识别人类白血病抑制因子(lif)的抗体和抗lif抗体在与有害细胞增殖相关疾病的治疗中 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及针对人类白血病抑制因子(LIF)的抗体以及产生所述抗体的杂交瘤细胞系。本发明还涉及阻止和抑制干细胞增殖的方法，以及用于诊断主体患有与有害细胞增殖有关疾病，或用于测定主体罹患所述与有害细胞增殖有关疾病的倾向性，或者预测患有所述疾病的主体的平均生命期望值。所述抗体的治疗潜能基于对于LIF的抑制作用可以用在用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的治疗性组合物中的发现。
【专利说明】识别人类白血病抑制因子(LIF)的抗体和抗LIF抗体在与有害细胞增殖相关疾病的治疗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明大体上涉及用于制可识别人类白血病抑制因子(LIF)的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(淋巴细胞杂交瘤)，这种抗体的同源群，以及这种抗体在与改变了 LIF的水平和活性相关的疾病的预后、诊断和治疗中的应用，这些疾病例如为与有害细胞增殖相关的疾病，更加具体的说是癌症，甚至更加具体的说是脑胶质瘤。
【背景技术】
[0002]白血病抑制因子(LIF)是一种具有多种生物活性并对不同细胞类型均有影响的白细胞介素6 (IL-6)-型细胞因子。人类LIF是一种具有202个氨基酸的多肽。
[0003]LIF是一种重要的信号分子；尤其是，它在与有害细胞增殖相关的疾病如各种类型的肿瘤等中发挥着作用。某些肿瘤细胞可以通过诱导LIF或Sox2提高其自我更新能力(Ikushima 等，Cell Stem Cell,5:504-514，2009;Penuelas 等，CancerCell, 15:315-327,2009)。LIF还牵涉到其他生理活动，例如，胚泡植入的抑制(Sengupta等，2006，Contraception, 74，419-425)和表皮黑色素细胞的分化(Hirobe, 2002，J.Cell.Phys.， 192:315-326)。
[0004]对于肿瘤而言，癌症起始细胞(CIC)是一种具有正常干细胞特性、呈现出持续的自我更新并能够产生复制原始肿瘤的特性和细胞多样性的继发性瘤的肿瘤细胞亚群。CIC被认为是造成肿瘤启动、增殖、复发、抗化疗和抗辐射的原因(Bao等，Nature, 444:7756-760，2006;Dick, Blood, 112:4793-4807，2008;Gupta 等，Nat.Mathods, 15:1010-10
12,2009;Visvader 和 Lindeman, Nat.Rev.Cancer, 8:755-768，2008;Zhou 等，Nat.Rev.Drug Discov.8:806-823，2009)。所有这些特征表明，CIC是关键的治疗靶点，对CIC生物学的认识是改善抗癌疗法的关键。一些细胞表面标记物，包括⑶133和⑶44，已被证实可用于不同肿瘤类型中富含CIC的细胞亚群的分离(Visvader和Lindeman, Nat.Rev.Cancer, 8:755-768，2008)。
[0005]脑胶质瘤是最常见的脑肿瘤。脑胶质瘤的最具侵袭性的形式IV级脑胶质瘤也称为I父质母细胞瘤(GBM),是最为最致命的癌症之一，其患者平均存活时间为14个月左右(Stupp等，N.Engl.J.Med.，352:987-996, 2005)。尽管在了解涉及脑胶质瘤的成因和进展的分子机制方面已取得进展，但对这种类型的肿瘤的预后及治疗仍然办法不多。脑胶质瘤起始细胞(GIC)的特点是其高致瘤潜能、其自我更新能力及其分化为多种细胞系的能力。肿瘤中的干细胞样的细胞的数目受其自我再生能力的调节。一般情况下，GIC以及癌症干细胞通过一个干细胞产生两个与其完全相同的复制品或者一个所述干细胞的复制品和一个高度分化的细胞(非对称性分裂)进行对称性和非对称性分裂。癌症干细胞的自我再生能力受对称性和非对称性分裂 之间的平衡的调节，而且所述自我更新的控制机制的失调最有可能参与肿瘤发病。
[0006]据知，GIC是造成肿瘤发病、增殖和复发的原因，这说明最有效的疗法是针对肿瘤干细胞进行分区化的治疗。如果GIC没有被消除，则肿瘤就不会完全根除。
[0007]TGF^ (β型转化生长因子)的信号通路通过调节靶基因参与调节诸如细胞增殖和分化等许多细胞活动。细胞因子的TGFβ家族包括TGFβ s本身(如TGFβ 1、TGFβ 2、TGF0 3)、活化素和骨形态发生蛋白。TGFii家族成员通过激活细胞-表面处的丝氨酸/苏氨酸激酶受体起作用，这触发了牵涉下游效应子SMAD的细胞内信号传导通路，SMAD在激活时直接转移到细胞核并激活转录。已经知道，TGFii可以通过诱导LIF或Sox2提高 GIC 的自我更新能力(Ikushima 等，CellStem Cell, 5:504-514, 2009;Penuelas等，Cancer Cell, 15:315-327，2009)。TGFP在癌症信号传导中的重要作用(Massague，Cell, 134:215-230，2008)已推动了基于设计针对TGF β的抑制性化合物的抗癌策略的临床开发(Seoane 等,Clin.Transl.0ncol., 10:14-19，2008;Yingling等，Nat.Rev.Drug Discov.，3:1011-1022，2004)。在脑胶质瘤中，提高的 TGFβ 活性赋予患者较差的预后(Bruna等，Cancer Cell, 11:147-160, 2007),并显示出一种多样化的致瘤反应，其中包括诱导血管生成、抑制免疫反应、细胞侵害及细胞增殖(Bruna等，Cancer Cell, 11:147-160，2007 ; Rich, Front.Biosc1.e245_260，2003)。TGFP 家族成员调节DNA结合蛋白I(Idl)的抑制剂的表达。DNA结合蛋白的抑制剂(Id)是调节细胞周期和细胞分化并在干细胞的自我更新的控制中起着重要作用的转录因子(Perk 等，Nat.Rev.Cancer, 5:603-614，2005;Ying 等，Cell, 115:281-292，2003)。在正常的上皮细胞中，TGF^抑制而BMP诱导Idl转录(Massague, Cell, 134:215-230, 2008)。然而，在内皮细胞和某些肿瘤细胞中，TGFP能够诱导Idl表达(Goumans等，EMBOJ.，1743-1753，2002;Padua等，Cell, 133:66-77，2008)。Idl 可以在调节这些细胞的自我更新能力方面有着重要作用的BI型成体神经干细胞中进行表达(Nam和Benezra, Cell StemCell, 5:515-526, 2009)。对于癌症而言，Idl在一些肿瘤中曾被发现上调(Perk等，CancerRes.，2006:10870-10877, 2 006)，并被描述为参与转移(Gupta 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 104:19506-19511，2007)。
