棉籽、鱼、霍霍巴油、猪油、亚麻籽、牛蹄、奥蒂、棕榈、花生、油菜籽、水稻、红花、大豆、向日葵、桐树、麻风树和植物油共混物。
[0131]如本文所用，术语“分离”与“回收”同义，并且是指从初始混合物中移除化合物以获得纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。
[0132]如本文所用，术语“丁醇生物合成途径”是指产生1- 丁醇、2- 丁醇或异丁醇的酶途径。
[0133]如本文所用，术语“1-丁醇生物合成途径”是指从乙酰-辅酶A (acetyl-CoA)产生1-丁醇的酶途径。
[0134]如本文所用，术语“2-丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生2-丁醇的酶途径。
[0135]如本文所用，术语“异丁醇生物合成途径”是指从丙酮酸产生异丁醇的酶途径。
[0136]术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5’非编码序列)和编码序列后的调节序列(3’非编码序列)。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”是指包含天然地不一起存在的调控和编码序列的非天然的任何基因(即，它是从其天然状态被修饰的或是来自另外的来源的)。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外源基因”或“异源基因”指宿主生物中通常不作为天然基因存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。外源基因可包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。
[0137]如本文所用，术语“编码区”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5’.非编码序列)、中间或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
[0138]如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区域的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区域的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。密码子优化是本领域内的普通技术。
[0139]术语“多核苷酸”旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建体，例如，信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。如本文所用，“基因”是多核苷酸。多核苷酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5’和3’序列以及编码序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可以是非修饰的RNA或DNA,或修饰的RNA或DNA(例如，异源性DNA)。例如，多核苷酸可由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地或代谢地改性的形式。
[0140]多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。
[0141]如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸）通过酰胺键(也被称为肽键）线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的链，并且不涉及产物的特定长度。因此，定义“多肽”包括用于指两个或更多个氨基酸的单链或多链的肽、二肽、三肽、低聚肽、“蛋白质、” “氨基酸链、”或任何其他术语，并且术语“多肽”可用于取代任何这些术语或与它们互换使用。一条多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由一条指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。
[0142]以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物拟为不在其自然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽可从它原生的或天然的环境中去除。为了本发明的目的，在宿主细胞中重组产生的多肽和表达的蛋白质被认为是分离的，即为天然的或重组的多肽，其已通过任何适合的技术被分离、分馏或部分地或充分地纯化。
[0143]如本文所用，“重组微生物”是指通过重组DNA技术的使用（例如,通过工程化宿主细胞以包含生物合成途径如用以产生醇如丁醇的生物合成途径）被改造的微生物如细菌和酵母。
[0144]本发明满足了对替代性的萃取发酵方法的需求，所述方法使得不必将产物醇在发酵培养基和ISPR提取剂之间的分配作为降低产物醇(例如丁醇）对微生物的毒性效应的手段。通过提供用于生产醇如丁醇的方法，它还满足了使发酵产物ISPR提取剂分配系数的降低减少的需求，在所述方法中，产物醇被转化为可对微生物毒性更低的醇酯，并且其中实现了发酵产物提取剂分配系数的降低随之而来的减少，导致了醇(作为游离的醇和可在从发酵培养基分离之后被转化回醇的醇酯的组合)的产率的改善。此外，本发明提供了替代性的醇产物移出方法的缺点的解决办法，使得本文的方法可与现有的方法(例如，固体移除）相结合以提供具有经济和环保优势的改进的产物移出。如此，本发明提供了另外的相关优点，如通过以下实施方案的描述将显而易见的。
[0145]本发明提供了通过使醇与羧酸酯化和从发酵培养基提取所产生的醇酯，从发酵培养基移出醇的方法，所述醇随后可从所述醇酯回收。所述酸可以作为游离脂肪酸被直接添加至发酵培养基，或者可以来源于油。本发明还提供了通过使来源于原料的油水解为羧酸，从醇发酵过程移除或减少油的方法，所述羧酸可被用于与醇的酯化作用和/或作为ISPR提取剂或ISPR提取剂的组分用于提取醇酯。
[0146]当由酶如脂肪酶催化时，降低反应体系中存在的水的量，或采用仅使用一种或多种非水性溶剂的反应体系，对于醇与羧酸的酯化作用通常是必需的。本文描述了在可发酵碳源用以产生产物醇的发酵过程中，脂肪酶可有效地催化产物醇与羧酸的酯化作用这一令人惊讶的发现。本文还描述了产物醇与羧酸在发酵过程中的酯化作用可提供发酵效果的改善这一令人惊讶的发现。例如，通过随着其生产以酯的形式捕获产物醇(例如丁醇)，有效地降低了产物醇在水相中的浓度，并因此减轻了所述产物醇对葡萄糖的消耗和产物的生产的毒性效应。
[0147]本发明将参照附图加以描述。 图I展示了按照本发明的实施方案，用于生产发酵的醇如乙醇或丁醇的示例性工艺流程图。如图所示，原料12可被引入液化容器10的入口并液化以产生原料浆液16。原料12包含提供可发酵的碳底物(例如，可发酵糖如葡萄糖)的可水解的多糖，并且可以是生物质，例如但不限于黑麦、小麦、甘蔗或玉米，或者可来源于生物质。在一些实施方案中，原料12可以是分级的生物质的一种或多种组分，在其他实施方案中，原料12可以是磨碎的、未分级的生物质。在一些实施方案中，原料12可以是玉米，例如干燥、磨碎、未分级的玉米粒，并且未溶解的颗粒可包括胚芽、纤维和谷蛋白。未溶解的固体是原料12的不可发酵的部分。就本文中与附图中所显示的实施方案相关的讨论的目的而言，原料12将经常被描述为由磨碎的、未分级的玉米组成，其中未溶解的固体尚未被分离。然而，应当理解，本文所述的示例性方法和体系可针对不同的原料被修改，无论其是分级的或未分级的，如对于本领域的技术人员来说显而易见的。此外，如本领域的技术人员所能够理解的，使原料含量(例如玉米含量)最大化可使糖的含量以及产物滴度最大化。在一些实施方案中，原料12可以是高油酸玉米，使得来源于其的玉米油是具有至少约55重量％油酸的油酸含量的高油酸玉米油。在一些实施方案中，高油酸玉米油中的油酸含量可以是至高约65重量％。与此相比，普通玉米油中的油酸含量为约24重量％。对于在本发明的方法中的使用，高油酸油可提供一些优点，因为所述油的水解提供了具有高油酸含量的游离脂肪酸用于与发酵培养液接触。
[0148]使原料12液化的方法涉及原料12中的多糖水解为糖类，包括例如糊精和低聚糖，并且是常规方法。工业上通常利用的任何已知的液化方法以及相应的液化容器，均可被使用，包括但不限于酸方法、酸-酶方法或酶方法。此类方法可被单独地或组合地使用。在一些实施方案中，所述酶方法可被使用，并且适合的酶14 (例如，α-淀粉酶)被引入液化容器10的入口。水也可被引入液化容器10。在一些实施方案中，糖化酶(例如，葡糖淀粉酶)也可被引入液化容器10。在附加的实施方案中，脂肪酶也可被引入液化容器10以催化所述油的一种或多种组分向游离脂肪酸的转化。
[0149]从液化的原料12产生的原料浆液16包含来源于所述原料的可发酵的碳底物(例如，糖)、油和未溶解的固体。原料浆液16可被允许从液化容器10的出口出去。在一些实施方案中，原料12是玉米或玉米粒，因此原料浆液16是玉米醪浆液。在一些实施方案中，原料12是木质纤维素原料，因此原料浆液16可以是木质纤维素水解产物。在一些实施方案中，原料12是甘蔗。
[0150]原料浆液16与微生物32 —起被引入发酵容器30。发酵容器30被配置为使浆液16发酵以产生醇。具体地，微生物32代谢浆液16中的可发酵糖并分泌产物醇。微生物32选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。在一些实施方案中，微生物32可以是细菌，例如大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方案中，微生物32可以是发酵性的重组微生物。所述浆液可包括糖(例如以低聚糖的形式)和水，并且在一些实施方案中可包含小于约20g/L的葡萄糖单体、小于约10g/L或小于约5g/L的葡萄糖单体。适合测定葡萄糖单体的量的方法是本领域所熟知的。本领域中已知的此类适合的方法包括HPLC。
[0151]在一些实施方案中，浆液16被提供至糖化过程以将浆液16中复杂的糖类(例如，低聚糖)裂解为可被微生物32容易地代谢的单糖。工业上通常利用的任何已知的糖化方法均可被使用，包括但不限于酸方法、酸-酶方法或酶方法。在一些实施方案中，同时糖化和发酵(SSF)可在发酵容器30内发生，如图1中所示。在一些实施方案中，酶38如葡糖淀粉酶，可被引入发酵容器30的入口以使淀粉或低聚糖裂解为可被微生物32代谢的葡萄糖。
[0152]羧酸28和/或天然的油26与催化剂42 —起被引入发酵容器30。催化剂42可在Mv>啓 S _s % 70 _s % 75 _s % 000 _S %S遝攝 >MV>^S _s %S遝攝 >MV>^90 _s %S遝攝 >MV>^95 _s %S遝攝m^.S S _s%S遝攝。掛llte將||^鲥书，^||埋3攝/涟降卟蓉曲葫米册^练涟书3--?"涟龉--牟 7K 裳snt涟#-龉苦一妈坤涟^龉。掛 llte將 H^M^,^IIMS攝 I 涟降?蓉曲-----涟龉 7Ki?s151」>蓉坤涟。掛 lltepisps將 M^M^^JfilMs攝一涟降
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3〇霉属(Rhizopus)、红冬抱酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、猪属(Sus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、嗜热真菌属(Thermomyces)λ Thiarosporella、木霉属(Trichoderma)、轮枝菌属(Verticillium)和/或耶氏酵母属(Yairowia)的菌株。在优选的方面，所述脂肪酶的来源选自布氏犁头霉(Absidia blakesleena)、伞状犁头霉(Absidia corymb if era)、解毒无色杆菌(Achromobacter iophagus)、产减菌属(Alcaligenes sp.)、甘蓝链格抱菌(Alternariabrassiciola)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus strearothermophilus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)、Brochothrix thermosohata、圆柱假丝酵母(Candida cylindracea)(皱落假丝酵母(Candida rugosa))、副解脂假丝酵母(Candidaparalipolytica)、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B、欧诺比假丝酵母(Candida ernobii)、畸形假丝酵母(Candida deformans)、粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)、Coprinus cinerius、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、豌豆根腐皮镰孢菌(Fusarium solani pisi )、大刀粉红德抱菌(Fusarium roseum culmorum)、帚状地霉(Geotricum penicillatum)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)、Humicola brevispora、短小腐质霉高温变种(Humicola brevisvar.thermoidea)、特异腐质酶(Humicolainsolens)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮壳青霉(Penicillium crustosum)、扩展青霉(Penicilliumexpansum)λ 青霉属 I (Penicillium sp.1)、青霉属 II (Penicillium sp.1I)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、产减假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(即洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia))、焚光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、莓实假单胞菌(Pseudomonasfragi)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)、解脂臭味假单胞菌(Pseu domonas mephitica lipolytica)、产减假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、苗床假单胞菌(Pseudomonas plantari)、类产减假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和威斯康星假单胞菌(Pseudomonas wisconsinensis)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、日本根霉(Rhizopusjaponicus)、小抱根霉(Rhizopus microsporus)、结筛根霉(Rhizopus nodosus)、圆红冬抱酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、芝谷掷抱酵母(Sporobolomyces shibatanus)、野猪(Sus scrofa)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces Ianuginosus)(曾被命名为柔毛腐质霉(Humicola Ianuginose) )、Thiarosporella phaseolina、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。在更优选的方面，所述脂肪酶选自疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomcyces Ianuginosus)脂肪酶、曲霉属(Aspergillus sp.)脂肪酶、黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)脂肪酶、南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶 B、假单胞菌属（Pseudomonas sp.)脂肪酶、娄地青霉（Penicillium roqueforti)脂肪酶、沙门桕干酪青霉（Penicillium camembertii)脂肪酶、爪卩圭毛霉（Mucor javanicus)脂肪酶、洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia)脂肪酶、产碱菌属（Alcaligenes sp.)脂肪酶、皱落假丝酵母（Candida rugosa)脂肪酶、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis)脂肪酶、畸形假丝酵母（Candida deformans)脂肪酶、来自白地霉（Geotrichum candidum)的脂肪酶A和B、粗糖脉抱菌（Neurospora crassa)脂肪酶、赤球丛赤壳菌（Nectria haematococca)脂肪酶、异孢镰孢菌（Fusarium heterosporum)脂肪酶、德氏根霉（Rhizopus deIemar)脂肪酶、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、少根根霉（Rhizopus arrhizus)脂肪酶和米根霉（Rhizopus oryzae)脂肪酶。适合作为催化剂42的适合的商品脂肪酶制品包