[0008]脑胶质瘤的治疗选择是手术干预。然而，手术治疗通常伴随着药物的辅助治疗或放射治疗手段。治疗脑胶质瘤的药物选择包括称为PCV的组合物，其包括甲基苄肼、CCNU(洛莫司汀)和长春新碱，以及替莫唑胺联合放疗。
[0009]因此，需要有一种能有效消除GIC、防止本领域的现有技术中存在的治疗弊端的替代疗法。
[0010]在专利US 5，654，157A、US 5，6 5 4，I 5 7、K i m 等(J.1 mmuno I.Meth.,156:9-17, 1992),Alphonso 等(J.Leukocyte Biology (Abstractsof the 28thNational Meeting of the Society for Leukocyte Biology, vol.0, n0.SP.2(1991)(NY, N.E., p.49) (Mabs D4.16.9, D25.1.4 和 D62.3.2)、Sengupta 等(Contraception74:419-425, 2010)中描述了一些LIF特异性抗体。然而，这些抗体结合到其中的LIF蛋白的抗原区域尚未被详细表征。此外，这些抗体用于治疗癌症、具体地说是脑胶质瘤且更加具体的说是胶质母细胞瘤的应用尚未公开。如本领域技术人员可以从其他例子中了解的，抗体与抗原的某一特定区域或抗原表位的结合对于治疗的成功起着决定性作用。例如，各种抗-HER2抗体是已知的，其中只有一种曲妥珠单抗已被证明对于治疗乳癌特别有用。
【发明内容】
[0011]在第一个方面，本发明涉及一种针对人类白血病抑制因子(LIF)的单克隆抗体。
[0012]在另一个方面，本发明涉及一种产生针对人类白血病抑制因子(LIF)的抗体(下文中称为抗-LIF抗体)的同源群的杂交瘤细胞系。在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种保藏编号为DSM ACC3054的于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤细胞系。
[0013]在另一个方面，本发明涉及一种包括所述抗体的免疫分析试验。
[0014]在另一方面，本发明涉及一种用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的治疗有效剂量的抗-LIF抗体。
[0015]在一个更加具体的方面，本发明涉及一种用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的治疗有效剂量的本发明意义上的单克隆抗-LIF抗体。
[0016]在另一个方面，本发明涉及一种含有用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的治疗有效剂量的根据本发明所述的抗体和药学上可接受的载体。
[0017]在另一个方面，本发明涉及一种用于诊断与主体的有害细胞增殖相关的疾病，或用于确定主体罹患与有害细胞增殖相关的所述疾病的倾向性，或用于确定主体患与有害细胞增殖相关的所述疾病的阶段或严重程度，或用于监测对患有与有害细胞增殖相关的所述疾病的治疗效果的体外方法，包括来自所述主体的生物学样本中的LIF或其功能等同变异体或这些分子的任意组合的表达水平的量化。在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒的应用，该试剂盒含有为诊 断主体所患癌症，或者为确定主体罹患所述癌症的倾向性，或者为确定主体患有所述癌症的阶段和严重程度，或者为预期罹患所述癌症的主体的存活率或平均预期生命期望值，或者为监测对患有所述癌症的主体的治疗效果而用于对LIF或其功能等同变异体或者这些分子的任意组合的表达水平进行量化的试剂，其中，如果试剂检测出相对于对照样本而言LIF或其功能等同变异体或者这些分子的任意组合的表达水平增加，则所述主体罹患所述与有害细胞增殖相关的疾病，或呈现很大的罹患所述与有害细胞增殖相关的疾病的倾向性，或罹患所述疾病较为严重，或所接受的治疗无效。
[0018]在另一个方面，本发明涉及一种对罹患与有害细胞增殖相关疾病的患者的平均生命期望值进行预测的体外方法，其包括对来自所述主体的生物样本的LIF或其功能等同变异体或这些分子的任意组合的水平进行量化。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1:抗LIF抗体(α-LIF)与氨基酸第160-202位中所包含的人类LIF蛋白的C
端域结合。
[0020](A)显示LIF基因二级结构和LIF-EGFP融合蛋白中所进行的顺次删除的示意图。(B)用指定构造体转染293Τ细胞。48小时后，细胞发生裂解，并用Iyg的抗LIF抗体在4°C进行一夜的免疫沉淀反应。然后，蛋白A/G添加到裂解物中，并对免疫沉淀物进行洗脱。采用抗-EGFP抗体通过免疫印迹检测LIF片段。(C)显示抗LIF抗体结合域的示意图。
[0021]图2:抗LIF抗体阻止脑胶质瘤细胞系U373中的磷酸化信号转导和转录激活因子3 (Phospho-StatS)的诱导和源自患者GBM神经球内的磷酸化信号转导和转录激活因子3的某础水平。[0022]A)在有或没有指定单克隆抗体存在的条件下，采用或者不采用人类重组LIF对U373细胞处理15min，并通过蛋白质印迹测定磷酸化信号转导和转录激活因子3和微管蛋白水平。同型-匹配的IgG用作对照。B)将GBM神经球分离，剩余部分既可以不进行处理，也可以在抗LIF单克隆抗体或同型-匹配的对照IgG存在条件下进行整夜孵育，并通过蛋白质印迹测定磷酸化信号转导和转录激活因子3和微管蛋白的水平。
[0023]图3:源自患者的GBM神经球包含CD44A/IdlA细朐区室。
[0024]对GBM神经球中的⑶44水平进行FACS分析(图3A)。用同型对照染色显示。根据⑶44水平通过FACS对GBM神经球进行分选，并通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析测定CD44, IDl, ID2和ID3的转录水平(图3B和3C)。
[0025]图4:GBM神经球中的CD44A/IdlA群富含脑胶质瘤-起始细朐。
[0026](A)在有或没有10%FBS存在的条件下对GBMl神经球培养10天，并对其中的⑶44水平进行FACS分析。(B)根据CD44水平对GBMl细胞进行分选，并开始进行神经球_形成试验。7天后，测定神经球的数目。(C、D和E)根据CD44水平对神经球细胞进行分选，并将指定数目的细胞接种到免疫低下小鼠的大脑中。(C)外科手术后四十天，通过磁共振成像(MRI)(箭头指向肿瘤)获得接种IO5个细胞的小鼠整个大脑的图像。(D)显示出肿瘤发病率。(E)对肿瘤进行指定蛋白免疫组织化学和H&E染色。
[0027]图5:杭LIF杭体降低了 GBM神经球内的⑶441/1(111细朐群的水平。
[0028]将GBM神经球分离，并将其在抗LIF单克隆抗体或同型对照的IgG存在条件下，在有EGF和FGF存在(A)或没有EGF和FGF (B)存在的条件下培养7天。在碘化丙锭存在的条件下，用抗-⑶44-FITC单克隆抗体对细胞进行染色，以排除死细胞，并通过FACS测定⑶44S细胞的比例。
[0029]图6:杭LIF杭体降低源于患者的GBM神经球内⑶44和Idl的水平。
[0030]将GBM神经球分离，将其在没有EGF和FGF存在但有抗LIF单克隆抗体或同型对照的IgG存在的条件下培养7天，并通过qRT-PCR对指定基因的mRNA水平进行分析。将GAPDH (磷酸甘油醛脱氢酶)用作内标归一法对照。
[0031 ] 图7:在体内用抗LIF抗体治疗减少⑶44A/IdlA细胞区室。㈧显示了实验步骤的示意图。(B)将GBM神经球接种到免疫低下小鼠的大脑中。接种后30天生成肿瘤，并且在肿瘤形成后，用PBS或500ug的抗LIF单克隆抗体对小鼠进行10天的治疗，每隔3天一次。将小鼠的脑细胞分解，并通过分选MHC-1阳性细胞分离人类肿瘤细胞。通过qRT-PCR测定IDI和⑶44mRNA表达水平。将GAPDH用作内标归一法对照。
[0032]图8:脑胶质瘤患者的LIF mRNA水平与平均生命期望值相关。卡普兰美尔(Kaplan-Meier)曲线显示，通过对数秩检验，LIF mRNA水平上调≥2倍的脑胶质瘤患者整体存活率明显低于其余患者(P=7.2E-8)。数据来自用于国立癌症研究所的分子脑肿瘤数据(伦勃朗)程序的库。
[0033]图9:脑胶质瘤(GBM)患者的LIF mRNA水平与平均期望寿命相关。卡普兰美尔(Kaplan-Meier)曲线显示，通过对数秩检验，LIF mRNA水平上调≥9倍的脑胶质瘤患者整体存活率明显低于其余患者(P=6.9E-4)。数据来自用于国立癌症研究所的分子脑肿瘤数据(伦勃朗)程序的库。【具体实施方式】
[0034]根据本发明的抗体
[0035]本发明的作者已经制备出针对人类白血病抑制因子(LIF)的新型单克隆抗体。
[0036]因此，在第一个方面，本发明涉及一种针对人类白血病抑制因子(LIF)的单克隆的抗体。本发明中所用术语“单克隆抗体”是指抗体的基本上同源的群，其中构成群的单个抗体分子具有基本上相同的亲和力和特异性，除去存在极少量的任何可能发生的自然突变外。
[0037]单克隆抗体是一种抗原的单表位的特异性抗体的同源群。在本发明中，术语“单克隆抗体”必须被广义地解释，它包括多特异性抗体及其片段(F(ab’)2，Fab)等，只要它们能够特异性识别LIF。就本发明而言，作为非限制性的例子，单克隆抗体的片断可以结合到重组抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体等中。
[0038]嵌合抗体是通过克隆或重组来自不同动物物种的抗体而构建的单克隆抗体。在本发明的一个典型的但非限制性的构造中，嵌合抗体包括部分单克隆抗体，通常是包括抗原识别及结合位点的可变区片段(FV)，以及对应于人源抗体的其他部分，通常是包括恒定区和邻近恒定区的部分。
[0039]人源化抗体是单克隆抗体，通过在人源抗体中克隆和移植本发明意义上的小鼠单克隆抗体的高变互补决定区(CDR)以替换所述人源抗体的高变CDR区的方式来构建。
[0040]本发明所用“人类抗体”可以表示完全人类单克隆抗体。这种人类抗体是一种可以通过遗传工程小鼠(所谓的转基因小鼠)产生的抗体，其已经被改造来制备人类抗体。例如，Lonberg和Huszar曾介绍了一种用于从小鼠获得人类抗体的技术(Int.Rev.Tmmunol., 1995; 13 (I): 65-93)，其基于首先由 McCafferty 等(1990, Nature348 (6301): 552 - 554)描述的技术。
[0041]此外，在本发明的上下文中，术语“抗体”还包括具有修饰后的糖基化模式的变异体，以及糖基化或非糖基化的抗体片段，其从蛋白质中得到或通过基因重组技术获得，包括(i)通过结合肽互相结合的抗体的可变区(scFv)，(ii)连同通过半胱氨酸或通过结合肽和二硫键结合到轻链上的重链(Fd)的CHl恒定区的可变区(scFab), (iii)新变异体,如单重链，或(iv)为使其更类似、具有更小的免疫原性(人源化)或在生物体液中更稳定而对抗体片段所做的任何修饰，在本发明中具有阻止LIF执行其功能(活性)，即诱导激活JAK-STAT信号通路的能力。
[0042]如本领域技术人员所了解的，本发明意义上的抗体的变异体可以通过常规遗传工程或重组技术、抗体生产技术、从生物体液或组织中提取和纯化的技术，或通过本领域技术人员熟知的获取蛋白质和抗体的任何其他的常规技术来获得。上述技术的示例性但非限制性的例子是:通过基因工程技术对它们进行重新设计，并使其表达在为制备不同尺寸、组成及结构的重组抗体而设计的载体中。例如可在下述文献中找到制备和纯化抗体的主要方法的综述:
[0043] “Handbook of Therapeutic Antibodies”，by S.Diib e 1.Editor:Wiley-VCH, 2007, Vol:1 to III(ISBN 978-3527314539);
[0044] “Antibodies:Volume 1:Production and Purification^byG.SubramanianEd.,Editor:Springer, 1st Edj2004(ISBN978-0306482458);[0045] “Antibodies:Volume 2:Novel Technologies andTherapeutic Use”，byG.Subramanian Ed., Editor: Springer, firstedition, 2004(ISBN 978-0306483158);
[0046]_“Molecular Cloning:a Laboratory manual，，，by J.Sambrook and D.ff.RusselEds.,Publisher:Cold Spring HarborLaboratory Press, third edition, 2001 (ISBN978-0879695774).[0047]在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种抗体，其能够识别全长人类LIF，但不识别对应于氨基酸第广72位的LIF片段，更为优选的，不识别对应于氨基酸第1~127位的LIF片段，甚至更为优选的，不识别对应于氨基酸第f 160位的LIF片段。