括但不限于可购自Novozymes的 Lipolaseft' 100L、Lipex* iool、Lipodeane 2000T、
Lipozyme · CALB L、Novozyme· CALA L 和 Palatase20000L,或来自焚光假单胞菌
(Pseudomonas fluorescens)、洋葱假单胞菌（Pseudomonas cepacia)、米黑毛霉（Mucormiehei)、猪胰腺（hog pancreas)、圆柱假丝酵母（Candida cylindracea)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、雪白根霉（Rhizopus niveus)、南极假丝酵母（Candida antarctica)、少根根霉（Rhizopus arrhizus)或曲霉属（Aspergillus),可购自 SigmaAldrich。
[0156]磷脂酶是使磷脂的酯键水解的酶，但许多磷脂酶还可使甘油三酯、甘油二酯和甘油单酯水解(脂酰水解酶（LAH)活性)。如本文所用，术语“磷脂酶”包括具有任何磷脂酶活性的酶，所述磷脂酶活性例如使磷酸甘油酯键裂解(催化磷酸甘油的水解)，例如在油如原油或植物油中。本发明的磷脂酶活性可产生水可以提取的磷酸化碱基和甘油二酯。所述磷脂酶活性可包括磷脂酶C (PLC)活性；PI-PLC活性，磷脂酶A(PLA)活性乳磷脂酶Al或磷脂酶A2活性；磷脂酶B (PLB)活性如磷脂酶BI或磷脂酶B2活性，包括溶血磷脂酶（LPL)活性和/或溶血磷脂酶-转酰酶（ LPT A)活性；磷脂酶D (PLD)活性如磷脂酶Dl或磷脂酶D2活性；和/或马铃薯糖蛋白（ patatin)活性或它们的任何组合。
[0157]术语“磷脂酶”还包括具有溶血磷脂酶活性的酶，其中该酶的两种底物是2-溶血磷脂酰胆碱和H2O,并且其中它的两种产物是甘油磷酸胆碱和羧化物。磷脂酶Al (PLAl)将I-位的脂肪酸除去，产生游离脂肪酸和I-溶血-2-酰基磷脂。磷脂酶A2(PLA2)将2-位的脂肪酸除去，产生游离脂肪酸和I-酰基-2-溶血磷脂。PLAl和PLA2酶可以是胞内的或胞外的、膜结合的或可溶的。磷脂酶C(PLC)将磷酸根部分除去，产生1，2 二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)产生1，2-二酰基甘油磷酸和碱基。在本发明中有用的磷脂酶可以从多种生物来源获得，例如但不限于镰孢菌属（Fusarium)的丝状真菌物种，例如大刀镰孢菌（F. culmorum)、异孢镰孢菌（F. heterosporum)、腐皮镰孢菌（F. solani)或尖孢镰孢菌（F. oxysporum)的菌株；或曲霉属的丝状真菌物种，例如泡盛曲霉（Aspergillusawamori )、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、日本曲霉（Aspergillus japonicus)、黑曲霉（Aspergillus niger)或米曲霉（Aspergillus oryzae)的菌株。同样在本发明中有用
的是疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces Ianuginosus)磷脂酶变体，例如商品Lecitase?Ultra (Novozymes A’S, Denmark)。一种或多种磷脂酶可以作为冻干粉被使用，固定化的或在水溶液中。
[0158]通过一种或多种可发酵糖类的发酵产生的醇(例如丁醇）可通过酶催化的反应转化为羧酸酯，其中所述羧酸与所述醇酯化。例如脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶的酶可以催化上述反应；然而，这些酶可以由于一种或多种因素而失活，包括但不限于流体动力学剪切或在气-液和液-液界面的失活作用。在低聚糖被附加地转化为一种或多种可发酵糖类的发酵中，使低聚糖转化为可发酵糖类的酶(例如葡糖淀粉酶）也可被一种或多种上述相同的因素灭活。[0159]酶在由于发酵培养液的透气和/或由一种或多种可发酵糖类的发酵过程中气体二氧化碳在发酵培养液中的形成导致的气-液界面的失活(例如，可以在发酵培养液与气泡的界面发生)，是本领域所熟知的。鸡蛋清溶菌酶和在米曲霉（Aspergillus oryzae)中产
生的疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces Ianuginosus)脂肪酶（Novozymes Lipolase# )以
三种不同的因素组合被观察到在气-液界面的失活：鼓泡塔、带挡板的搅拌容器(没有通过气体鼓泡的透气)和降膜(Ghadge，等人，Chem. Eng. Sci. ”，58:5125-5134，2003)。疏棉状嗜热丝抱菌（Thermomyces Ianuginosus)脂肪酶(在米曲霉（Aspergillus oryzae)中产生；
Novozymes Lipolase IOOL*')在带挡板的搅拌槽反应器(没有通过气体鼓泡的透气）中在
气-液界面的失活机制已被报道（Patil，等人，AIChEJ. 46:1280-1283,2000)。
[0160]Stahmann 等人（Eur. J. Biochem. 244:220-225,1997)已报道了由于在气 / 液或液/液界面的界面失活，棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii)磷脂酶在搅拌的气体/水、三油酸甘油酯/水或油酸/水混合物中在数分钟内失活。Elias,等人（Adv. Biochem. Engineering/Biotechnology59:47-71,1998)已报道：（i) 一些酶被流体动力学剪切灭活，即使不存在气-液界面；（ii)就那些被流体动力学剪切灭活的酶而言，失活的速率在气-液界面的存在下升高；（iii) 一些酶无论施加的流体动力学剪切如何，在不存在气-液界面的情况下不失活；和（iv)就那些失活需要气-液界面的酶而言，失活的速率随着流体动力学剪切的升高而升高。Ross,等人（J. Mol. Catal. B:Enzymatic8:183 - 192, 2000)已描述了通过使溶剂液滴在鼓泡塔设备中向上通过含水的酶溶液，α -胰凝乳蛋白酶、β -胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和猪肝脏酯酶在多种水性/有机溶剂混合物中的界面失活。圆柱假丝酵母（Candida cylindracea)脂肪酶在搅拌槽反应器中的剪切失活的动力学和机制已被报道，其中失活的机制被发现是由于剪切诱发的气-液界面效应（Lee，等人，Biotechnol.Bioeng. 33:183-190,1989)。
[0161]在本文所述的一些方法中采用的发酵条件下，流体动力学剪切和气-液与液-液界面各自存在于发酵过程中并且能够导致酶的失活。在本文所述的条件下，这些因素中的每一种在发酵过程中对两相混合物(例如，发酵培养液和羧酸）中存在的一种或多种酶(例如，葡糖淀粉酶、脂肪酶、磷脂酶和溶血磷脂酶）的稳定性和活性的潜在影响不能基于现有技术被预测。尽管这些因素中的每一种可导致发酵混合物中的一种或多种酶的失活，在发酵过程中维持了用以催化产物醇与羧酸的酯化作用以产生羧酸酯的足够的酶活性。在葡糖淀粉酶也存在于发酵培养液和羧酸的两相发酵混合物中的反应中，同样维持了足够的酶活性（即，使低聚糖转化为可发酵糖类)。
[0162]羧酸28可以是任何能够与产物醇(例如丁醇或乙醇）酯化以产生所述羧酸的醇酯的羧酸。例如，在一些实施方案中，羧酸28可以是游离脂肪酸，并且在一些实施方案中，所述羧酸或游离脂肪酸具有4至28个碳，在其他实施方案中为4至22个碳，在其他实施方案中为8至22个碳，在其他实施方案中为10至28个碳，在其他实施方案中为7至22个碳，在其他实施方案中为12至22个碳，在其他实施方案中为4至18个碳，在其他实施方案中为12至22个碳，在另外的其他实施方案中为12至18个碳。在一些实施方案中，羧酸28是一种或多种下列的脂肪酸:杜醇花酸、癸酸、辛酸、蓖麻、椰子(即，作为天然存在的脂肪酸的组合，例如包括月桂酸、肉豆蘧酸、棕榈酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、己酸、花生酸、油酸和亚油酸)、异硬脂酸、月桂酸、亚麻籽、肉豆蘧酸、油酸、棕榈油、棕榈酸、棕榈仁、壬酸、蓖麻油酸、癸二酸、大豆、硬脂酸、妥尔油、牛油和#12羟基硬脂酸。在一些实施方案中，羧酸28是一种或多种二酸。
[0163]在一些实施方案中，羧酸28可以是两种或更多种不同脂肪酸的混合物。在一些实施方案中，羧酸28包括来源于酰基甘油酯的水解的游离脂肪酸，所述水解通过本领域已知的任何方法进行，包括化学的或酶的水解。在一些实施方案中，如上文所述，使用酶作为催化剂42，羧酸28可通过油的甘油酯的酶水解而来源于天然的油26。在一些实施方案中，所述脂肪酸或混合物由此包含不饱和脂肪酸。不饱和脂肪酸的存在降低了熔点，提供了易于处理的优点。在不饱和脂肪酸中，单不饱和的那些(即，拥有单个碳-碳双键)，可以提供与熔点相关的优点，而不会牺牲对于工艺考虑而言的适当的热和氧化稳定性。
[0164]在一些实施方案中，天然的油26可以是牛油、玉米、卡诺拉、癸/辛酸的甘油三酯、蓖麻、椰子、棉籽、鱼、霍霍巴油、猪油、亚麻籽、牛蹄、奥蒂、棕榈、花生、油菜籽、水稻、红花、大豆、向日葵、桐树、麻风树、南瓜、葡萄籽和植物油共混物(或可被纯化为较高浓度的不同链长和不饱和水平(即，18:1)的油)。在一些实施方案中，天然的油26是两种或更多种天然的油的混合物，例如棕榈和大豆油的混合物。在一些实施方案中，天然的油26是植物来源的油。在一些实施方案中，所述植物来源的油可(尽管不是一定)来源于可被用于发酵过程的生物质。所述生物质可以是与原料12所得自的相同的或不同的来源。因此，例如，在一些实施方案中，油26可来源于玉米，而原料12可以是甘蔗。例如，在一些实施方案中，油26可来源于玉米，并且原料12的生物质来源也是玉米。就油26对原料12而言，不同生物质来源的任何可能的组合均可被使用，如对于本领域的技术人员应当显而易见的。在一些实施方案中，油26来源于所述发酵过程中所使用的生物质。因此，在一些实施方案中，如下文根据图3所描述的，油26作为油26’直接来源于原料12。例如，当原料12是玉米时，则油26’是所述原料的组分玉米油。
[0165]任选地，乙醇33可被提供至发酵容器30以被包括在发酵培养液中。在一些实施方案中，当具有丁醇生物合成途径和/或降低的或除去的丙酮酸脱羧酶的表达的重组微生物被用作微生物32时，微生物32可能需要2-碳底物(例如乙醇)的补充以生存和生长。因此，在一些实施方案中，乙醇33可被提供至发酵容器30。
[0166]然而，已令人惊讶地发现，本发明的方法(在其中羧酸如脂肪酸存在于发酵容器中)可允许对于给定的重组微生物通常所提供的乙醇33的量的减少，而不会损害该重组微生物的活力。此外，在本发明的方法的一些实施方案中，没有补充乙醇时的醇(例如丁醇)的生产率与补充了乙醇33时所能够实现的生产率相当。如下文的实施例1-14中提出的比较实施例所进一步展示的，当脂肪酸而非乙醇存在于发酵容器中时的丁醇生产率，与发酵容器中既没有脂肪酸也没有乙醇时的丁醇生产率相当或更高。此外，在一些实施方案中，乙醇33补充的量与常规方法相比是减少的。例如，就需要补充2-碳底物的微生物而言，通常添。加至发酵容器的乙醇的量为约5g/L无水乙醇（B卩，5g无水乙醇每升发酵培养基)。在一些实施方案中，发酵中没有补充任何乙醇33。在后一种情况下，从发酵容器中完全排除了乙醇33的流。因此，在本发明的一些实施方案中，与乙醇33的补充相关的成本以及与乙醇33的储存罐和在使用其存活和生长可能需要补充2-碳底物的微生物进行的丁醇发酵或其他醇的发酵过程中，将乙醇33补充至发酵容器相关的不方便，有可能被减少或排除。
[0167]此外，无论乙醇的补充如何，在一些实施方案中，由于脂肪酸在发酵过程中的存在，本发明的方法可提供葡萄糖被微生物32摄入的较高速率。脂肪酸可作为羧酸28被引入发酵容器30、从补充的油26水解和/或来源于浆液16的组成性生物质油的水解。从发酵工艺产生产物醇的方法已被描述于2010年7月28日提交的共同未决、共同拥有的美国临时申请序列号61/368，451中，在所述方法中，游离脂肪酸在所述工艺中的一个步骤产生，并在发酵容器中与微生物培养物接触以改善微生物生长速率和葡萄糖的消耗，上述文献全文以引用方式并入本文。
[0168] 在发酵容器30中，用催化剂42使由微生物32产生的醇与羧酸28酯化以形成醇酯。例如，就丁醇生产的情况而言，用催化剂42使由微生物32产生的丁醇与羧酸28酯化以形成丁酯。原位产物移出（ISPR)可被用于将醇酯从发酵培养液中移出。如本文所展示的，使用催化剂来形成酯结合ISPR可改善发酵的效能。在一些实施方案中，与使用ISPR而不使用催化剂来形成酯的类似的发酵中的有效滴度相比，使用催化剂来形成酯结合ISPR(例如，液-液提取）可使有效滴度提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约100%。类似地，在一些实施方案中，与使用ISPR而不使用催化剂来形成酯的类似的发酵中的有效速率相比，使用催化剂来形成酯结合ISPR (例如，液-液提取）可使有效速率提高至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约100% (参见例如实施例9和11-14，表3。在一些实施方案中，有效收率提高了至少约10、至少约20%、至少约30%、至少约40%或至少约50%。在一些实施方案中，在醇的酯化作用之后得到的发酵培养液可包含游离的（即，未酯化的）醇，并且在一些实施方案中，在醇的酯化作用之后的发酵培养液中的游离醇的浓度，当产物醇是丁醇时为不高于1、3、6、10、15、20、25、3025、40、45、50、55或60g/L，或者当产物醇是乙醇时，在醇的酯化作用之后的发酵培养液中的游离醇的浓度为不高于 15、20、25、3025、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100g/L。在一些实施方案中，在发酵容器中醇酯对醇的比率可以为约1:1。在一些实施方案中，至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%或至少约90%的醇的有效滴度被转化为醇酯。
[0169]在一些实施方案中，足以实现至少约50g/L、至少约75g/L或至少约100g/L的最终有效滴度的水中的谷物载量可被用于谷物醪液发酵中，所述发酵中包括能够产生醇如丁醇的微生物。在其他实施方案中，所述谷物醪液发酵可以采用同时糖化和发酵（SSF)，并且在发酵过程中，葡萄糖在发酵培养液相中的浓度可以维持相对较低，例如至少约75g/L。
[0170]在一些实施方案中，脂肪酸能够以小于发酵器体积的约70%、小于发酵器体积的约50%或小于发酵器体积的约30%的量被添加至发酵器中。添加至发酵器中的脂肪酸的量可以是维持发酵过程中丁醇的水相滴度的手段。在其他实施方案中，丁醇的水相滴度可被维持在小于约35g/L发酵培养液、小于约25g/L发酵培养液或小于约20g/L发酵培养液的水平。在其他实施方案中，发酵培养液中的活性酯化酶的量可以是小于约lOOppm、小于约50ppm或小于约IOppm活性酶。在一些实施方案中，发酵培养液中使用的细胞群可以是小于约50g干细胞重量/L、小于约20g干细胞重量/L或小于约IOg干细胞重量/L。在其他实施方案中，发酵过程可以进行至少约30小时至至少约100小时、至少约40小时至至少约80小时、至少约50小时至至少约70小时。