[0048]就本发明而言，所述包含人类LIF的氨基酸第160-202位的区域是所述单克隆抗体识别LIF及其片段所必需的(图1)。因而，在一个具体的实施方式中，本发明涉及一种抗体，其能够识别由人类LIF的氨基酸第160-202位构成的区域内的抗原表位。
[0049]在一个甚至更为具体的实施方式中，所述抗体能够识别以下区域内所包含的抗原表位，所述区域选自:人类LIF的氨基酸第160-180位所对应的区域，氨基酸第170-190位所对应的区域，氨基酸第180-200位所对应的区域，氨基酸第182~202位所对应的区域。
[0050]本发明的作者已经制备出可产生能够识别人类LIF的抗体的杂交瘤细胞系。所述抗体属于IgG I同型。该抗体能够识别没有包含在氨基酸残基第f 160位内的LIF片段。因而,在另一个实施方式中,本发明涉及一种可产生所述抗体的杂交瘤细胞系。一种产生这种抗体的的杂交瘤细胞系由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心，保藏编号为DSM ACC3054。因此，所述保藏编号为DSM ACC3054的杂交瘤细胞系包括在本发明内。该杂交瘤细胞系在欧洲专利申请10 380 049.6中也有介绍。
[0051]如本领域技术人员所了解的，结合到所述抗原的重叠或部分重叠的抗原表位的抗体因与抗原结合而彼此竞争。本领域的技术人员也应该了解，两种实质上相同的抗体分子，例如由同样的杂交瘤细胞系产生的两个单克隆抗体分子，将会相互间竞争性地抑制与抗原的抗原表位的结合。因此，作为示例，由本发明中的杂交瘤细胞系DSMACC3054产生的一个抗体分子将会竞争性地抑制由同样的杂交瘤细胞系产生的另一个单克隆抗体分子与人类LIF的结合。其也竞争性地抑制任何非DSM ACC3054的其他来源的其他抗体分子的结合，只要其他抗体分子通常都能结合到同样的或重叠的抗原表位。本发明人已经表征了含有抗原表位的LIF区域。因此，在与人类LIF结合时受到上述抗体竞争性抑制的任何抗体也属于根据本发明的抗体。具体来说，在与人类LIF结合时受到保藏编号为DSM ACC3054由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤细胞系产生的抗体所竞争性抑制的任何抗体也被认为是根据本发明的抗体。
[0052]在另一个实施方式中，本发明涉及所述抗体在免疫分析法，例如蛋白质印迹、免疫组织化学或酶联免疫吸附试验中的应用。
[0053]本发明的治疗方法
[0054]基于抗LIF抗体、优选是根据本发明的抗LIF抗体对罹患与有害细胞增值相关疾病的人类患者的效用，本发明分析了分子机制。
[0055]在本发明的上下文中，“与有害细胞增殖相关的疾病”包括癌症和肿瘤的增长、进展及转移。可以按本发明中描述的方法进行治疗的与有害细胞增殖有关的疾病的例子可以包括癌症、再狭窄、动脉粥样硬化、血管生成疾病、纤维症、牛皮癣等皮肤病和炎症性疾病。[0056]在本发明的一个具体实施例中，与有害细胞增殖相关的疾病是癌症。该实施例是优选的。
[0057]术语“癌症”和“肿瘤”是指哺乳动物的生理状况，其特征是细胞生长失常。癌症是一类其中的一组细胞呈现失控增长或有害增长的疾病。所述失控增长可以致使这些细胞能够侵害、侵入甚至破坏邻近组织。癌症细胞还可以扩散到其他位置，这会导致形成的转移。癌细胞在体内的扩散例如可以通过淋巴或血液发生。失控增长、侵入和转移的形成也被称为癌症的恶性属性。恶性属性使癌症区别于良性肿瘤，后者通常不发生侵害或移转。本发明的化合物可以是但不限于用于治疗选自以下集合中的癌症:乳房、心脏、肺、小肠、结肠、脾、肾、膀胱、头、颈、卵巢、前列腺、脑、胰腺、皮肤、骨、骨髓、血液、胸腺、子宫、睾丸和肝脏肿瘤。具体地说，可以采用本发明所述化合物治疗的肿瘤包括腺瘤、腺癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮细胞瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。特别是，肿瘤/癌症选自下述集合:肢端黑色素瘤、光化性角化病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、支气管腺体癌、毛细管类癌、恶性上皮肿瘤、癌肉瘤、胆管癌、软骨肉瘤、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样癌、室管膜瘤、尤文氏肉瘤、局灶性结节增生、胃泌素瘤(gastronoma)、生殖系肿瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮细胞瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝细胞腺瘤、肝细胞癌、insulinite、上皮内瘤变、上皮内鳞状细胞瘤、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、脂肪肉瘤、淋巴细胞白血病、淋巴细胞性白血病、平滑肌肉瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、间皮瘤、粘液表皮样癌、髓细胞性白血病、神经母细胞瘤、神经上皮癌、结节性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状浆液性腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌瘤、鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑色素瘤、疣状癌、阴道/外阴癌、VTPpoma、肾母细胞瘤。更优选地，可用 本发明的化合物治疗的肿瘤/癌症包括脑肿瘤、头颈部肿瘤、大肠癌、急性髓细胞白血病、前B细胞急性淋巴细胞白血病、膀胱癌、星形细胞瘤(优选I1、II1、IV级星形细胞瘤)、胶质母细胞瘤(优选多形性胶质母细胞瘤)、小细胞癌、非小细胞肺癌(优选非小细胞肺癌)、转移性黑色素瘤、雄激素非依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖转移性前列腺癌，以及乳癌(优选乳腺导管癌或乳腺癌)。