[0171]在一些实施方案中，足以实现至少约30g 丁醇每升发酵培养液相、至少约45g 丁醇每升发酵培养液相、至少约60g 丁醇每升发酵培养液相的最终有效滴度的水中的糖锤度可被用于甘蔗发酵中，所述发酵中包括能够产生丁醇的微生物。在一些实施方案中，脂肪酸能够以小于发酵器体积的约70%、小于发酵器体积的约50%或小于发酵器体积的约30%的量被添加至发酵器中。添加至发酵器中的脂肪酸的量可以是维持发酵过程中丁醇的水相滴度的手段。在其他实施方案中，丁醇的水相滴度可被维持在小于约35g/L发酵培养液、小于约25g/L发酵培养液或小于约15g/L发酵培养液的水平。在其他实施方案中，发酵培养液中的活性酯化酶的量可以是小于约200ppm、小于约IOOppm或小于约20ppm活性酶。在一些实施方案中，在占发酵器体积的至少约30%的初始进料中，发酵培养液中使用的细胞群可以在开始时为至少约IOOg细胞每升发酵培养液。在3-7小时的发酵之后，细胞群可通过甘蔗原料的添加而被稀释至至少约25g细胞每升发酵培养液。经过总发酵时间的第8至15小时，细胞可以继续生长至至少约30g细胞每升发酵培养液。
[0172]在一些实施方案中，发酵培养液在发酵过程中与提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物。在此类实施方案中，ISPR包括液-液提取可被方便地实现。液-液提取可按照美国专利申请公布2009/0305370中所描述的方法进行，其公开内容全文并入本文。美国专利申请公布2009/0305370描述了使用液-液提取从发酵培养液中生产和回收丁醇的方法，包括使发酵培养液与不能与水混溶的提取剂接触以形成包括水相和有机相的两相混合物的步骤。通常，提取剂可以是选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们混合的)C12-C22脂肪醇、C12-C22脂肪酸、C12-C22脂肪酸的酯、C12-C22脂肪醛、C12-C22脂肪酰胺、以及它们的混合物的有机提取剂。提取剂还可以是选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们混合的)C4-C22脂肪醇、.C4-C28脂肪酸、C4-C28脂肪酸的酯、C4-C22脂肪醛、以及它们的混合物的有机提取剂。为了用于本文所述的方法，用于ISPR的提取剂通常是非醇的提取剂以便避免通过羧酸28与醇提取剂的催化酯化消耗发酵容器30中的羧酸28(那样较少的羧酸将可供用于与产物醇的酯化作用。例如，如果油醇被用作ISPR提取剂，由于活性催化剂42的存在，羧酸的油醇酯可在发酵容器中产生，如下文的实施例24中所进一步展示的。
[0173]按照图1的实施方案，羧酸28也可作为ISPR提取剂28或其组分。如先前所指出，羧酸28可被提供和/或在天然的油26被提供至发酵容器30的情况下原位形成和/或在原料16包含可被水解的油的情况下原位形成。在一些实施方案中，ISPR提取剂28包括游离脂肪酸。在一些实施方案中，ISPR提取剂28包括玉米油脂肪酸(COFA)。在一些实施方案中，油26是玉米油，从而ISPR提取剂28是COFA。ISPR提取剂(脂肪酸)28与发酵培养液接触并形成包括水相34和有机相的两相混合物。在发酵容器中形成的产物醇酯优先分配至有机相中，形成包含酯的有机相36。即，产物醇酯以超过水相34中存在的醇酯的平衡浓度的浓度被生产，并因此被优先分配至有机相中。发酵培养液中的任何游离的产物醇同样被优先分配至包含酯的有机相中。所述两相混合物可作为流39被移出发酵容器30并被引入容器35中，包含酯的有机相36在容器中与有机相34分离。两相混合物39分离为包含酯的有机相36和水相34可使用本领域中已知的任何方法实现，包括但不限于虹吸、送气、滗析、离心、使用重力沉降槽、膜辅助的相分裂、旋液分离等。全部或部分的水相34可作为发酵培养基被循环至发酵容器30 (如图所示)，或被废弃并被新鲜培养基替换，或被处理以移除任何残余的产物醇然后循环至发酵容器30。
[0174]根据图1，包含酯的有机相36被引入容器50中，醇酯在容器中与一种或多种底物52反应以回收产物醇54。产物醇54可使用本领域中任何已知的从醇酯获得醇的方法回收。例如，在一些实施方案中，产物醇可通过用碱水解然后酸化而从醇酯回收。在其他实施方案中，产物醇酯可在水解催化剂如物质52的存在下被水水解。例如，在一些实施方案中，产物醇酯水解为醇和羧酸28 (例如，当羧酸28是脂肪酸时为脂肪酸）可使用脂肪酶、水溶性酸、无机酸、有机酸或固体酸催化剂如物质52实现。例如，硫酸可被用作无机酸催化剂用于醇酯的水解。一些适合的水解催化剂是脂肪酶；酯酶；强无机酸，例如硫酸、盐酸或磷酸；强有
机酸，例如甲苯磺酸或萘磺酸；或固体酸催化剂，例如Ambeilyst14磺化聚苯乙烯树脂或沸
石。在一些实施方案中，醇酯的水解可使用流如物质52、通过提高温度和/或施加压力实现。在一些实施方案中，醇酯的水解可在柱(例如，反应性蒸馏塔)中进行。实施例45至54和56至58展示了从醇酯回收产物醇的多种方法。在一些实施方案中，从产物醇54的回收中获得了副产物56。副产物56不包括可从醇酯的水解回收的羧酸28。
[0175]在一些实施方案中，包含酯的有机相36中存在的脂肪酸的醇酯水解为产物醇和游离脂肪酸以从约10:1至约1:10的脂肪酸对水的比率发生，或者在其他实施方案中以从约100:1至约1:100的脂肪酸对水的比率发生。在一些实施方案中，脂肪酸的醇酯与水在低于约100°c的温度水解。在一些实施方案中，水解在高于100°C、高于150°C、高于200°C或高于250°C的温度发生。
[0176]例如，在一些实施方案中，醇酯可被酯交换以产生产物醇54，并且在一些实施方案中，第二醇酯56，例如脂肪酸烷基酯，也可作为副产物56产生。为了实现此类酯交换，醇酯可与能够使所述醇酯酯交换的催化剂接触以释放丁醇。在一些实施方案中，醇酯可使用甘油发生酯交换以产生产物醇54和作为副产物56的酰基甘油酯。所产生的酰基甘油酯可包括甘油单酯和甘油二酯。一些适合用于酯交换反应的催化剂是例如脂肪酶、醇盐尤其是第二种醇的、烷基钛酸酯、可溶性无机酸如硫酸和磷酸、可溶性有机酸如甲苯磺酸和萘
磺酸和固体酸如Ambeilysf磺化聚苯乙烯树脂或沸石。适合用于酯交换或水解的脂肪酶包括但不限于来源于洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia)、绵毛嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosa)或南极假丝酵母（Candida antarctica)的脂肪酶。在一些实施方案中，脂肪酶使用本领域的技术人员所熟知的方法被固定在可溶的或不可溶的支撑物上(参见例如 Immobilization of Enzymes and Cells ；Gordon F. Bickerstaff 编辑；HumanaPress, Totowa, NJ, USA, 1997)。酶的固定化可使用多种技术进行,包括I)通过共价支撑、物理吸附、静电结合或亲和结合，使酶结合到多孔的或非多孔的载体支撑物上；2)与双官能或多官能的试剂交联；3)包裹在凝胶基质、聚合物、乳剂或某些形式的膜中；和4)任何这些方法的组合。在其他实施方案中，脂肪酶可以不被固定化。在一些实施方案中，脂肪酶是可溶的。脂肪酸烷基酯56可包括例如脂肪酸甲酯。其他的脂肪酸烷基酯56可包括例如C2-C12直链的、支化的和环状的醇酯。然后，产物醇54可使用本领域已知的任何分离方法(例如蒸馏)从包含副产物56的反应混合物中分离。其他适合的分离机制可包括例如提取和膜分离。
[0177]在一些实施方案中，至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约99%的产物醇从醇酯回收。
[0178]ISPR提取剂(羧酸)28可在醇酯用以回收产物醇54的反应之前与所述醇酯分离。作为另外一种选择，ISPR提取剂28可在所述醇酯的反应之后与产物醇和任何副产物分离。然后，所得到的回收的贫化提取剂27可被循环回到发酵容器30中，通常混合新鲜制备的提取剂28 (其可来源于油26，如果有提供油26的话)，用于后续的醇酯生产和/或提取。作为另外一种选择，新鲜的提取剂28 (或油26)可被连续添加至发酵容器中以取代在两相混合物流39中被移除的提取剂。
[0179]在一些实施方案中，可从两相混合物39回收催化剂42，并在发酵过程中的步骤重复使用，例如在发酵本身或在产物醇的回收中。
[0180]在一些实施方案中，一种或多种附加的ISPR提取剂29 (参见图2)可被引入发酵容器30以形成包括水相和有机相的两相混合物。在此类实施方案中，ISPR提取剂29可以是外源的有机提取剂，例如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、十四醇、硬脂醇、1-十一醇、油酸、月桂酸、肉豆蘧酸、硬脂酸、肉豆蘧酸甲酯、油酸甲酯、十一醛、月桂醛、20-甲基十一醛、以及它们的混合物。然而，出于上文所指出的原因，ISPR提取剂29优选不是醇。相反，ISPR提取剂29优选地是羧酸(例如，游离脂肪酸)。在一些实施方案中，ISPR提取剂29是C0FA。在一些实施方案中，ISPR提取剂29是亚麻籽油脂肪酸、大豆油脂肪酸、麻风树油脂肪酸或来源于棕榈油、蓖麻油、橄榄油、椰子油、花生油或任何种子油的脂肪酸。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可以是 选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸酯(尤其是在醇部分包含I至8个碳原子的那些，例如脂肪酸甲酯和脂肪酸的低级醇酯)、脂肪酸乙二醇酯、羟基化甘油三酯、以及它们的混合物的脂肪酸提取剂，所述提取剂得自天然的油如生物质脂质的化学转化，如在例如2010年7月28日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时申请序列号61/368,436中所描述的，该文献以引用方式并入本文。在一些实施方案中，ISPR提取剂29是通过生物质脂质的化学水解获得的游离脂肪酸。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可以是从天然的油如生物质脂质的酶水解产生的游离脂肪酸，如在例如2010年7月28日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时申请序列号61/368，444中所描述的，该文献以引用方式并入本文。
[0181]原位产物移出可以成批模式或连续模式在发酵容器30中进行。在原位产物移出的连续模式中，产物被连续地从容器(或反应器)中移出。在原位产物移出的分批模式中，一定体积的有机提取剂被添加至发酵容器中，并且所述提取剂在过程中不被移出。对于原位产物移出而言，有机提取剂可在形成两相发酵培养基的发酵开始时接触发酵培养基。作为另外一种选择，有机提取剂可在微生物达到期望的生长量之后与发酵培养基接触，其中所述生长量的达到可通过测定培养物的光密度确定。而且，有机提取剂可在发酵培养基中的产物醇水平达到预先决定的水平的时候与发酵培养基接触。就根据本发明的一些实施方案生产丁醇的情况而言，在丁醇浓度达到毒性水平之前的某一时间，羧酸提取剂可与发酵培养基接触，使所述丁醇与所述羧酸酯化以产生丁酯，并且在一些实施方案中，产生包括水相和包含丁酯的有机相的两相混合物。丁醇的浓度从而在发酵容器中降低，并因此使丁醇对微生物的毒性效应最小化。然后，在达到所期望的丁酯有效滴度之后，可从发酵容器中移出包含酯的有机相(并从组成水相的发酵培养液分离)。例如，在一些实施方案中，在丁酯的有效滴度为大于约10g/kg发酵培养液之后，包含酯的有机相可与发酵培养液分离。在其他实施方案中，在丁酯的有效滴度为大于约230g/kg发酵培养液、大于约300g/kg发酵培养液、大于约400g/kg发酵培养液、大于约500g/kg发酵培养液或大于约600g/kg发酵培养液之后，包含酯的有机相可从发酵培养基分离。在另一个实施方案中，在％C0FA转化为至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%或至少约100%之后，包含酯的有机相可从发酵培养基分离。在一些实施方案中，在可用的可发酵糖在发酵容器中的发酵基本上完成之后，包含酯的有机相与水相分尚。[0182]在图I中描绘的示例实施方案中，从发酵培养液原位提取了醇酯，两相混合物39的分离在分离容器35中发生。在一些实施方案中，两相混合物的分离可在发酵容器中发生，如下文所述的图3和4的示例实施方案中所显示，包含酯的有机相流36在其中直接从发酵容器30中出来。水相流34也可直接从发酵容器30中出来、被处理以移除任何残余的醇酯或产物醇和被循环利用或被废弃并被新鲜的发酵培养基替换。通过有机提取剂提取醇酯或产物醇可在从发酵培养液中移除或不移除微生物32的情况下进行。微生物32可通过本领域已知的方法从发酵培养液中移除，所述方法包括但不限于过滤或离心。例如，水相流34可包括微生物32如酵母。微生物32可被容易地从水相流分离，例如在离心机中（未示出）。然后，微生物32可被循环至发酵容器30，其经过时间可提高醇的生产的生产率，从而导致醇的生产效率提高。
[0183]在一些实施方案中，图I的体系和过程可被调整，使得在发酵容器30中的同时糖化和发酵替换为在发酵容器30之前分开的糖化容器60，这对于本领域的技术人员应当是显而易见的(参见例如图4的实施方案)。
[0184]在另外的实施方案中，如在例如图2的示例实施方案中所显示的，天然的油26被提供至容器40 (而不是被直接提供至发酵容器30)，催化剂42也被提供至所述容器40，从而油26中的酰基甘油酯的至少一部分被水解，形成羧酸28。然后，来自容器40的包含羧酸28和催化剂42的产物流被引入发酵容器30。羧酸28和催化剂42与发酵培养基中产生的产物醇接触，从而以与上文根据图I所述的相同的方式，从所述羧酸与所述产物醇的催化酯化作用中原位形成了所述产物醇的醇酯。羧酸28也可作为ISPR提取剂，并且在一些实施方案中足够的羧酸28和/或一种或多种附加的ISPR提取剂29可被引入发酵容器30以形成包括水相和有机相的两相混合物，而醇酯分配至有机相中。图2的实施方案的其余操作过程与图I的相同，因此不再赘述。
[0185]在本发明的一些实施方案中，如在例如图3的实施方案中所显示的，催化剂42可被添加至包含油26’的原料浆液16中，所述油26’来源于原料12从其形成的生物质。在所显示的实施方案中，催化剂42能够使油26’中的甘油酯水解为游离脂肪酸28’。因此，在催化剂42被引入原料浆液16之后，油26’中的甘油酯的至少一部分被水解，产生具有游离脂肪酸28’和催化剂42的原料浆液18。例如，当原料12是玉米时，则油26’是该原料的组成性玉米油，并且所述游离脂肪酸28’是玉米油脂肪酸（COFA)。[0186]原料浆液18与产生醇的微生物32 —起被引入发酵容器30中以被包括在发酵培养基中。在一些实施方案中，酶38如葡糖淀粉酶也可被引入发酵容器中，用于同时的浆液18中的糖的糖化和发酵容器30中的醇的发酵。以与上文根据图1所述的相同的方式，催化剂42在发酵容器中的存在(通过浆液18被引入)，催化醇与游离脂肪酸28’ (通过浆液18被引入)的酯化作用以原位形成脂肪酸醇酯。在一些实施方案中，就丁醇的生产而言，产生丁醇的微生物32与原料浆液18 —起被引入了发酵容器30。催化剂42在发酵容器中(通过浆液18被引入)催化丁醇与游离脂肪酸28’(通过浆液18被引入)的酯化作用以原位形成脂肪酸丁酯(FABE)。游离脂肪酸28’也可作为ISPR提取剂。例如，当游离脂肪酸28’是COFA时，则COFA的醇酯在原位形成，并且COFA作为ISPR提取剂或其部分。 [0187]在一些实施方案中，一种或多种附加的ISPR提取剂29可被引入发酵容器30中，用于醇酯(和任何游离的醇)从水相的优先分配。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可以是根据图1和2的实施方案所述的羧酸28。在一些实施方案中，ISPR提取剂29作为油26被引入发酵容器30，然后油26通过催化剂42被水解为脂肪酸以便成为ISPR提取剂29。在一些实施方案中，油26是玉米油，从而ISPR提取剂29是C0FA。在一些实施方案中，ISPR提取剂29可以是选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪酰胺、脂肪酸酯(尤其是在醇部分包含I至8个碳原子的那些，例如脂肪酸甲酯和脂肪酸的低级醇酯)、脂肪酸乙二醇酯、羟基化甘油三酯、以及它们的混合物的脂肪酸提取剂，如上文根据图1和2的实施方案所描述的。在另外的实施方案中，ISPR提取剂29可以是通过生物质脂质的化学或酶水解获得的游离脂肪酸。在此类实施方案中，用于产生提取剂29的生物质脂质与原料12所得自的可来自相同的或不同的生物质来源。例如，在一些实施方案中，用于产生提取剂29的生物质脂质可来源于大豆，而原料12的生物质来源是玉米。就提取剂29对原料12而言，不同生物质来源的任何可能的组合均可被使用，这对于本领域的技术人员应当是显而易见的。图2的实施方案的其余操作过程与图1的相同，因此不再赘述。
[0188]作为非限制性的假想实施例，根据图3的实施方案，可标称包含约4重量％玉米油的研碎全玉米的水性悬浮液(作为原料12)，可在约85°C至120°C被淀粉酶(作为液化酶14)处理30分钟至2小时，所得到的液化的醪16被冷却至65°C和30°C之间，并在pH4.5至7.5 (在一些实施方案中，介于pH5.5和6.5之间)经0.1ppm至IOppm(在一些实施方案中为0.5ppm至1.0ppm)的脂肪酶(作为催化剂42)处理足够的时间，以实现脂质中可用的脂肪酸含量至少30%至高至至少99%的向游离脂肪酸的转化。液化的并经脂肪酶处理的醪18可被冷却至约30°C (例如，使用热交换器)，并以约25%至30重量％的干玉米固体加载至发酵容器30中。通过葡糖淀粉酶(作为糖化酶38)的添加，液化的醪18在发酵过程中的糖化可导致葡萄糖的产生。与在使用未经脂肪酶42处理的液化的醪的发酵培养液中所可存在的相比，所得到的发酵培养液可包含显著更少的量的玉米油(例如，约1.2重量％的玉米油)。具体地，脂肪酶处理42可导致玉米油脂质26’(甘油三酯(TG))转化为C0FA28’(和一些甘油二酯(DG)或甘油单酯(MG))，降低了脂质26’在C0FAISPR提取溶剂28’或29中积累的速率。脂肪酶处理42还可导致发酵过程中产生的丁醇转化为COFA的丁酯，其中所述COFA的丁酯具有在液-液提取ISPR过程中溶解至COFA相36中的高分配系数。在发酵结束时，包含COFA的丁酯的COFA相36可从发酵培养液(在容器30/35处)分离，并且可使用一种或多种方法从有机混合物36回收(在容器50处)丁醇54，所述方法包括但不限于使用例如脂肪酶52、固体酸催化剂52或流52，使所述酯水解以产生丁醇54和C0FA27。
[0189]在另一些实施方案中，如在例如图4的实施方案中所显示的，图3的体系和过程可被调整，使得在发酵容器30中的同时糖化和发酵（SSF)替换为在发酵容器30之前分开的糖化容器60。除了包括了容纳酶38的分开的糖化容器60，并且催化剂42被引入液化并糖化的原料流62之外，图4与图3是基本上相同的。原料浆液16与酶38如葡糖淀粉酶一起被引入了糖化容器60，从而浆液16中的低聚糖形式的糖类被裂解为单糖。液化并糖化的原料流62从引入了催化剂42的糖化容器60中出来。原料流62包括单糖和油26’以及来源于原料的未溶解的固体。油26’通过催化剂42的引入而被水解，产生具有游离脂肪酸28’和催化剂42的液化且糖化的原料浆液64。
[0190]作为另外一种选择，在一些实施方案中以与在图I的实施方案中催化剂42与酶38一起被引入发酵容器30用于SSF相似的方式，催化剂42可与糖化酶38 —起被添加以同时产生葡萄糖和使油脂质26’水解为游离脂肪酸28’。酶38和催化剂42的添加可以是逐步的(例如，先添加催化剂42，然后添加酶38，反之亦然)，或同时的。然而，与图I的实施方案(在其中，催化剂42在SSF过程中向发酵容器30中的添加还基本上同时地使产物醇转化为醇酯）相比，直到包含催化剂42的浆液64被引入发酵容器30中才形成醇酯。作为另外一种选择，在一些实施方案中，浆液62可被引入发酵容器30，而催化剂42被直接添加至发酵容器30。
[0191]在图4的实施方案中，浆液64与产生醇的微生物32 —起被引入发酵容器30，所述微生物32代谢单糖以产生产物醇。以与上文根据图I所述的相同的方式，催化剂42在发酵容器中的存在(通过浆液64被引入)，催化醇与游离脂肪酸28’ (通过浆液62被引入）的酯化作用以原位形成脂肪酸醇酯。游离脂肪酸28’还可作为ISPR提取剂，用于优先分配来自水相的醇酯(和任何的游离醇)。在一些实施方案中，一种或多种附加的ISPR提取剂29也可被引入发酵容器30中，如上文根据图3所描述的。图4的实施方案的其余操作过程与图3的相同，因此不再赘述。
[0192]在一些实施方案,包括在任何上文所描述的相对于图1-4的实施方案中，未溶解的固体可在引入发酵容器30之前从原料浆液16中移除。例如，如在图5的实施方案中所显示的，原料浆液16被引入分离器20的入口，所述分离器20被配置为使未溶解的固体作为固相或湿滤饼24被排出。例如，在一些实施方案中，分离器20可包括压力过滤器、真空过滤、机械压力过滤或离心机(例如，滗析离心机)，用于将未溶解的固体从原料浆液16分离。在一些实施方案中，工业上使用的任何常规离心机，包括例如滗析转鼓离心机、三相卧螺离心机、叠片式离心机、过滤离心机或滗析离心机，可被用于分离未溶解的固体。在一些实施方案中，未溶解的固体从原料浆液16的移除可通过过滤、真空过滤、带式过滤器、加压过滤、使用筛网过滤、筛网分离、格栅、多孔格栅、浮选、水力旋流器、压滤、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器或可以从液体分离固体的任何方法实现。任选地，在一些实施方案中，分离器20也可被配置为移除原料浆液16中存在的油26’的一些或基本上全部。在此类实施方案中，分离器20可以是本领域已知用于从含水的原料流移除油的任何适合的分离器，包括但不限于虹吸、滗析、离心、使用重力沉降器、膜辅助的相分裂等。剩余的包括糖和水的原料作为含水的流22被排放至发酵容器30。
[0193]例如，在一些实施方案中，分离器20包括三相卧螺离心机20，其搅拌或旋转原料浆液16以产生包括包含糖和水的含水层(即，流22)、包含未溶解的固体的固体层(B卩，湿滤饼24)和油层(即，油流26’ )的离心产物。在这种情况下，催化剂42可与所移出的油26’接触，产生游离脂肪酸28’和催化剂42的流。然后，游离脂肪酸28’和催化剂42的流可被引入发酵容器30以与发酵培养基接触，从而能够以与上文根据图1所描述的相同方式，在原位实现发酵培养基中的产物醇转变为脂肪酸醇酯的催化的酯化作用。
[0194]游离脂肪酸28’还可作为ISPR提取剂28’，并且一种或多种附加的ISPR提取剂29也可被引入发酵容器30。因此，原料油26’可被催化水解为羧酸，从而使ISPR提取剂中存在的脂质的量减少，同时同样产生ISPR提取剂。包含酯的有机相36可在容器35处从两相混合物39的水相34分离，并且产物醇可在容器50中从所述醇酯回收(参见图1)。图5的实施方案的其余操作过程与图3的相同，因此不再赘述。
[0195]当湿滤饼24通过离心机20被移除时，在一些实施方案中，来自原料12的油(例如当所述原料是玉米时为玉米油)的一部分残留在湿滤饼24中。一旦水溶液22已从离心机20排出，湿滤饼24即可在离心机中被附加的水洗涤。对湿滤饼24的洗涤将会回收湿滤饼中存在的糖类(例如低聚糖)，并且所回收的糖类和水可被循环至液化容器10。洗涤之后，湿滤饼24可与可溶物混合，然后通过任何适合的已知方法干燥形成干酒糟及可溶物(DDGS)。从在离心机20中形成的湿滤饼24形成DDGS具有多种益处。由于未溶解的固体没有进入发酵容器，所述DDGS不包含被裹挟的提取剂和/或产物醇如丁醇，它不经历发酵容器中的条件，并且它不与发酵容器中存在的微生物接触。所有这些益处使得加工和销售DDGS更加容易，例如作为动物饲料。在一些实施方案中，油26’没有与湿滤饼24分别地被排出，而是油26’被包括在湿滤饼24中作为其一部分并且最终存在于DDGS中。在此类实例中，所述油可从所述DDGS分离，并被转化为ISPR提取剂29，用于随后在相同的或不同的醇发酵过程中使用。用于通过离心从原料浆液16移除未溶解的固体的方法和体系详细描述于2010年6月18日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时申请序列号61/356，290中，该文献全文以引用方式并入本文。
[0196]如上所述，油26’可使用任何适合的已知方法从DDGS分离，所述方法包括例如溶剂提取方法。在本发明的一个实施方案中，DDGS被加载至提取容器中，并用溶剂如己烷洗涤以移除油26’。其他可使用的溶剂包括例如异丁醇、异己烷、乙醇、石油馏出物如石油醚或它们的混合物。在油26’的提取之后，DDGS可被处理以移除任何残余的溶剂。例如，DDGS可使用本领域已知的任何方法被加热以使任何残余的溶剂蒸发。在溶剂的移除之后，DDGS可以经受干燥处理以除去任何残余的水。经处理的DDGS可被用作动物的饲料添加剂，所述动物例如家禽、牲畜和家养宠物。
[0197]在从DDGS中提取之后，所得到的油26’和溶剂的混合物可被收集，用于将油26’从所述溶剂分离。在一个实施方案中，所述油26’与溶剂的混合物可通过蒸发被处理，从而所述溶剂被蒸发，并可被收集和循环利用。所回收的油可被转化为ISPR提取剂29，用于随后在相同的或不同的醇发酵过程中使用。
[0198]除了固体的回收之外，还可能期望回收发酵过程的其他副产物。在一个实施方案中，脂肪酸酯(例如，脂肪酸异丁酯)可被回收，例如以提高碳水化合物至产物醇(例如，丁醇)的收率。这可通过例如使用溶剂从例如通过合并和混合多种副产物流并干燥上述合并和混合步骤的产物形成的副产物提取脂肪酸异丁酯而实现。用于从DDGS回收玉米油甘油三酯的此类基于溶剂的提取体系描述于美国专利申请公布2010/0092603中，其教导以弓丨用方式并入本文。
[0199]在脂肪酸酯的溶剂提取的一个实施方案中，固体可从总的釜馏物分离(“分离的固体”)，在那之后的流将包含到此为未合并的副产物流中绝大部分的脂肪酸酯。然后，这些分离的固体可被进料至提取器中，并用溶剂洗涤。在一个实施方案中，所述分离的固体被翻转至少一次以确保所述分离的固体的全部侧面均被溶剂洗涤。洗涤之后，收集所得到的脂质和溶剂的混合物(称为油水混合物)，用于从所述溶剂分离提取的脂质。例如，所得到的脂质和溶剂的混合物可被存入分离器中，用于进一步的加工。在提取过程中，随着溶剂洗遍上述分离的固体，溶剂不仅将脂质带入溶液中，它还富集了细小的固体颗粒。这些“粉末”在油水混合物中一般是不可取的杂质，并且在一个实施方案中，所述油水混合物可通过一种将所述粉末从油水混合物分离的装置，从提取器或分离器中排出。
[0200]为了分离油水混合物中包含的脂质和溶剂，可以使所述油水混合物经历蒸馏步骤。在该步骤中，油水混合物可通过例如蒸发器被处理，蒸发器将油水混合物加热至高至足以导致所述溶剂的蒸发，但不够高到不利地影响所提取的脂质或使其蒸发的温度。随着溶剂的蒸发，其可被收集，例如在冷凝器中，并被循环用于将来使用。溶剂从油水混合物的分离产生了粗制脂质的原液，其可被进一步处理以分离水、脂肪酸酯(例如，脂肪酸异丁酯)、脂肪酸和甘油三酯 。
[0201]在脂质的提取之后，固体可从提取器中转出，并经受汽提过程从而移除残余的溶剂。残余的溶剂的回收对于工艺的经济性是重要的。在一个实施方案中，湿的固体可在汽密环境中被输送以保存和收集随着湿的固体被输送至脱溶剂装置中而从所述湿的固体瞬时蒸发的溶剂。随着固体进入脱溶剂装置，它们可被加热以蒸发和除去残余的溶剂。为了加热固体，脱溶剂装置可包括用于将固体分配至一个或多个托盘的机制，并且所述固体可被直接加热，例如通过与热的空气或蒸汽接触，或者被间接加热，例如通过加热装载有饼柏的托盘。为了有利于将固体从一个托盘转移至另一个，装载有固体的托盘可包括开口，所述开口使得固体能够通过一个托盘进入下一个。任选地，固体可以从脱溶剂装置被转运至混合器。在被转运进干燥器之前，固体在所述混合器中与其他副产物混合。固体提取的实例描述于实施例63中。在该实施例中，固体被进料至脱溶剂装置中，所述固体在其中与蒸汽接触。在一个实施方案中，蒸汽和固体在脱溶剂装置中的流动可以是反向的。然后，固体可以从脱溶剂装置中出来，并可被进料至干燥器或任选的混合器中。在所述混合器中，多种副产物可被混合。从脱溶剂装置中出来的蒸气可被冷凝，并任选地与油水混合物混合，然后被进料至滗析器。从滗析器出来的富含水的相可被进料至蒸馏塔，己烷在蒸馏塔中从富含水的流除去。在一个实施方案中，除去了己烷的富含水的流从蒸馏塔的底部出来，并可被循环回发酵过程，例如，它可被用于使磨碎的玉米固体形成浆液。在另一个实施方案中，塔顶和底部的产物可被循环至发酵过程。例如，富含脂质的底部沉积物可被添加至水解器的进料中。塔顶馏出物可被例如冷凝并进料至滗析器。从该滗析器出来的富含己烷的流可任选地被用作进料至提取器的溶剂的部分。从该滗析器出来的富含水的相可被进料至将己烷从水反萃取出来的塔中。如本领域的技术人员可理解的，本发明的方法可以多种方式被调整以优化用于生产产物醇如丁醇的发酵过程。
[0202]在溶剂提取脂肪酸酯的另一个实施方案中，在它们作为异质性混合物被引入预闪蒸塔之前，固体可从发酵中排出的发酵培养液和溶剂分离。这些固体的湿滤饼可使用分离装置如筛网过滤器或离心机成形。可使用含水的异丁醇对筛过的固体的滤饼进行置换洗涤以除去保留在湿滤饼中的脂肪酸酯。作为另外一种选择，经过离心的固体的滤饼可在含水的异丁醇中被再浆化，并再次被分离以实现对保留在湿滤饼中的脂肪酸酯的移除。该固体提取的实施方案的实例描述于实施例63中。
[0203]在另一个实施方案中，副产物(或联产物)可以来源于发酵过程中所使用的醪。例如，玉米油可以分离自醪，并且该玉米油可包含甘油三酯、游离脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和磷脂(参见例如实施例66)。玉米油可以任选地以不同的比率被添加至其他副产物(或联产物)，并因此例如形成改变所得到的副产物中甘油三酯的量的能力。以这种方式，所得到的副产物的脂肪含量可被控制为例如产生低脂肪、高蛋白的动物饲料，所述动物饲料与高脂肪的产品相比将更适合奶牛的需求。
[0204]在一个实施方案中，从醪分离的粗制玉米油可被进一步加工为供消费者使用的食用油，或者其还可被用作动物饲料的组分，因为其高甘油三酯含量会使其成为代谢能的优异来源。在另一个实施方案中，它还可被用作生物柴油或可再生柴油的原料。
[0205]在一个实施方案中，提取剂副产物可被全部或部分地用作动物饲料副产物的组分，或者其可被用作生物柴油或可再生柴油的原料。
[0206]在另一个实施方案中，固体可以分离自醪，并且可包含甘油三酯和游离脂肪酸。这些固体(或流)可被用作动物饲料，既可以是作为离心排出物被回收的，也可以是在干燥之后。由于所述固体(或湿滤饼)具有可用的赖氨酸和过瘤胃非降解蛋白质的高含量，其可以尤其适合作为反刍动物(例如，奶牛)的饲料。例如，这些固体可以在高蛋白、低脂肪的饲料中具有特殊价值。在另一个实施方案中，这些固体可被用作基料，即，其他副产物如糖浆可被添加至所述固体以形成可被用作动物饲料的产物。在另一个实施方案中，不同量的其他副产物可被添加至所述固体以定制所得到的产物的特性来满足特定动物物种的需求。
[0207]如实施例62中所述从总的釜馏物分离的固体的组合物可包括例如粗蛋白、脂肪酸和脂肪酸异丁酯。在一个实施方案中，干燥的或潮湿的所述组合物(或副产物)可被用作被期望具有例如高蛋白(例如，高赖氨酸)、低脂肪和高纤维含量的动物饲料。在另一个实施方案中，如果期望的是高脂肪、低纤维的动物饲料，脂肪可从例如另一种副产物流被添加至所述组合物中。在一个实施方案中，这种高脂肪、低纤维的动物饲料可被用于猪或家禽。在另一个实施方案中，酒糟残液(CDS)的非水性组合物(参见例如实施例66)可包括例如蛋白质、脂肪酸和脂肪酸异丁酯以及其他溶解的和悬浮的固体如盐类和碳水化合物。干燥的或潮湿的所述⑶S组合物可被用作例如被期望具有高蛋白、低脂肪、高矿物盐的饲料组分的动物饲料。在一个实施方案中，这种组合物可被用作奶牛口粮的组分。
[0208] 在另一个实施方案中，来自发酵过程的油可通过蒸发被回收。这种非水性的组合物可包含脂肪酸异丁酯和脂肪酸(参见例如实施例66)，并且这种组合物(或流)可被进料至水解器以回收异丁醇和脂肪酸。在另一个实施方案中，这种流可被用作生物柴油生产的原料。
[0209]通过经由发酵过程生产醇(例如丁醇)产生的多种流,可以多种方式被合并以产生多种联产品。例如，如果来自醪的粗制玉米油被用于产生将被用作提取剂的脂肪酸，并且脂质处于其他目的通过蒸发器被提取，那么剩余的流可被合并和处理以产生包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸异丁酯的联产品组合物。在一个实施方案中，这种组合物可包含至少约20-35重量％的粗蛋白、至少约1-20重量％的粗脂肪、至少约0-5重量％的甘油三酯、至少约4-10重量％的脂肪酸和至少约2-6重量％的脂肪酸异丁酯。在一个特定实施方案中，所述联产品组合物可包含约25重量％的粗蛋白、约10重量％的粗脂肪、约O. 5重量％的甘油三酯、约6重量％的脂肪酸和约4重量％的脂肪酸异丁酯。
[0210]在另一个实施方案中，脂质通过蒸发器被提取并且脂肪酸被用于其他目的，并且约50重量％的来自醪的粗制玉米油和剩余的流被合并和处理，所得到的联产品组合物可包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸异丁酯。在一个实施方案中，这种组合物可包含至少约25-31重量％的粗蛋白、至少约6-10重量％的粗脂肪、至少约4-8重量％的甘油三酯、至少约0-2重量％的脂肪酸和至少约1-3重量％的脂肪酸异丁酯。在一个特定实施方案中，所述联产品组合物可包含约28重量％的粗蛋白、约8重量％的粗脂肪、约6重量％的甘油三酯、约O. 7重量％的脂肪酸和约I重量％的脂肪酸异丁酯。