[0058]在一个具体的实施方式中，所述癌症是以下之一:脑胶质瘤、前B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、大肠癌、肺腺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。甚至更为优选的，所述脑胶质瘤是IV级脑胶质瘤。
[0059]TGF^可以通过LIF的Smad-依赖性诱导来促进癌症干细胞的自我更新能力。反过来讲，LIF参与激活JAK-STAT途径，由此诱导细胞增殖的过程以及肿瘤干细胞(癌症干细胞)的增加(Penuelas等，CancerCell, 15:315-327，2009)。STAT (信号传导及转录激活因子)家族成员如Stat 3的激活通常通过其磷酸化发生。
[0060]如本说明书的开篇所述，在治疗与有害细胞增殖相关的疾病如癌症、尤其是在治疗与高水平的LIF或其功能等同变异体相关的癌症方面，本发明人已开启了一个新的治疗窗口，这正是本发明此处所描述的。不希望被任何理论约束，可以认为LIF及其抑制剂对肿瘤增殖的作用在于LIF促进肿瘤干细胞增殖的能力。作者发现，采用抗LIF抗体、优选采用根据本发明中的抗LIF抗体进行治疗，可以减少细胞培养物中STAT3的LIF-依赖性磷酸化(图2)。抗LIF抑制性抗体能够抑制肿瘤干细胞的增殖，这样它们的用途具体地说就是用于治疗可以受益于干细胞增殖的抑制作用的疾病。如上文所述，本发明的抗体具有识别没有包含在由人类LIF的氨基酸残基第f 160位构成的区域内的LIF片段的特征，这又意味着这些抗体可以结合到LIF的C-端区域。本发明人发现，出人意料地是，具有这种特征的抗体对于治疗上述疾病、包括癌症(图2、图6)特别有用。
[0061]因此，在另一个方面，本发明涉及一种抑制性抗体，其可用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病，如癌症，尤其可用于治疗与高活性LIF相关的癌症。
[0062]在本发明的上下文中，术语“抑制性抗体”理解为一种能够结合到LIF、由此防止LIF执行其功能的抗体。其与“中和抗体”同义。丨
[0063]对于乳癌，TGF^与特征为高水平细胞表面标记物⑶44 (⑶44胃群)的细胞群之间的关系已有介绍。TGFi^已被表明可以通过诱导上皮-间叶样表型转化(EMT)来增加富含 CIC 的 CD44 高细胞群(Gupta 等,Cell, 138, 645-659, 2009;Mani等，Cell, 133:504-715,2008)。然而，对于脑胶质瘤，0)44胃区室尚未被广泛研究。本发明将Idl和CD44确定为脑胶质瘤、更具体地说是胶质母细胞瘤中癌症干细胞的新型标记物(图3)。具体来说，作者发现，⑶44SA:D44S细胞群富集在脑胶质瘤起始细胞中(GIC，图4)。
[0064]在一个示例性但非限制性的例子中，抗LIF抗体、优选根据本发明的抗LIF抗体靶向于以表达CD44和Idl为特征并富含脑胶质瘤起始细胞(GIC)的细胞群。具体来说，抗LIF抗体、优选根据本发明的抗LIF抗体通过抑制Idl和Id3而靶向于⑶44*/Idl sGICs (图5)。而且，这些抗体能够耗竭⑶44s/IdlsGIC群。因此，本发明的作者已经发现，抗LIF抗体、优选根据本发明的抗LIF抗体具有通过转化生长因子β (TGFii)家族成员来调节途径抑制剂的功能。因此，在本发明的一个具体实施例中，本发明涉及本发明中的抗体或其片段或药物组合物，其中所述抗体或其片段或药物组合物可以减少以高水平CD44和Idl为特征的细胞群。其中一个示例性的例子如图5所示。GBM神经球是以高水平CD44和Idl为特征的细胞群的优选例子。例如，在源自胶质母细胞瘤患者的细胞系中，抗LIF抗体、优选是根据本发明的抗LIF抗体可以降低⑶44和Idl的表达水平(图6)。
[0065]此外，作者发现，用抗LIF抗体、优选根据本发明的抗LIF抗体进行体内治疗可以减少⑶44s/Idl胃细胞区室(图7)。因此，施用抗LIF抗体、优选根据本发明的抗LIF抗体可以防止肿瘤启动，并被认为可以预防肿瘤复发。
[0066]在本发明的一个具体实施例中，癌症或癌症中出现的形成肿瘤的细胞的特点是呈现出高水平的LIF。在本发明的上下文中，LIF的“高水平”可以理解为其LIF的浓度比对照样本中出现的LIF的浓度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少有55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少100%，至少110%、至少120%、至少130%、至少140%、至少150%，或者更高。
[0067]对照样本被理解为 这样的样本，其具有一定水平的LIF，用作确定测试样本中所述LIF的相对水平的对照值。对照样本通常是取自从临床角度看具有完整的病历档案且没有疾病的患者。在所述样本中，生物标记物的浓度例如可以通过测定对照种群的平均浓度来确定。在确定某标记物的对照浓度的过程中，必须考虑到一些样本的类型特征，如患者的年龄、性别、身体状态等。例如，对照样本可以从一组包含至少2个、至少10个、至少100至1000个以上的相同数量的个体的组中获取，以使其具有统计学意义。
[0068]可以在细胞内、在组织间隙内或在提取物内确定LIF的浓度，其中细胞内蛋白质和提取物出现在组织间隙内。LIF水平可以使用免疫学方法通过测量蛋白量的方式来确定。
[0069]在本发明的一个更加具体的实施方式中，用于确定LIF水平的免疫学方法包括一种抗LIF抗体，并且在一个甚至更加具体的实施方式中，其包括根据本发明所述的抗体。
[0070]在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其含有用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的根据本发明所述的治疗有效剂量的抑制剂以及治疗有效剂量的载体。与有害细胞增殖相关的疾病的例子在本说明书前文中已述及。
[0071]在本发明的上下文中，“治疗有效剂量”理解为达到预期效果所必须的抑制LIF的表达和/或活性的剂量，所述预期效果在此特定情况下是对与有害细胞增殖相关疾病的治疗。一般来说，待施用的根据本发明的治疗有效剂量的抑制剂除其他因素外将取决于待治疗的个体、所述个体所患疾病的严重程度、所选择的剂型等。出于这个原因，在本发明中提到的剂量必须只考虑作为本领域技术人员的方针，本领域的技术人员必须根据前面提到的变量来调整剂量。然而，根据本发明的抑制剂可以一天一次或多次地给药，例如一天1、2、3或4次。
[0072]在本说明书的上下文中，术语“治疗”意指施用根据本发明的抗体以防止、减轻或消除疾病或与所述与有害细胞增殖相关的所述疾病有关的一个或多个症状。“治疗”还包括预防、减轻或消除疾病的生理后遗症。在本发明上下文中，术语“减轻”理解为所治疗的患者的状况在主观上(患者的感觉)和客观上(测量参数)的任何改善。