[0211] 在另一个实施方案中，从总的釜馏物分离的固体和50重量％的提取自醪的玉米油被合并，并且所得到的联产品组合物可包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸异丁酯、赖氨酸、中性洗涤剂纤维（NDF)和酸性洗涤剂纤维（ADF)。在一个实施方案中，这种组合物可包含至少约26-34重量％的粗蛋白、至少约15-25重量％的粗脂肪、至少约12-20重量％的甘油三酯、至少约1-2重量％的脂肪酸、至少约2-4重量％的脂肪酸异丁酯、至少约1-2重量％的赖氨酸、至少约11-23重量％的NDF和至少约5_11重量％的ADF。在一个特定实施方案中，所述联产品组合物可包含约29重量％的粗蛋白、约21重量％的粗脂肪、约16重量％的甘油三酯、约I重量％的脂肪酸、约3重量％的脂肪酸异丁酯、约I重量％的赖氨酸、约17重量％的NDF和约8重量％的ADF。这种联产品组合物的高的脂肪、甘油三酯和赖氨酸含量和较低的纤维含量作为猪和家禽的饲料可以是期望的。
[0212]如上所述，通过经由发酵过程生产醇(例如丁醇）产生的多种流，可以以多种方式被合并以产生包含粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸和脂肪酸异丁酯的多种联产品组合物。例如，包含至少约6%的粗脂肪和至少约28%的粗蛋白的组合物可被用作用于产奶动物的动物饲料产品。包含至少约6%的粗脂肪和至少约26%的粗蛋白的组合物可被用作用于育肥牛的动物饲料产品，而包含至少约1%的粗脂肪和至少约27%的粗蛋白的组合物可被用作用于越冬牛的动物饲料产品。包含至少约13%的粗脂肪和至少约27%的粗蛋白的组合物可被用作用于家禽的动物饲料产品。包含至少约18%的粗脂肪和至少约22%的粗蛋白的组合物可被用作用于单胃动物的动物饲料产品。如此，所述多种流能够以此类方式被合并以针对特定的动物物种定制饲料产品。
[0213]在一个实施方案中，通过经由发酵过程生产醇(例如丁醇）产生的一种或多种流，可以以多种方式被合并以产生包含至少约90%C0FA的组合物，其可被用作燃料源如生物柴油。
[0214]作为本发明的方法的一个实施方案的实例,磨碎的谷物(例如，经锤磨机处理的玉米）和一种或多种酶被混合以产生浆化的谷物。浆化的谷物被煮过、液化、并任选地经闪急蒸汽闪蒸，得到煮过的醪。然后过滤上述煮过的醪以移除悬浮的固体，产生湿滤饼和滤液。过滤可通过多种方法实现，所述方法例如离心、筛分或真空过滤，并且所述过滤步骤可以从所述醪移除至少约80%至至少约99%的悬浮的固体。[0215]用水使湿滤饼再浆化，并再过滤以除去附加的淀粉，产生经洗涤的滤饼。再浆化过程可以重复多次，例如，一至五次。用于使湿滤饼再浆化的水可以是在发酵过程中产生的循环水。通过上述再浆化/再过滤过程产生的滤液，可以回到初始的混合步骤以与所述磨碎的谷物形成浆液。所述滤液可以在所述混合步骤之前被加热或冷却。
[0216]可在生产过程中的多个阶段用发酵培养液使上述经洗涤的滤饼再浆化。例如，可在发酵罐之后、预闪蒸塔之前或在酒糟干燥器的进料点，用发酵培养液使上述经洗涤的滤饼再浆化。经洗涤的滤饼可与其他副产物分别地被干燥，或者作为湿滤饼被直接用于产生DDGS或动物饲料产品。
[0217]作为初始混合步骤的结果产生的滤液可被进一步处理，如本文所述。例如，所述滤液可通过蒸汽或流程间热交换被加热。糖化酶可被添加至滤液，并且所述滤液的溶解的淀粉可被部分或完全地糖化。糖化的滤液可通过多种方式被冷却，例如通过流程间交换、与冷却水交换或与冷冻水交换。
[0218]然后，冷却的滤液可以和适用于醇的生产的微生物一起被添加至发酵器，所述微生物例如可产生丁醇的重组酵母。此外，氨和循环的流也可被添加至所述发酵器。该过程可包括至少一个发酵器、至少两个发酵器、至少三个发酵器或至少四个发酵器。发酵过程中产生的二氧化碳可被排放至涤气器以减少空气排放物(例如，丁醇空气排放物)和提高产物收率。
[0219]溶解可通过循环环路被添加至发酵器，或者可被直接添加至发酵器。所述溶剂可以是一种或多种具有使醇(例如，丁醇)溶解或与其反应的能力并且可具有在水中的有限的溶解度的有机化合物。溶剂可作为单液相或双液相材料被连续地从发酵器中取出，或者所述溶剂可作为单或双液相材料被分批取出。
[0220]发酵培养液可被脱气。发酵培养液在脱气之前可被加热，例如，通过与热的醪的流程间交换或与预闪蒸塔的顶部馏出物的流程间交换。蒸气可被排放至冷凝器，然后排放至涤气器。脱气的发酵培养液可被.进一步加热，例如，通过与蒸馏区域内的其他的流的流程间热交换。
[0221]预热的发酵培养液和溶剂可进入预闪蒸塔，所述预闪蒸塔可从常规的干磨燃料乙醇车间的粗馏塔改造而来。这种塔可在亚大气压下运行，由来自蒸发器管系或来自煮醪的步骤的水蒸气驱动。预闪蒸塔的塔顶馏出物可通过与冷却水和流程间热交换(包括与预闪蒸塔进料的热交换)的一些组合的热交换而被冷凝。液体冷凝物可被引入醇/水滗析器(例如，丁醇/水滗析器)。
[0222]预闪蒸塔的底部馏出物可以前进至溶剂滗析器。预闪蒸塔的底部馏出物可以经历对游离醇(例如，丁醇)的充分提取。所述滗析器可以是静态井、离心机或水力旋流器。在该滗析器中，水基本上与溶剂相分离，产生水相。包括悬浮的和溶解的固体的所述水相可被离心以产生湿滤饼和稀薄的釜馏物。所述湿滤饼可以与其他的流混合并被干燥以产生DDGS，它可被干燥并与产生DDGS的其他的流分别地销售，或者它可以作为湿滤饼被销售。所述水相可被分流以提供逆流，所述逆流被部分地用于使上文所述的滤饼再浆化。分流还提供了稀薄的釜馏物，其可被泵入蒸发器，用于进一步加工。
[0223]在溶剂滗析器中产生的有机相可以是醇(例如丁醇)的酯。所述溶剂可被水解以再生活性溶剂和回收附加的醇(例如丁醇)。作为另外一种选择，所述有机相可被过滤和作为产品被销售。水解可以是热驱动的、均相催化的或非均相催化的。水解还可通过酶反应发生。对该过程的供热可以是火焰加热器、热油、电供热或高压蒸汽。所添加的用于驱动水解的水可以来自循环的水流、新鲜的水或蒸汽。[0224]冷却的水解的溶剂可被泵入亚大气压溶剂塔中，可以用蒸汽在其中基本上提取出其中的醇(例如丁醇)。所述蒸汽可以是来自蒸发器的水蒸气，它可以是来自醪的处理的闪蒸步骤的蒸汽，或者它可以是来自锅炉的蒸汽(参见例如美国专利申请公布2009/0171129，该专利以引用方式并入本文）。来自常规的干磨乙醇车间的精馏塔可以适合作为溶剂塔。所述精馏塔可被改造以作为溶剂塔。所述溶剂塔的底部馏出物可被冷却，例如，通过冷却水或流程间热交换。冷却的底部馏出物可被滗析以除去残余的水，并且这些水可被循环至所述过程的其他步骤，或者被循环至制醪步骤。[0225]所述溶剂塔的塔顶馏出物可通过与冷却水的交换或通过流程间热交换被冷却，并且冷凝物可被导入排放的醇/水滗析器(例如，丁醇/水滗析器)，所述滗析器可以是与预闪蒸塔的塔顶馏出物共用的。其他混合的水和醇(例如，丁醇)的流可被添加至上述滗析器中，包括涤气器的底部馏出物和来自脱气步骤的冷凝物。包含二氧化碳的排出气可被引入水涤气器中。该滗析器的含水层也可被进料至所述溶剂塔，或者可以在小的专用蒸馏塔中被提取醇(例如，丁醇)。所述含水层可通过与预闪蒸塔的塔顶馏出物、溶剂塔的塔顶馏出物或溶剂塔的底部馏出物的流程间交换而被预热。上述专用的塔可以是从常规的干磨燃料乙醇工艺的侧线汽提塔改造而来。[0226]所述醇/水滗析器(例如，丁醇/水滗析器）的有机层可被泵入醇(例如，丁醇）塔中。该塔可以是超大气压塔，并且可以由再沸器内的蒸汽冷凝作用驱动。该塔的进料可通过流程间热交换被加热以减少塔的运行所需的能量。这种流程间热交换可包括预闪蒸塔的部分冷凝器、溶剂塔的部分冷凝器、水解器的产物、来自蒸发器的水蒸气或丁醇塔的底部馏出物。上述醇(例如，丁醇）塔的蒸气的冷凝物可被冷却，并且可以回到上述醇/水滗析器(例如，丁醇/水滗析器）中。上述醇(例如，丁醇）塔的底部馏出物可通过包括与所述醇(例如，丁醇）柱的进料的交换的流程间热交换被冷却、并且可以用冷却水进一步冷却、被过滤、以及作为产物醇(例如，丁醇）被销售。[0227]从如上文所述的预闪蒸塔的底部馏出物产生的稀薄釜馏物可被引入多效蒸发器中。所述蒸发器可以具有两个、三个或更多个阶段。所述蒸发器可以具有四器身、两效，与燃料乙醇车间的常规设计相似，它可以具有三器身、三效，或者它可以具有其他配置方式。稀薄的釜馏物可以进入任何的效。第一效的器身中的至少一个可以用来自所述超大气压的醇(例如，丁醇)塔的蒸气加热。蒸气可从压力最低的效取出，用于向所述亚大气压的预闪蒸塔和溶剂塔以水蒸气形式提供热。来自蒸发器的糖浆可被添加至酒糟干燥器。[0228]来自发酵器、脱气器、醇/水滗析器(例如，丁醇/水滗析器）以及其他来源的二氧化碳排放可被引入水涤气器中。提供至该涤气器顶部的水可以是新鲜制备的水，或者可以是循环水。所述循环水可被处理(例如，经过生物学消化)以除去挥发性的有机化合物，并且可以是冰冷的。涤气器的底部馏出物可被送至上述醇/水滗析器(例如，丁醇/水滗析器)、送至上述溶剂塔或者可与其他循环水一起被用于使上文所述的湿滤饼再浆化。可以用厌氧的生物学消化或其他方法处理来自蒸发器的冷凝物以在回收用于使滤饼再浆化之前对水进行纯化。[0229]如果玉米被用作磨碎的谷物的来源，玉米油可在多个位点中的任何位点从工艺流分离。例如，可以操作离心机以产生煮过的醪的过滤之后的玉米油的流，或者可以操作预闪蒸塔的水相离心机以产生玉米油的流。用于最终的糖浆的中等浓度的糖浆可被离心以产生玉米油的流。
[0230]在本发明的方法的实施方案的另一个实例中，从发酵器排出的材料可以在分离体系中被处理，所述分离体系包括诸如离心机、沉降器、水力旋流器等、以及它们的组合的装置以有效地回收浓缩形式的活酵母，所述活酵母可被回收，用于直接地或经过一些再调节之后在随后的发酵批次中重新使用。上述分离体系还可产生包含产生自发酵过程的脂肪酸酯(例如，异丁基脂肪酸酯)和醇(例如，异丁醇)的有机物流，和包含仅为痕量水平的不能混溶的有机物的含水的流。在提取这种含水的流的醇(例如，异丁醇)内容物之前或之后，所述含水的流可被用于再浆化和抽取分离自液化的醪并经过洗涤的低淀粉的固体。这具有避免了否则可能需要长的皮带驱动的输送系统来将这些固体从液化区域传送至谷物干燥和糖浆共混区域这一优点。此外，在醇(例如，异丁醇)已被提取之后产生的总的釜馏物将需要用现有的或新的分离装置分离为稀薄的釜馏物和湿滤饼级分，并且上述稀薄的釜馏物将部分地形成逆流，所述逆流回过来与用来煮的水相结合，用于制备新的批次的可发酵的醪。该实施方案的另一个优点是，从液化的醪分离的固体的水分中保留的任何残余的溶解的淀粉，将部分地被捕获并通过上述逆流被回收。作为另外一种选择，所述固体的流中包含的酵母可被认为是不能存活的，并且可被再分散至含水的流中，这种合并的流蒸馏了从发酵中残留的任何的醇(例如，丁醇)内容物。不能存活的微生物可以进一步被分离，用作增殖过程中的营养素。
[0231]在另一个实施方案中，多相材料可从预闪蒸塔的底部离开，并可在如上所述的分离体系中被处理。浓缩的固体可被再分散于含水的流中，并且这种合并的流可被用于再浆化和抽取分离自液化的醪并经过洗涤的低淀粉的固体。
[0232]上述过程以及本文所述的其他过程可使用计算模型如Aspen模型来演示(参见例
如美国专利 7，666，282)。 例如，商业建模软件 AspCllPiuS* (Aspen Technology, Inc.，
Burlington, MA)可以结合物理特性数据库如可购自American Institute of ChemicalEngineers, Inc., (NewYork, NY)的DIPPR,来开发用于完整的丁醇发酵、纯化和水管理过程的Aspen模型。这种过程建模可进行许多基本的工程计算，例如质量和能量平衡，气/液平衡以及反应速率计算。为了产生Aspen模型，所输入的信息可包括例如实验数据、水含量和原料的组成、用于醪的煮制和闪蒸的温度、糖化条件(例如，酶的进料、淀粉的转化、温度、压力)、发酵条件(例如，微生物的进料、葡萄糖的转化、温度、压力)、脱气条件、溶剂塔、预闪蒸塔、冷凝器、蒸发器、离心机等。
[0233]本发明提供了用于通过发酵生产发酵产物如产物醇、以及提高生物质处理生产率和成本效率的体系和方法。在一些实施方案中，产物醇为丁醇。原料可被液化以产生原料浆液，其中所述原料浆液包括可溶解的糖和未溶解的固体。如果所述原料浆液被直接进料至发酵器，未溶解的固体可以干扰产物醇如丁醇从发酵器的有效移出和回收。具体地，当液-液提取被用于从发酵培养液提取丁醇时，未溶解的颗粒的存在可以导致体系的低效率，包括但不限于通过干扰提取剂和发酵培养液之间的接触，降低丁醇至提取剂的传质速率；在发酵器中产生乳液，从而干扰提取剂和发酵培养液之间良好的相分离；降低提取剂的回收和循环利用的效率，因为提取剂和丁醇的至少一部分变成“裹挟”在最终会作为DDGS被移除的固体中；较低的发酵器体积效率，因为固体占据了发酵器中的体积以及因为提取剂与发酵培养液的分离较慢；和使提取剂的生命周期因其受到玉米油的污染而缩短。所有这些影响导致了更高的资本和运营成本。 此外，“裹挟”在DDGS中的提取剂可以降低DDGS的价值和损害其作为动物饲料销售的资质。因此，为了避免和/或使这些问题最小化，在原料浆液中存在的糖被添加至发酵器之前，未溶解的颗粒(或固体）的至少一部分从所述原料浆液移除。相对于在包含其中未溶解的颗粒未被移除的水溶液的发酵培养液上进行的提取，当提取是在包含其中未溶解的颗粒已被移除的水溶液的发酵培养液上进行时，丁醇生产的提取活性和效率是提闻的。
[0234]在未溶解的固体的不存在下的萃取发酵，可导致产物醇从发酵培养液至提取剂的更高的传质速率、提取剂与发酵培养液在发酵器的内部或外部更好的相分离、以及由于更高的提取剂小滴上浮速率而更低的提取剂滞留。此外，例如，发酵过程中滞留在发酵培养液中的提取剂小滴将更快、更彻底地脱离发酵培养液，从而导致发酵培养液中更少的游离提取剂和可降低所述过程中损失的提取剂的量。此外，例如，微生物可被循环利用，并且下游工艺中的附加的设备可被淘汰，例如发酵培养液塔和/或一些或全部的总的釜馏物离心机。而且，例如，排除了提取剂在DDGS中损失的可能性。而且，例如，循环利用微生物的能力可提高产物醇生产的总体速率、降低总体滴度要求和/或降低水相滴度要求、从而导致更健康的微生物和更高的生产率。此外，例如，有可能可在发酵器中排除搅拌器，从而降低成本；可由于体积的使用更加高效（因为提取剂的滞留被最小化并且不存在未溶解的固体）而提高发酵器的产率；和/或可在新建工厂中使用连续发酵和较小的发酵器。
[0235]提高的提取效率的实例可包括例如稳定的分配系数、增强的(例如，更快或更彻底的）相分离、提高的液-液传质系数、以较低的滴度运行、提高的工艺流再循环能力、提高的发酵体积效率、提高的原料(例如，玉米）载量输入、提高的微生物(例如，重组微生物）的丁醇滴度耐受性、水的循环利用、能耗的降低、提高的提取剂的循环利用和/或微生物的循环利用。
[0236]例如，被固体占据的发酵器的体积将降低。因此，可提高可供用于发酵的发酵器的有效体积。在一些实施方案中，可供用于发酵的发酵器的体积提高了至少约10%。
[0237]例如，可存在分配系数的稳定化。因为发酵器中的玉米油可通过在发酵之前从原料浆液中移除固体而被降低，提取剂暴露于更少的玉米油，而玉米油会与提取剂结合，并且如果其以足够的量存在可以降低分配系数。因此，引入发酵器的玉米油的减少，导致了发酵器中的提取剂相更稳定的分配系数。在一些实施方案中，所述分配系数经过10个发酵周期降低了小于约10%。
[0238]例如，因为将存在产物醇从发酵培养液向提取剂的更高的传质速率(例如以更高的传质系数的形式)，可存在用提取剂对丁醇的提取效率的提高，从而导致提高的产物醇的生产效率。在一些实施方案中，所述传质系数提高了至少2倍(参见实施例4和5)。
[0239]此外，可存在发酵培养液和提取剂之间相分离的提高，这种提高降低了乳液形成的可能性，从而导致提高的产物醇的生产效率。例如，相分离可发生得更快地或可更彻底。在一些实施方案中，相分离可以在此前在24小时中没有观察到可评估的相分离的地方发生。在一些实施方案中，与固体未被移除时的相分离相比，相分离以至少约2x的速率、至少约5x的速度或至少约IOx的速度发生(参见实施例6和7)。
[0240]此外，还可存在提取剂的回收和循环利用的提高。提取剂将不被“裹挟”在最终会作为DDGS被移除的固体中，从而导致提高的产物醇的生产效率(参见实施例8和9)。而且，提取剂将会更少地被玉米油稀释，并且提取剂的降解可以更少(参见实施例10)。
[0241]而且，提取剂的流速可被降低，这将降低运行成本，从而导致产物醇的生产效率提闻。
[0242]此外，由于提取剂的小滴以更高的速度上浮，提取剂的滞留将会降低，从而导致产物醇的生产效率提高。减少发酵器中的未溶解的固体的量也会导致产物醇的生产效率提闻。
[0243]此外，可从发酵器中排除搅拌器，因为不再需要使未溶解的固体悬浮，从而降低了成本和能耗,并提高了产物醇的生产效率。
[0244]图1-5提供了涉及发酵过程的方法和体系的多种非限制性实施方案，在所述发酵过程中，醇酯在原位产生、从发酵培养基提取、并发生反应以回收产物醇。图1-5还提供了使用可与产物醇酯化并且可同时地作为ISPR提取剂的羧酸的方法和体系的多种非限制性实施方案。图1-5还提供了将原料中的脂质转化为可与产物醇酯化并且可同时地作为ISPR提取剂的羧酸的方法和体系的多种非限制性实施方案。
[0245]在一些实施方案中，包括在根据图1-5描述的任何前述实施方案中，发酵容器30中的发酵培养液包括至少一种重组微生物32，所述重组微生物32经过基因修饰(B卩，是遗传工程的)以通过生物合成途径从至少一种可发酵碳源产生丁醇。具体地，重组微生物可在包含适当的碳底物的发酵培养液中生长。附加的碳底物可包括但不限于单糖如果糖和半乳糖；低聚糖如乳糖、麦芽糖或蔗糖；多糖如淀粉或纤维素；或它们的混合物以及来自可再生的原料的未纯化的混合物，所述可再生的原料例如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜和大麦芽。其他碳底物可包括乙醇、乳酸盐、琥珀酸盐或甘油。
[0246]另外，碳底物也可以是已被证明可被代谢转化为关键生化中间产物的诸如二氧化碳或甲醇的一碳底物。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体也已知可利用多种其它含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和用于代谢活动的多种氨基酸。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.Growth Cl Compd.,[Int.Symp.]，第 7 版(1993), 415-32,编辑:Murrell, J.Collin ；Kelly, Don P.Publisher:Intercept, Andover, UK)。类似地,假丝酵母属的多种物种将会代谢丙氨酸或油酸(Suiter等人，Arch.Microbiol.153:485-489，1990)。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。
[0247]尽管预期以上提及的所有碳底物以及它们的混合物均是适合的，但是在一些实施方案中，对于经过修饰以利用C5糖的酵母细胞，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，或者它们与C5糖如木糖和/或阿拉伯糖的混合物。蔗糖可来源于可再生的糖源例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱、以及它们的混合物。葡萄糖和右旋糖可通过糖化淀粉基原料来源于可再生的谷物来源，包括谷物如玉米、小麦、黑麦、大麦、燕麦、以及它们的混合物。此外，可发酵糖类可通过预处理和糖化过程来源于可再生的纤维质的或木质纤维质的生物质，例如美国专利申请公布2007/0031918A1中所述，该专利以引用方式并入本文。除了(来自含水的流22的)合适的碳源外，发酵培养液还必须含有本领域的技术人员已知的适合培养物生长和促进用于生产产物醇的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂和其他组分。[0248]通过以上的论述和实施例，本领域的技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的前提下，可对本发明实施各种变化和修改以使其适应多种用途和条件。例如，在一些实施方案中，根据本发明的醇的酯化和提取，可在发酵前被使用，即，在发酵容器30中的发酵之前的微生物32的种菌培养期间。通常，微生物32如酵母在被收获和接种进发酵容器30之前，可从种菌培养物生长至所期望的细胞浓度，如本领域所已知。
[0249]在微生物生产如酵母生产中，碳源原料是重要的成本因素，因此生物质在糖上的收率是重要的优化判据。因为来自酒精发酵的ATP产量大大低于来自糖的呼吸异化的，酒精发酵的发生不利地影响生物质收率，并且在酵母生产(例如种菌培养）的过程中是被力求避免的。尽管如此，微生物在种菌培养培养基中的培养可产生一定量的包括醇的发酵产物。例如，在啤酒糖酵母中，每当特异性生长速率（μ)和/或糖的浓度在有氧培养物中超过临界值，酒精发酵即与呼吸作用同时发生(参见例如van Hoek,等人，Biotechnol.Bioeng. 68:517-523,2000)。为了实现高的生物质收率，酵母的生长通常是受控的，例如通过对于种菌培养使用分批补料发酵技术的呼吸条件。例如，糖以较低的速率补料导致培养物中较低的糖浓度和较低的糖摄入速率，使得糖的代谢可基本上是呼吸作用。在这些条件下，可获得高的生物质收率，并且毒性产物的积累可被最小化。在实践中，在大规模的分批补料工业生产过程中，由于混合不足，细胞可暴露于浓度梯度(参见例如Enfors，等人，J. Biotechnol. 85:175-185，2001)。发酵副产物的产生和再同化作用可以是按葡萄糖计的生物质收率在大规模生物反应器中与在实验室规模相比降低的原因之一。
[0250]然而，在这些条件下，当培养产生丁醇的酵母时，例如包括丁醇的发酵产物不可被再同化，并且可在培养基中积累，其在高浓度时对微生物可以是毒性的。如果产物的积累超过了临界的细胞生长抑制性浓度(例如，细胞生长低于可以是受进料限制的生长)，则可能发生分批补料控制的失败。根据本发明，使用醇的酯化和提取来从培养基移出丁醇可允许分批补料发酵继续进行，而没有混合不足和丁醇毒性的问题。
[0251]因此，根据一些实施方案，种菌培养基可与催化剂42和羧酸28接触，导致通过产物醇的酯化作用产生醇酯以及最终导致在大规模生物反应器中按葡萄糖计的生物质收率提高。此外，产物醇在培养基中的浓度可通过醇的酯化作用来控制，并因此最小化或避免产物醇对微生物的有毒影响。在一些实施方案中，能够以与上文关于从发酵容器30提取醇酯和回收产物醇54所述相同的方式，从种菌培养基提取醇酯和从所述醇酯回收醇。在一些实施方案中，根据本发明的醇的酯化作用可被用于使产物醇在种菌培养基中和发酵培养基中酯化。在此类实施方案中，通过既从发酵培养基回收醇酯(和游离的产物醇）又回收种菌培养过程中产生的醇酯(例如,从增殖罐回收醇酯和/或产物醇),对于总的发酵过程可实现产物醇的更高收率。在一些实施方案中，根据本发明的醇的酯化作用可在发酵前被用于从种菌培养基移出醇，而产物醇的常规ISPR可被用于在发酵容器30中的发酵过程中移出产物醇。
[0252]因此，应当显而易见的是，根据本发明的醇的酯化和提取可在醇发酵过程中的多个阶段被使用，而不会脱离本发明。
[0253]通过本发明的方法产生的醇产物具有多种应用，例如，作为试剂、溶剂和燃料。通过受权利要求书保护的方法产生的丁醇可被直接用作燃料(例如，生物燃料)、燃料添加剂、用于产生可被用作柴油或生物柴油燃料的酯的醇、塑料工业中的原料化学品、配制产品如化妆品中的成分和化学中间体。丁醇还可被用作颜料、涂料、清漆、树脂、树胶、染料、脂肪、蜡类、树脂、紫胶、橡胶和生物碱的溶剂。因此，本发明提供了生产醇，包括丁醇的替代性方法，其可支持对这些工业化学品的高需求。
[0254]重鉬微牛物和丁醇牛物合成涂径
[0255] 不受理论的束缚，据信本文所述的方法连同任何产生醇的微生物是有用的，尤其是以高于它们的耐受性水平的滴度产生醇的那些重组微生物。
[0256]产生醇的微生物是本领域已知的。例如，甲烷通过甲烷氧化菌(例如，发孢甲基弯菌（Methylosinus trichosporium))的发酵性氧化产生甲醇，使甲醇（C1烷基醇）与羧酸和催化剂接触可使所述羧酸与甲醇酯化形成所述羧酸的甲醇酯。酵母菌株CEN.PK113-7D(CBS8340, Centraal Buro voor Schimmelculture ；van Dijken,等人，EnzymeMicrob. Techno. 26:706-714,2000)可产生乙醇，并且使乙醇与羧酸和催化剂能够使所述羧酸与乙醇酯化形成乙酯(参见例如实施例36)。
[0257]产生醇的重组微生物也是本领域已知的（例如，Ohta,等人，Appl. Environ.Microbiol. 57:893-900,1991 ；Underwood,等人，Appl. Environ. Microbiol. 68:1071-1081,2002 ；Shen 和 Liao, Metab. Eng. 10:312-320, 2008 ；Hahnai,等人，Appl. Environ.Microbiol. 73:7814-7818，2007 ;美国专利 5，514，583 ;美国专利 5，712，133 ；PCT 专利申请公布 W01995/028476 ;Feldmann，等人，Appl. Microbiol. Biotechnol. ”，38:354-361，1992 ；Zhang,等人，Science267:240-243，1995 ;美国专利申请公布 2007/0031918A1 ;美国专利7，223，575 ;美国专利7，741，119 ;美国专利申请公布2009/0203099A1 ;美国专利申请公布2009/0246846A1 ;和PCT专利申请公布W02010/075241，上述文献以引用方式并入本文）。
[0258] 能够产生丁醇的适合的重组微生物是本领域已知的，并且本文描述了某些能够产生丁醇的适合的微生物。通过生物合成途径产生丁醇的重组微生物可包括下列的属的成员：梭菌属（Clostridium)、发酵单胞菌属（Zymomonas)、埃希氏菌属（Escherichia)、沙门氏菌属（Salmonella)、沙雷氏菌属（Serratia)、欧文氏菌属（Erwinia)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、志贺氏菌属（Shigella)、红球菌属（Rhodococcus)、假单胞菌属（Pseudomonas)、芽抱杆菌属（Bacillus)、乳杆菌属（Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus )、产喊杆菌属（Alcaligenes)、克雷伯氏菌属（Klebsiella)、类芽胞杆菌属（Paenibacillus)、节杆菌属（Arthrobacter )、棒状杆菌属（Corynebacterium)、短杆菌属（Brevibacterium)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属（Yarrowia)、毕赤酵母属（Pichia)、假丝酵母属（Candida)、汉逊酵母属（Hansenula)、伊萨酵母属（Issatchenkia)或酵母属（Saccharomyces)。在一个实施方案中，重组微生物可选自大肠杆菌（Escherichia coli)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)和啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)。在一个实施方案中，所述重组微生物是酵母。在一个实施方案中，所述重组微生物为克拉布特里阳性酵母，其选自酵母属、接合酵母属（Zygosaccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、德克酵母属（Dekkera)、球拟酵母属（Torulopsis)、酒香酵母属(Brettanomyces)、以及假丝酵母属（Candida)的一些菌种。克拉布特里阳性酵母的菌种包括但不限于啤酒糖酵母、克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)、贝酵母（Saccharomyces bayanus)、芽殖酵母（Saccharomyces mikitae)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii)和光滑假丝酵母（Candida glabrata)。
[0259]在一些实施方案中，所述宿主细胞是啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae)。啤酒糖酵母（S. cerevisiae)是本领域已知的，并且可得自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心（Rockville，MD)、皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心（CBS)真菌生物多样性中心（Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal BiodiversityCentre)、LeSaffre、Gert Strand AB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、Martrex 和 Lallemand。啤酒糖酵母（S. cerevisiae)包括但不限于 BY4741、CEN. PK113-7D、
Ethanol Red?酵母、Gert Strand Prestige Turbo 酵母、Ferm Pr。? 酵母、Bio-Fe_? XR酵母、Gert Strand Prestige Batch Turbo alcohol 酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert Strand Distillers Turbo 酵母、FerMax? Green 酵母、FerMax? Gold 酵母、
Thermosacc酵母、BG-I、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960 和 CBS7961。
[0260]利用微生物发酵生产丁醇以及产生丁醇的微生物是已公开的，例如在美国专利申请公布2009/0305370中，该专利以引用方式并入本文。在一些实施方案中，微生物包含丁醇生物合成途径。在一些实施方案中，催化一种途径的底物至产物的转化的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种多肽在所述微生物中由异源性多核苷酸编码。在一些实施方案中，催化一种途径的底物至产物的转化的全部多肽在所述微生物中由异源性多核苷酸编码。在一些实施方案中，所述微生物包含丙酮酸脱羧酶活性的降低或消除。基本上不含丙酮酸脱羧酶活性的微生物描述于美国专利申请公布2009/0305363中，该专利以引用方式并入本文。基本上不含具有NAD-依赖的甘油3-磷酸脱氢酶活性的酶如GPD2的微生物也描述于该专利中。
[0261]用于生产丁醇的适当的生物合成途径是本领域中已知的并且某些适当的途径描述于本文中。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含至少一种对宿主细胞而言是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含一种以上对宿主细胞是异源的基因。在一些实施方案中，所述丁醇生物合成途径包含异源基因，所述异源基因编码的多肽对应于生物合成途径的每一步骤。
[0262]本文描述了具有催化所指示的底物向产物的转化的能力的某些适当的蛋白质，并且本领域中提供了其他适当的蛋白质。例如，美国专利申请公布2008/0261230、2009/0163376和2010/0197519 (上述专利以引用方式并入本文)描述了乙酰羟酸异构还原酶；美国专利申请公布2010/0081154 (该专利以引用方式并入本文)描述了二羟酸脱水酶；醇脱氢酶描述于美国专利申请公布2009/0269823中，该专利以引用方式并入本文。
[0263]本领域的技术人员充分理解许多水平的序列同一性对鉴定来自其它物种的多肽有用，其中此类多肽具有相同或相似功能或活性，并且适合用于本文所述的重组微生物中。同一性百分比的有用实例包括但不限于75%、80%、85%、90%或95%，或者从75%至100%的任何整数百分比在对本发明的描述中可以是有用的，例如75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%。[0264]1- 丁醇牛物合成涂径
[0265]Donaldson等人在美国专利申请公布2008/0182308A1中描述了用于产生1-丁醇的生物合成途径以及可使用的适合的多肽和编码此类多肽的多核苷酸，该专利以引用方式并入本文。该生物合成途径包括以下底物至产物的转化:
[0266]a)乙酰-CoA至乙酰乙酰_CoA，其可被例如乙酰-CoA乙酰转移酶催化；
[0267]b)乙酰乙酰-Cok至3-羟丁酸-CoA，其可被例如3_羟丁酸-Cok脱氢酶催化；
[0268]c) 3-羟丁酸-CoA至丁烯酰_CoA，其可被例如巴豆酸酶催化；
[0269]d) 丁烯酰-Cok至丁酰-Coh,其可被例如丁酰-Cok脱氢酶催化；
[0270]e) 丁酰-CoA至丁醛，其可被例如丁醛脱氢酶催化；以及
[0271]f) 丁醛至1- 丁醇，其可被例如1- 丁醇脱氢酶催化。
[0272]在一些实施方案中，所述1-丁醇生物合成途径包含对所述酵母细胞是异源的至少一种基因、至少两种基因、至少三种基因、至少四种基因或至少五种基因。在一些实施方案中，所述重组宿主细胞包含针对1- 丁醇生物合成途径的每一底物至产物的转化的异源性基因。
[0273]2~ 丁醇牛物合成涂径