[0073]术语“载体、佐剂`和/或运载体”涉及被施用的活性成分的分子实体或物质。这种药物载体、佐剂或运载体可以是无菌液体，如水和油脂，包括石油的或动物、植物或合成来源的油脂，如花生油、大豆油、矿物油、(芝)麻油等等，赋形剂，崩解剂，润湿剂或稀释剂。适用的药物运载体见 E.ff.Martin 的"Remington，s Pharmaceutical Sciences"。
[0074]在本发明的上下文中，术语“药学上可接受的”是指给药于人体时生理上可以容忍的、一般不会引起变态反应或类似的不良反应如反胃、头晕等的分子实体和成分。术语“药学上可接受的”优选指由联邦或州政府监管机构批准的，或包括在美国药典或其他普遍公认的应用于动物体、特别是人体的药典中。
[0075]抗体以及含有所述抗体的药物组合物可与其他用于治疗与有害细胞增殖相关的疾病的附加药物一起使用。所述附加药物可以形成相同药物组合物的一部分，或者它们也可以以一种单独的组合物的形式与包含所述抗体的药物组合物同步地或不同步地给药。
[0076]其他用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的附加药物的例子包括但不限于:烷化剂类药物，例如环磷酰胺、卡莫司汀、柔红霉素、二氯甲基二乙胺、苯丁酸氮芥、嘧啶亚硝脲、马法兰等；蒽环类药物，例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、去甲氧柔红霉素、米托蒽醌、戊柔比星等；紫杉烷类化合物，例如紫杉醇、多西紫杉醇等；局部异构酶类抑制剂，例如依托泊苷、替尼泊苷、郁金香甙、伊立替康等；核苷酸类似物，例如阿扎胞苷、咪唑硫嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、硫鸟嘌呤、呋氟尿嘧啶等；钼基药剂，例如卡钼、顺钼、奥沙利钼等；抗肿瘤药物，例如长春新碱、亚叶酸、洛莫司汀、甲基苄肼等；激素调控剂，例如他莫昔芬、非那雄胺、5-a -还原酶抑制剂等；长春花生物碱，例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨等。合适的化疗药物在诸如默克索引(第13光盘版)中有更详细的介绍。
[0077]本发明所述的药物组合物可以采用适用于含抗体配方的任何给药途径，例如皮下、腹腔、静脉注射、肌肉注射等给药，
[0078]给药的药物剂型的示例可以是合适的剂型，例如灭菌溶液、悬浮液或冻干产品；在这种情况下，所述药物组合物还包括合适的赋形剂，比如缓冲剂、试剂等。在任何情况下，赋形剂将根据所选择的药物剂型来进行选择。
[0079]本领域技术人员都了解，在蛋白质功能非决定性位置处引起氨基酸保守性替换的编码LIF的基因的核苷酸序列中的突变是不影响其整体的总体结构或功能的进化性中性突变。所述变异属于本发明的范围内。
[0080]本说明书中所用的术语“功能等同”或“其功能等同变异体”表示一种分子，其与其来源分子(亦即其为衍生物)具有功能关系。更通常情况下，它兼具其来源分子的功能性和结构关系。功能性和结构性关系可以理解如下:
[0081]A.功能性关系:本发明中所用的与LIF有功能关系的分子其效力与LIF的效力相比在50-200%的范围内，更为优选的是与LIF的效力相比在8(Tl20%的范围内，最为优选的是在95~105%的范围内，例如对LIF活性进行体外试验时是LIF的效力的基本上100%。用于LIF活性的各种体外试验法是本领域技术人员熟知的。例如，在添加LIF或其功能等同变异体时，可以检测出黑色素细胞的分化，见Hirobe, 2002, J.Cell.Phys.，192:315-326。更加具体的是，在添加LIF时可以检测出黑色素细胞的百分比，如文献Hirobe, 2002, J.Cell.Phys.，192:315-326 中图 2A 所示。
[0082]B.结构性关系:(I)所述分子可以在标准三羟甲基氨基甲烷/甘氨酸(Tris/Glycine) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移，这是本领域技术人员熟知的，其本质上与LIF相同，和/或，它是一种具有不同糖基化模式的分子，和/或它是一种其氨基酸序列源自人类LIF的分子，即其中人类LIF的一个或多个氨基酸(即f 5、f 10或f 20)被修饰、取代、添加或去除。这种LIF功能等同变异体对LIF进行了一个或多个氨基酸的所述插入、去除或修饰，并保留了与LIF相同的功能，因此也包括在本发明的范围内。在一个优选实施例中，“功能等同”或“其功能等同变异体”是指一种本质上能够执行与LIF相同功能的分子。因此，本发明中所用术语“功能等同”或“其功能等同变异体”还包括LIF的任何功能等同的片段。这里，针对LIF的功能等同变异体的相同描述也适用于其他蛋白质的功能等同变异体，如 CD44, Idl 和 Id3。
[0083]“片段”一词涉及到包含蛋白质的一部分的肽。在这种情况下，LIF的功能等同变异体是含有LIF的一部分且与LIF具有相同功能的一种肽或蛋白质。所述本质上具有相同功能的效应子如LIF可以依照上述” A.功能性关系”所述地测定。
[0084]“抗体片段”是一种含有抗体的一部分的肽或多元肽(如通常为2个、3个四肽)。这些肽可选地包含分子间或分子内二硫键。因此，一个抗体片段可以包含一个或两个轻链或其片段，和/或一个或两个重链或其片段，它们可选地通过二硫键链接。一个重链和轻链或其片段或两个重链和两个轻链或其片段的结合是最典型的。所述抗体的相关片段，或者更加具体的说是轻链和重链的片段，优选的是含有抗体/链的可变域(VH)的片段，更加具体的说是含有抗体/链的抗原结合区。
[0085]抗LIF抗体，优选根据本发明的抗LIF抗体，其可能也有益于对于呈现出已知肿瘤干细胞抗化疗能力的抗化疗肿瘤进行的治疗。此外，作者发现，使用抗LIF抗体，优选根据本发明的抗LIF抗体，也适用于防止与有害细胞增殖相关疾病的复发(图7)。
[0086]本发明的诊断方法
[0087]本发明的发明人已经发现，LIF通过参与激活JAK-STAT信号级联来诱导细胞的增殖过程和增加肿瘤干细胞(癌症干细胞)。更加具体的说，作者提供了 CD44和Idl是脑胶质瘤的新型标记物的证据。此外，作者发现，Idl优选在富含以高表达水平的CD44为特征的GIC的细胞群中得以表达，并且IDl和ID3是抗体-介导的LIF抑制的标记中所含的基因。因此，LIF、⑶44、Idl、Id3或其任何组合都可以在用于诊断与有害细胞增殖相关疾病的诊断方法中应用。所述诊断方法建立在测定LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的水平的基础上。优选地，所述诊断方法建立在测定LIF或其功能等同变异体的水平的基础上。