[0274]Donaldson 等人在美国专利申请公布 2007/0259410A1 和 2007/0292927A1 以及PCT专利申请公布W02007/130521中描述了用于产生2-丁醇的生物合成途径以及可使用的适合的多肽和编码此类多肽的多核苷酸，全部这些专利以引用方式并入本文。一种2-丁醇生物合成途径包括以下底物至产物的转化:
[0275]a)丙酮酸至α -乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
[0276]b) α -乙酰乳酸至乙偶姻，其可被例如乙酰乳酸脱羧酶催化；
[0277]c)乙偶姻至2，3- 丁二醇，其可被例如丁二醇脱氢酶催化；
[0278]d) 2，3- 丁二醇至2- 丁酮的转化，其可被例如丁二醇脱水酶催化；以及
[0279]e) 2- 丁酮至2_ 丁醇，其可被例如2_ 丁醇脱氢酶催化。
[0280]在一些实施方案中，所述2-丁醇生物合成途径包含对所述酵母细胞是异源的至少一种基因、至少两种基因、至少三种基因或至少四种基因。在一些实施方案中，所述重组宿主细胞包含针对2- 丁醇生物合成途径的每一底物至产物的转化的异源性基因。
[0281]异丁醇生物合成途径
[0282]美国专利申请公布2007/0092957A1和PCT专利申请公布W02007/050671中描述
了用于产生异丁醇的生物合成途径以及可使用的适合的多肽和编码此类多肽的多核苷酸，上述专利以引用方式并入本文。一种异丁醇生物合成途径包括以下底物至产物的转化:
[0283]a)丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；
[0284]b)乙酰乳酸至2，3- 二羟基异戊酸，其可被例如乙酰羟酸还原异构酶催化；
[0285]c)2, 3- 二羟基异戊酸至α _酮异戊酸，其可被例如乙酰羟酸脱水酶催化；
[0286]d) α -酮异戊酸至异丁醛，其可被例如支链酮酸脱羧酶催化；以及
[0287]e)异丁醛到异丁醇，其可被例如支链醇脱氢酶催化。
[0288]编码催化所述异丁醇生物合成途径的底物至产物的转化的酶的适合的多肽以及对应于针对所指示的途径步骤的适合的酶的酶学委员会(E.C.)编号，包括但不限于表AA和BB中的那些。本领域的技术人员将容易地获得与给定的E.C.编号相关联的适合的酶，。例如，通过 BRENDA 数据库（http://www. brenda-enzymes. org/)。
[0289]表AA :实例多狀
[0290]
【权利要求】
1.生产丁酯的方法，包括: 使在发酵过程中产生的丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯； 其中所述羧酸在所述发酵过程中以足够产生两相混合物的浓度存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述丁醇的产生和所述丁酯的产生同时发生或顺序发生。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵过程中的原料包含一种或多种可发酵糖类。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述发酵过程中的原料包含一种或多种来源于玉米粒、玉米棒、作物残留物如玉米壳、玉米秸杆、草、小麦、黑麦、小麦秸杆、大麦、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、从谷物的碾磨中获得的组分、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物的可发酵糖类。
5.根据权利要求1所述的方法，还包括: 提供天然的油和通过使所述油与一种或多种酶接触而使所述天然的油的至少一部分转化为羧酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
7.根据权利要求1所 述的方法，其中所述羧酸包含12至22个碳。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述羧酸是不同羧酸的混合物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
12.从原料生产丁醇和丁酯的方法，包括: (a)提供原料； (b)使所述原料液化以产生包含低聚糖的液化的生物质； (c)分离所述原料浆液以产生包含含低聚糖的含水的流、油流和固体的产物； (d)将所述含水的流添加至包含发酵培养液的发酵容器； (e)糖化所述含水的流的低聚糖； (f)使存在于所述含水的流中的低聚糖糖化的产物发酵以产生丁醇，并同时使所述丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯，其中所述羧酸以足够产生两相混合物的浓度存在； 并且任选地，步骤(e)和(f)同时发生。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括: 从所述油流获得油和使所述油的至少一部分转化为羧酸。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述原料浆液通过以下方法分离:滗析瓶离心、三相卧螺沉降离心、叠片离心、过滤离心、滗析离心、过滤、真空过滤、带式过滤、加压过滤、筛网过滤、筛网分离、格栅、多孔格栅、浮选、水力旋流器、压滤、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器或它们的组合。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述羧酸包含12至22个碳。
17.根据权利要求12所述的方法，还包括： 在使所述油的至少一部分转化为羧酸的步骤之前，将所述油添加至发酵容器。
18.根据权利要求12所述的方法，还包括： 将附加的羧酸添加至所述发酵容器。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在添加附加的羧酸的步骤之后，所述油被转化为羧酸。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述羧酸是玉米油脂肪酸、大豆油脂肪酸或玉米油脂肪酸和大豆油脂肪酸的混合物。
21.根据权利要求12所述的方法，其中从所述油流获得的油包括甘油酯，并且所述一种或多种催化剂使所述甘油酯水解为脂肪酸。
22.根据权利要求12所述的方法，其中所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。
23.根据权利要求12所述的方法，其中所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
25.根据权利要求12所述的方法，还包括用溶剂洗涤所述固体的步骤。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述溶剂选自己烷、异丁醇、异己烷、乙醇、石油馏出物如石油醚或它们的混合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述固体被加工以形成动物饲料产品。
28.根据权利要求12所述的方法，其中所述固体被加工以形成动物饲料产品。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述动物饲料产品包含一种或多种粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸异丁酯、赖氨酸、中性洗涤剂纤维（NDF)和酸性洗涤剂纤维(ADF)。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述动物饲料产品还包含一种或多种维生素、矿物质、调味品或着色剂。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述动物饲料产品包含20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0-5重量％的甘油三酯、4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸异丁酯。
32.根据权利要求12所述的方法，其中将所述固体与所述原料浆液分离的步骤通过提高所述丁醇从所述发酵培养液至提取剂的液-液传质系数提高了丁醇生产的效率；通过提闻用提取剂提取丁醇的效率提闻了丁醇生广的效率；通过提闻发酵培养液和提取剂之间相分离的速率提高了丁醇生产的效率；通过提高提取剂的回收和循环利用提高了丁醇生产的效率；或通过降低提取剂的流速提高了丁醇生产的效率。
33.从原料生产丁醇和丁酯的方法，包括： (a)提供原料； (b)使所述原料液化以产生包含低聚糖的液化的生物质； (C)分离所述原料浆液以产生包含低聚糖和油的流和固体； (d)将所述流添加至包含发酵培养液的发酵容器；(e)糖化所述流的低聚糖； (f)使存在于所述流中的低聚糖糖化的产物发酵以产生丁醇，并同时使所述丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯，其中所述羧酸以足够产生两相混合物的浓度存在； 并且任选地，步骤(e)和(f)同时发生。
34.根据权利要求33所述的方法，还包括: 使所述油的至少一部分转化为羧酸。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述原料浆液通过以下方法分离:滗析瓶离心、三相卧螺沉降离心、叠片离心、过滤离心、滗析离心、过滤、真空过滤、带式过滤、加压过滤、筛网过滤、筛网分离、格栅、多孔格栅、浮选、水力旋流器、压滤、螺旋压榨器、重力沉降器、涡旋分离器或它们的组合。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述羧酸包含12至22个碳。
38.根据权利要求33所述的方法，还包括: 将油添加至所述发酵容器。
39.根据权利要求33所述的方法，还包括: 将附加的羧酸添加至所述发酵容器。
40.根据权利要求33所述的方法，其中在添加附加的羧酸的步骤之后，所述油被转化为羧酸。
41.根据权利要求33所述的方法，其中所述羧酸是玉米油脂肪酸、大豆油脂肪酸或玉米油脂肪酸和大豆油脂肪酸的混合物。
42.根据权利要求33所述的方法，其中所述油包括甘油酯，并且所述一种或多种催化剂使甘油酯水解为脂肪酸。
43.根据权利要求33所述的方法，其中所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。
44.根据权利要求33所述的方法，其中所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
46.根据权利要求33所述的方法，还包括用溶剂洗涤所述固体的步骤。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述溶剂选自己烷、异丁醇、异己烷、乙醇、石油馏出物如石油醚或它们的混合物。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述固体被加工以形成动物饲料产品。
49.根据权利要求33所述的方法，其中所述固体被加工以形成动物饲料产品。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述动物饲料产品包含一种或多种粗蛋白、粗脂肪、甘油三酯、脂肪酸、脂肪酸异丁酯、赖氨酸、中性洗涤剂纤维(NDF)和酸性洗涤剂纤维(ADF)。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述动物饲料产品还包含一种或多种维生素、矿物质、调味品或着色剂。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述动物饲料产品包含20-35重量％的粗蛋白、1-20重量％的粗脂肪、0-5重量％的甘油三酯、4-10重量％的脂肪酸和2-6重量％的脂肪酸异丁酯。
53.根据权利要求33所述的方法，其中将所述固体与所述原料浆液分离的步骤通过提高所述丁醇从发酵培养液至提取剂的液-液传质系数提高了丁醇生产的效率；通过提高用提取剂提取丁醇的效率提高了丁醇生产的效率；通过提高发酵培养液和提取剂之间相分尚的速率提闻了丁醇生广的效率；通过提闻提取剂的回收和循环利用提闻了丁醇生广的效率；或通过降低提取剂的流速提高了丁醇生产的效率。
54.生产丁醇的方法，包括： (a)使在发酵过程中产生的丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯； 其中所述羧酸在所述发酵过程中以足够产生包括水相和包含丁酯的有机相的两相混合物的浓度存在； (b)使包含丁酯的有机相与水相分离；以及 (c)从丁酯回收丁醇。
55.根据权利要求54所述的方法，其中从丁酯回收丁醇包括使所述酯水解为羧酸和丁醇。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述丁酯在水解催化剂的存在下被水解。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述丁酯在水的存在下被水解，并且其中所述水解催化剂包括酸催化剂、有机酸、无机酸、水溶性酸或水不溶性酸。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述水解催化剂包括能够使所述丁酯水解以形成羧酸和丁醇的酶。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述酶反应条件更有利于酶水解而非酯化作用。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述酶反应条件包括共溶剂。
62.根据权利要求61所述的方法，其中脂肪酸丁酯、脂肪酸、异丁醇和水能够溶于所述共溶剂中，并且其中游离脂肪酸不与所述共溶剂反应。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述共溶剂选自丙酮、叔-丁醇、2-甲基-2-丁醇、2-甲基-2-戊醇和3-甲基-3-戊醇。
64.根据权利要求60所述的方法，其中所述酶反应条件包括终产物的移出。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述终产物是异丁醇或脂肪酸。
66.根据权利要求65所述的方法，其中异丁醇通过真空蒸馏、全蒸发、选择性渗透过滤或气体鼓泡搅拌被移出。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述脂肪酸通过沉淀、选择性渗透过滤或电泳被移出。
68.根据权利要求55所述的方法，其中所述水解反应在反应容器中发生。
69.根据权利要求54所述的方法，其中从所述丁酯回收丁醇包括使所述丁酯酯交换为丁醇和脂肪酸烷基酯或酰基甘油酯。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或脂肪酸丙酯。
71.根据权利要求54所述的方法，还包括: 提供天然的油和通过使所述天然的油与一种或多种酶接触而使所述油的至少一部分转化为羧酸。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述酶是能够使丁酯水解或酯交换以形成丁醇的酶。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
74.根据权利要求54所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
75.根据权利要求54所述的方法，其中所述羧酸具有在12至22个碳范围内的碳链长度。
76.根据权利要求54所述的方法，其中至少约10%的丁醇从丁酯回收。
77.根据权利要求54所述的方法，其中至少约50%的丁醇从丁酯回收。
78.根据权利要求54所述 的方法，其中至少约90%的丁醇从丁酯回收。
79.根据权利要求54所述的方法，其中羧酸从所述丁酯回收。
80.根据权利要求54所述的方法，还包括以下步骤: 从发酵罐移出丁醇作为提取剂流；以及 将所述提取剂流添加至两个或更多个蒸馏塔。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述蒸馏塔是具有蒸汽加热的再沸器的超大气压力蒸馏塔。
82.根据权利要求80所述的方法，还包括以下步骤:从所述蒸馏塔回收水和溶剂；和循环利用所述水和溶剂。
83.根据权利要求80所述的方法，还包括以下步骤:从所述蒸馏过程回收热；和循环利用所述热以蒸发水。
84.从原料生产丁醇的方法，包括: (a)提供原料； (b)使所述原料液化以产生原料浆液； (c)分离所述原料浆液以产生包含含水的流、油流和固体的产物； (d)将所述含水的流添加至包含发酵培养液的发酵容器； (e)糖化所述含水的流； (f)使糖化的含水的流发酵以产生丁醇，并同时使丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯，其中所述羧酸以足够产生两相混合物的浓度存在； (g)使包含丁酯的有机相与水相分离；以及 (h)从丁酯回收丁醇； 并且任选地，步骤(e)和(f)同时发生。
85.根据权利要求84所述的方法，还包括: 从所述油流获得油和使所述油的至少一部分转化为羧酸。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述原料浆液通过离心、过滤或滗析被分离。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
88.根据权利要求84所述的方法，其中所述羧酸具有在12至22个碳范围内的碳链长度。
89.根据权利要求84所述的方法，还包括： 在使所述油的至少一部分转化为羧酸的步骤之前，将所述油添加至发酵容器。
90.根据权利要求84所述的方法，还包括： 将附加的羧酸添加至所述发酵容器。
91.根据权利要求90所述的方法，其中在添加附加的羧酸的步骤之后，所述油被转化为羧酸。
92.根据权利要求84所述的方法，其中所述羧酸是玉米油脂肪酸、大豆油脂肪酸或玉米油脂肪酸和大豆油脂肪酸的混合物。
93.根据权利要求84所述的方法，其中从所述油流获得的油包括甘油酯，并且所述一种或多种催化剂使甘油酯水解为脂肪酸。
94.根据权利要求84所述的方法，其中所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。
95.根据权利要求84所述的方法，其中所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
97.根据权利要求84所述的方法，其中所述固体被加工以形成动物饲料产品。
98.根据权利要求84所述的方法，其中从丁酯回收丁醇包括使所述酯水解为羧酸和丁醇。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述丁酯在水解催化剂的存在下被水解。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述丁酯在水的存在下被水解，并且其中所述水解催化剂包括酸催化剂、有机酸、无机酸、水溶性酸或水不溶性酸。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述水解催化剂包括能够使所述丁酯水解以形成羧酸和丁醇的酶。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
103.根据权利要求98所述的方法，其中所述水解反应在反应容器中发生。
104.根据权利要求84所述的方法，其中从丁酯回收丁醇包括使所述丁酯酯交换为丁醇和脂肪酸烷基酯或酰基甘油酯。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或脂肪酸丙酯。
106.根据权利要求84所述的方法，还包括： 提供天然的油和通过使所述天然的油与一种或多种酶接触而使所述油的至少一部分转化为羧酸。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述酶是能够使丁酯水解或酯交换以形成丁醇的酶。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
109.从原料生产丁醇和丁酯的方法，包括： (a)提供原料；(b)使所述原料液化以产生包含低聚糖的液化的生物质； (c)分离所述原料浆液以产生包含低聚糖和油的含水的流和固体； (d)将所述含水的流添加至包含发酵培养液的发酵容器； (e)糖化所述含水的流的低聚糖； (f)使存在于所述含水的流中的低聚糖糖化的产物发酵以产生丁醇，并同时使丁醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯，其中所述羧酸以足够产生两相混合物的浓度存在； (g)使包含丁酯的有机相与水相分离；以及 (h)从丁酯回收丁醇； 并且任选地，步骤（e)和（f)同时发生。
110.根据权利要求109所述的方法，还包括： 使所述油的至少一部分转化为羧酸。
111.根据权利要求109所述的方法，其中所述原料浆液通过离心、过滤或滗析被分离。
112.根据权利要求109所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
113.根据权利要求109所述的方法，其中所述羧酸包含12至22个碳。
114.根据权利要求109所述的方法，还包括： 将油添加至所述发酵容器。
115.根据权利要求109所述的方法，还包括： 将附加的羧酸添加至所述发酵容器。
116.根据权利要求115所述的方法，其中在添加附加的羧酸的步骤之后，所述油被转化为羧酸。
117.根据权利要求109所述的方法，其中所述羧酸是玉米油脂肪酸或大豆油脂肪酸。
118.根据权利要求109所述的方法，其中所述羧酸是玉米油脂肪酸和大豆油脂肪酸的混合物。
119.根据权利要求109所述的方法，其中所述油包括甘油酯，并且所述一种或多种催化剂使甘油酯水解为脂肪酸。
120.根据权利要求109所述的方法，其中所述羧酸的丁酯是脂肪酸的丁酯。
121.根据权利要求109所述的方法，其中所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
123.根据权利要求109所述的方法，其中所述固体被加工以形成动物饲料产品。
124.根据权利要求109所述的方法，其中从丁酯回收丁醇包括使所述酯水解为羧酸和丁醇。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述丁酯在水解催化剂的存在下被水解。
126.根据权利要求125所述的方法，其中所述丁酯在水的存在下被水解，并且其中所述水解催化剂包括酸催化剂、有机酸、水溶性酸或水不溶性酸。
127.根据权利要求125所述的方法，其中所述水解催化剂包括能够使所述丁酯水解以形成羧酸和丁醇的酶。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
129.根据权利要求124所述的方法，其中所述水解反应在反应容器中发生。
130.根据权利要求109所述的方法，其中从丁酯回收丁醇包括使所述丁酯酯交换为丁醇和其他脂肪酸烷基酯或酰基甘油酯。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述其他脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯、月旨肪酸乙酯或脂肪酸丙酯。
132.根据权利要求109所述的方法，还包括: 提供天然的油和通过使所述天然的油与一种或多种酶接触而使所述油的至少一部分转化为羧酸。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述酶是能够使丁酯水解或酯交换以形成丁醇的酶。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
135.生产醇酯的方法，包括: 使在发酵过程中产生的醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触， 所述催化剂能够使所述羧酸与所述醇酯化形成所述羧酸的醇酯； 其中所述羧酸在所述发酵过程中以足够产生两相混合物的浓度存在。
136.根据权利要求135所述的方法，其中所述醇的产生和醇酯的产生同时发生或顺序发生。
137.根据权利要求135所述的方法，其中所述发酵过程中的原料包含一种或多种可发酵糖类。
138.根据权利要求135所述的方法，其中所述发酵过程中的原料包含一种或多种来源于玉米粒、玉米棒、作物残留物如玉米壳、玉米秸杆、草、小麦、黑麦、小麦秸杆、大麦、大麦秸杆、干草、稻杆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、甘蔗、大豆、从谷物的碾磨获得的组分、纤维素材料、木质纤维素材料、树、枝、根、叶、木片、锯末、灌木和灌丛、蔬菜、水果、花、动物粪肥、以及它们的混合物的可发酵糖。
139.根据权利要求135所述的方法，还包括: 提供天然的油和通过使所述天然的油与一种或多种酶接触而使所述油的至少一部分转化为羧酸。
140.根据权利要求135所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
141.根据权利要求135所述的方法，其中所述羧酸具有在12至22个碳范围内的碳链长度。
142.根据权利要求135所述的方法，其中所述羧酸的醇酯是脂肪酸的醇酯。
143.根据权利要求135所述的方法，其中所述催化剂是能够使所述羧酸与所述丁醇酯化形成所述羧酸的丁酯的酶。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
145.根据权利要求135所述的方法，其中所述醇是C2-C8烷基醇。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述C2-C8烷基醇是乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或2-甲基-1 丁醇。
147.生产醇的方法，包括: (a)使在发酵过程中产生的醇与至少一种羧酸和至少一种催化剂接触，所述催化剂能够使所述羧酸与所述醇酯化形成所述羧酸的醇酯； 其中所述羧酸在所述发酵过程中以足够产生包括水相和包含醇酯的有机相的两相混合物的浓度存在； (b)使所述包含醇酯的有机相与水相分离；以及 (c)从所述醇酯回收醇。
148.根据权利要求147所述的方法，其中从所述醇酯回收醇包括使所述酯水解为羧酸和醇。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述醇酯在水解催化剂的存在下被水解。
150.根据权利要求148所述的方法，其中所述醇酯在水的存在下被水解，并且其中所述水解催化剂包括酸催化剂、有机酸、水溶性酸或水不溶性酸。
151.根据权利要求149所 述的方法，其中所述水解催化剂包括能够使所述丁酯水解以形成羧酸和丁醇的酶。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
153.根据权利要求148所述的方法，其中所述水解反应在反应容器中发生。
154.根据权利要求147所述的方法，其中从所述醇酯回收醇包括使所述醇酯转酯化为醇和脂肪酸烷基酯或酰基甘油酯。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述脂肪酸烷基酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或脂肪酸丙酯。
156.根据权利要求147所述的方法，还包括: 提供天然的油和通过使所述天然的油与一种或多种酶接触而使所述油的至少一部分转化为羧酸。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述酶是能够使所述醇酯水解或酯交换以形成醇的酶。
158.根据权利要求157所述的方法，其中所述酶是酯酶、脂肪酶、磷脂酶或溶血磷脂酶。
159.根据权利要求147所述的方法，其中所述羧酸包括脂肪酸。
160.根据权利要求147所述的方法，其中所述羧酸具有在12至22个碳范围内的碳链长度。
161.根据权利要求147所述的方法，其中所述醇是C2-C8烷基醇。
162.根据权利要求161所述的方法，其中所述C2-C8烷基醇是乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或2-甲基-1 丁醇。
163.根据权利要求148所述的方法，其中羧酸从所述丁酯回收。
164.发酵培养液,包含: (a)能够产生产物醇的重组微生物；(b)可发酵的碳底物； (c)能够在胞外使脂肪酸与所述产物醇酯化形成脂肪酸醇酯的催化剂；以及 (d)脂肪酸醇酯，其中所述脂肪酸醇酯是在发酵过程中产生的。
165.根据权利要求164所述的发酵培养液，还包含下列中的一种或多种：酰基甘油酯、脂肪酸、产物醇或油酸。
166.根据权利要求164所述的发酵培养液，还包含催化剂，其中所述催化剂使脂肪酸与醇酯化为脂肪酸醇酯并且使甘油三酯水解为游离脂肪酸。
167.根据权利要求166所述的发酵培养液，其中所述催化剂是一种或多种脂肪酶。
168.根据权利要求167所述的发酵培养液，还包含能够使低聚糖转化为可发酵糖的糖化酶。
169.根据权利要求168所述的发酵培养液，其中所述糖化酶包括葡糖淀粉酶。
170.根据权利要求169所述的发酵培养液，其中所述可发酵糖包括单体的葡萄糖。
171.根据权利要求164所述的发酵培养液，其中所述重组微生物能够产生丁醇。
172.根据权利要求164所述的发酵培养液，其中所述脂肪酸醇酯是脂肪酸丁酯。
173.根据权利要求164所述的发酵培养液，还包含异丁醇。
174.能够产生异丁醇的重组酵母细胞，所述酵母细胞包含异丁醇生物合成途径，其中所述异丁醇生物合成途径包含催化下列各个底物至产物的转化的至少一种酶： i)丙酮酸至乙酰乳酸； ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸； iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸； iv)α-酮异戊酸至异丁醛；以及 ν)异丁醛至异丁醇； 并且其中至少一种iii)的酶或V)的酶是由整合进染色体的异源性多核苷酸编码的。
175.根据权利要求174所述的重组酵母细胞，其中所述酵母细胞基本上不含丙酮酸脱羧酶活性。
176.根据权利要求175所述的重组酵母细胞，所述酵母细胞还包含pdcl、pdc5和pdc6基因的删除。
177.根据权利要求176所述的重组酵母细胞，其中所述酵母细胞基本上不含具有NAD-依赖的甘油3-磷酸脱氢酶活性的酶。
178.根据权利要求177所述的重组酵母细胞，所述酵母细胞包含gpd2的删除。
179.根据权利要求178所述的重组酵母细胞，其中iii)的酶和iv)的酶都是由整合进染色体的异源性多核苷酸编码的。
180.根据权利要求179所述的重组酵母细胞，其中所述异丁醇生物合成途径包含编码用于每一底物至产物的转化的酶的至少一种异源性多核苷酸。
181.根据权利要求180所述的重组酵母细胞，所述酵母细胞还包含与PYZ090的每一编码区具有至少80%同一性的质粒或与PLH468的每一编码区具有至少80%同一性的质粒。
182.根据权利要求180所述的重组酵母细胞，包含SEQIDNO:I的质粒或SEQIDN0:2的质粒或它们二者。
183.发酵组合物，包含：(a)可发酵的碳底物； (b)能够使游离脂肪酸与醇酯化为脂肪酸烷基酯并且任选地能够使甘油酯水解为游离脂肪酸的催化剂； (C)醇； (d)游离脂肪酸；以及 (e)从所述游离脂肪酸与所述醇通过所述催化剂的酯化作用原位形成的脂肪酸醇酯。
184.根据权利要求183所述的组合物，所述组合物还包括油，其中所述油包括甘油酯。
185.根据权利要求184所述的组合物，其中所述油、所述游离脂肪酸和所述可发酵的碳底物来源于生物质。
186.根据权利要求185所述的组合物，其中所述油和所述可发酵的碳底物来源于相同的生物质来源或来源于不同的生物质来源。
187.根据权利要求185所述的组合物，其中所述油的生物质来源是大豆或玉米油，并且其中所述可发酵的碳底物的生物质来源是玉米。
188.根据权利要求183所述的组合物，其中所述（d)游离脂肪酸是玉米油脂肪酸。
189.根据权利要求183所述的组合物，其中所述（d)游离脂肪酸是利用催化剂从所述油中的甘油酯的至少一部分的水解形成的。
190.根据权利要求183所述的组合物，所述组合物还包含利用催化剂从所述油中的一部分甘油酯的部分水解形成的至少一种甘油二酯和甘油单酯。
191.根据权利要求183所述的组合物，所述组合物还包含甘油。
192.根据权利要求183所述的组合物，所述组合物还包含来源于所述可发酵的碳底物的生物质来源的未溶解的固体。
193.根据权利要求192所述的组合物，其中所述组合物包含小于约25重量％的未溶解的固体。
194.根据权利要求183所述的组合物，其中所述组合物还包含能够使淀粉转化为可发酵糖的糖化酶，并且其中所述醇是丁醇。
195.包含通过权利要求1、12、33、54、84和109的方法产生的丁醇的组合物。
196.根据权利要求195所述的组合物，其中所述组合物被用作燃料添加剂、原料化学品、试剂、溶剂、防腐剂或食品级提取剂。
197.通过权利要求1、12、33、54、84和109的方法产生的丁醇作为燃料添加剂、原料化学品、试剂、溶剂、防腐剂或食品级提取剂的用途。
【文档编号】C07C29/86GK103476936SQ201180039696
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2011年6月17日 优先权日:2010年6月18日
【发明者】D·R·安顿, R·迪科西莫, B·A·迪纳, M·C·格拉迪, B·M·勒施, S·F·巴扎纳, K·H·伯卢, J·齐拉科维奇, F·J·维尔纳 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司