[0088]因此，在另一个方面，本发明涉及一种用于诊断与主体的有害细胞增殖相关的疾病，或用于确定主体罹患与有害细胞增殖相关的所述疾病的倾向性，或用于确定主体患有与有害细胞增殖相关的所述疾病的阶段或严重程度，或用于监测对患有与有害细胞增殖相关的所述疾病的主体的治疗效果的体外方法，其包括对来自所述主体的生物学样本中的LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的表达水平的量化，其中相对于对照样本中的编码LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的基因的表达水平来说，编码LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的基因的表达的增加，体现了与有害细胞增殖相关的疾病，或所述主体罹患与有害细胞增殖相关疾病的较大倾向性，或所述主体对所施与的治疗无反应。在一个优选实施例中，所述体外方法包括相对于对照样本中的编码LIF或其功能等同变异体的基因的表达水平来对编码LIF或其功能等同变异体的基因的表达水平进行量化。
[0089]因此，本发明所用术语“功能等同变异体”还包括所述标记蛋白的任何功能等同的片段。“片段”一词是指含有所述标记蛋白的一部分的肽。在这种情况下，功能等同的片段是一种含有一部分所述标记蛋白并实质上具有与所述蛋白相同功能的肽或蛋白。“标记蛋白”优选涉及LIF、⑶44、Idl和Id3，没有任何限制。
[0090]在本发明中所用的术语“诊断”是指据此评价主体罹患疾病的可能性。正如本领域技术人员所了解的，对于被诊断主体而言，这样的评价通常可能不会是100%正确，尽管它最好是。然而，该术语要求能够识别主体罹患该疾病或具有罹患该疾病倾向性的统计学意义部分。本 领域技术人员可以简单地使用一个或几个公知的统计评价工具来确定某一部分是否具有统计学意义，例如确定置信区间、确定P值、学生t-检验、Mann-Whitney检验，等等。这些可详见 Dowdy&Wearden, Statistics forResearch, John ffiley&Sons, New York1983。优选的置信区间为至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%。P值优选为 0.2、0.1、0.05。
[0091]本发明所用术语“倾向性”是指主体至今尚未患疾病或没有如上述或其他诊断标准所述的任何疾病症状、然而却具有在未来患该病的某种可能性。所述可能性和与有害细胞增殖相关的疾病的发病统计概率显著不同。优选诊断为，患与有害细胞增殖相关的疾病的概率为至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%的倾向性。倾向性的诊断有时可称为预后或预测主体患病的可能性。
[0092]在本发明的上下文中，“对照样本”理解为用来确定本发明所使用的基因和蛋白质的表达水平的变化的参照样本。在一个实施方式中，对照值采用从一个健康个体中获得的组织样本从所提供的信号中获得。优选地，样本取自几个健康个体的同一组织并结合起来，以使样本中多肽的量反映了该群中所述分子的平均值。
[0093]因此，在本发明的一个【具体实施方式】中，可以对LIF或⑶44或Idl或Id3的表达水平进行量化。
[0094]正如本领域技术人员所了解的，可以通过任何常规方法来量化蛋白质的表达水平。作为非限制性实例，可以下述方式来量化蛋白质的水平，例如通过利用具有结合到所述蛋白质(或其含有抗原决定簇的片段)上的能力的抗体，以及之后量化所形成的复合物。用于这些试验的抗体可以标记或不被标记。可以使用的标记物的示例包括:放射性同位素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶底物或辅助因子、酶抑制剂、颗粒、染料等。有多种已知的试验法可用于本发明中，其采用无标记的抗体(一抗)和有标记的抗体(二抗);这些技术包括蛋白质印迹、ELISA (酶联免疫吸附试验)、RIA (放射性免疫测定)、竞争性EIA (竞争性酶联免疫测定)、DAS-ELISA (ELISA双抗体夹心法)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、基于使用包括特异性抗体的蛋白质的生物芯片或微阵列的技术，或者基于特定形式的胶体沉淀检测，如试纸技术。在另一个【具体实施方式】中，蛋白质水平的量化是通过免疫分析法如蛋白质印迹、免疫组织化学或ELISA的方式实现的。在一个甚至更为具体的实施方式中，所述免疫分析法包括采用本发明意义上的保藏编号为DSM ACC3054的杂交瘤细胞系产生的抗体。
[0095]同样，本发明所述的诊断方法可应用于任何上述定义的与有害细胞增殖相关的疾病。在一个优选实施方式中，与有害细胞增殖相关的疾病是癌症，优选的是具有高水平LIF或高水平的Idl、Id3和⑶44中的任意一项的癌症。
[0096]将本发明的方法付诸实践包括从待研究的主体中获取生物样本。所述样本的非限制性示例包括:不同类型的生物体液,如血液、血清、血浆、脑脊液、腹腔液、粪便、尿液和唾液，以及组织样本。如同组织样本一样，生物体液样本可以通过任何常规方法获取；举例来说，所述组织样本可以是通过外科切除手术获得的活检样本。
[0097]在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其含有用于为诊断主体患有的癌症、或者为测定主体罹患所述癌症的倾向性、或者为测定主体患有所述癌症的阶段和严重程度、或者为监测对患有所述癌症的主体的治疗效果而对LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的表达水平进行量化的试剂，其中，如果所述试剂检测出相对于对照样本而言所述基因或所述蛋白或其功能等同变异体的表达增加，则所述主体就会罹患所述与不良细胞增殖相关的疾病，或者表现出较大的罹患所述与不良细胞增殖相关疾病的倾向性，或者患有所述疾病较为严重，或者所施用的治疗无效。在本发明的一个优选的实施方式中，所述试剂盒的特征是含有用于对LIF或其功能等同变异体的表达水平进行量化的试剂。
[0098]本发明还涉及所述试剂盒的应用。
[0099]针对本发明的其他创新性方面及【具体实施方式】已经描述和说明了用于定义试剂盒应用中所使用的所有术语和表述，它们也适用于这里所介绍的试剂盒的应用。
[0100]用于设计定制治疗和筛选可受益.于基于抗LIF抗体的治疗的患者的方法
[0101]在另一个方面，本发明涉及一种用于为患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者设计定制治疗的体外方法，包括:
[0102](a)对所述患者体内的LIF的表达水平进行量化，以及
[0103](b)将所述表达水平与对照水平进行比较，其中如果所述患者体内的LIF的表达水平大于对照值，则对所述患者施用针对LIF的抗体。
[0104]在另一个方面，本发明涉及一种用于选择罹患与有害细胞增殖相关疾病的患者以采用针对LIF的抗体进行治疗的体外方法，包括:
[0105](a)对所述患者体内的LIF的表达水平进行量化，以及
[0106](b)将所述表达水平与对照水平进行比较，
[0107]其中，如果所述患者体内LIF的表达水平大于对照值，则选择所述患者接受针对LIF的所述抗体的治 疗。
[0108]在这两个方面，一个优选实施方式是，与有害细胞增殖相关的疾病涉及有害的干细胞增殖。
[0109]呈现出有害细胞增殖的疾病前已述及。在一个优选实施方式中，所述呈现出有害细胞增殖的疾病是癌症。甚至更为优选的是，所述癌症是由JAK-STAT信号通路的高活性造成的。
[0110]在一个具体的实施方式中，所述癌症是以下之一:脑胶质瘤、前B细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、大肠癌、肺腺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。甚至更为优选的，所述脑胶质瘤是IV级脑胶质瘤。
[0111]本发明的预后方法
[0112]在另一个方面，本发明涉及一种用于对患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者的平均生命期望值进行预测的体外预后方法。该方法是基于这样的观察，即例如对于脑胶质瘤来说，相对于对照组患者呈现出较高LIF表达水平的患者的平均生命期望值减少。作者提供了⑶44和Idl是GIC的标记物的证据。这些标记物给与的GBM患者的预后较差。上文确定的分别存在于患有与有害细胞增值相关的疾病的主体中的较高水平的LIF和较高水平的Idl和CD44之间的关系提供了可信的预后方法的新的标记物。
[0113]所述方法是基于
[0114]a)对所述患者体内的LIF或⑶44或Idl或Id3的表达水平进行量化，以及
[0115]b)将所述表达水平与对照水平进行比较，其中如果所述患者体内LIF或⑶44或Idl或Id3的表达水平大于患有同样疾病的对照组患者的值，则所述患者的生命期望值很可能比对照组短。
[0116]在一个更为具体的方面，这些标记物的LIF或⑶44或Idl或Id3或其功能等同变异体中的任意一项的浓度可以被测量用于预后的目的，即预测罹患所述疾病的个体的平均生命期望值。优选地，测量所述LIF或其功能等同变异体的浓度。为此，将肿瘤患者的LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的浓度与相应的同一标记物的参考浓度相比较。本发明所采用的LIF、⑶44、Idl和Id3或者LIF、⑶44、Idl和Id3的功能等同变异体是“标记物”。优选将源自肿瘤患者的LIF或其功能等同变异体的浓度与LIF或其功能等同变异体的参考浓度进行比较，亦即，标记物是LIF或其功能等同变异体。参照样本取自参照患者组。参照组患者一般由备有完好病历并患有同一种疾病的患者组成。例如，参照组样本可以从一组包含至少2个、至少10个、至少100至1000个以上的相同数量的个体的组中获取，以使患有所述疾病的患者群体具有统计学意义。参照组可以由一个或多个下述个体组成:
[0117]a)患有所述疾病的所有患者；
[0118]b)患有所述疾病但未呈现出明显上调水平的LIF的所有患者；
[0119]c)患有所述疾病且呈现出明显下调水平的LIF的所有患者。
[0120]可以在细胞内、在组织间隙内或在提取物内确定LIF的浓度，其中细胞内蛋白质和提取物出现在组织间隙内。
[0121]在这方面，一个优选实施方式是与有害细胞增殖相关的疾病。在一个更加具体的实施方式中，所述与有害细胞增殖相关的疾病是癌症。甚至更为优选的是，该类癌症与所述癌症患者的一个子集中的LIF的异常高水平有关。在一个更为具体的实施例中，所述癌症是下列之一:白血病、脑胶质瘤、大肠癌、膀胱癌、乳癌。在一个更加具体的实施方式中，白血病为前B细胞急性淋巴细胞白血病或急性髓细胞性白血病，而乳癌为乳腺导管癌或乳腺癌。
[0122]统计方法可以基于所述蛋白或其功能等同变异体的水平来对患者的平均生命期望值进行预测。所述蛋白优选是LIF`。
[0123]本发明所用术语“功能等同的变异体”还包括所述标记物蛋白LIF的任何功能等同的片段。“片段”一词涉及含有所述标记蛋白的一部分的肽。在这种情况下，功能等同的片段是含有一部分所述标记蛋白并基本具有与所述蛋白相同功能的一种肽或蛋白。
[0124]在一个更加具体的实施方式中，蛋白质水平的量化是通过免疫分析法如蛋白质印迹、免疫组织化学或ELISA的方式实现的。在一个甚至更为具体的实施方式中，所述免疫分析法包括通过保藏编号为DSMACC3054的杂交瘤细胞系产生的抗体。
[0125]实施例:
[0126]下面通过实施例对本发明作进一步说明，但所述实施例仅是示例性的，并不对本发明范围构成任何限制。
[0127]材料和方法
[0128]细胞系和原代细胞培养物
[0129]PCTC 和 GBM 神经球依照前述获得(Bruna 等，Cancer Cell, 11:147-160, 2007;Gunther等，Oncogene, 2007)。简单地说，肿瘤样本在外科切除手术后的30分钟内进行处理。人类GBM样本的碎片用200U/ml的胶原酶I (Sigma公司)和500U/ml的脱氧核糖核酸酶I (Sigma公司)在PBS中及37°C条件下消化2小时，期间持续剧烈搅拌。单细胞的悬浮液通过70 μ m的细胞过滤器(BD Falcon公司)过滤，并用PBS冲洗。最后，使细胞再悬浮，并随后在含有10%PBS的DMEM (用于PCTC培养)中，或者在神经球培养基中培养(用于GBM神经球)中培养。神经球培养基由添加有B27 (Gibco公司)的神经基质(Neurobasal)培养基(Gibco公司)、L-谷氨酰胺(Gibco公司)、青霉素/链霉素和生长因子(20ng/ml的EGF和20ng/mL的FGF-2，Peprotech公司)组成。人类GBM样本从瓦尔德希伯伦医院获得。
[0130]临床方案经瓦尔德希伯伦医院的伦理委员会(CEIC)批准，并获得了所有主体的许可。
[0131]颅内肿瘤检验
[0132]所有小鼠实验均经核准，并按照瓦尔德希伯伦研究所的机构实验动物管理委员会的指导方针进行，符合欧洲联盟和国家指令。将所述细胞立体定位接种到9周龄N0D/SCID鼠(Charles River实验室)的大脑右半球(前室1mm，前囟门侧室1.8mm,脑实质3.0mm)的纹状体中。当它们呈现出神经系统症状或体重明显下降时，处死小鼠。为小鼠腹腔注射钆二乙烯三胺五乙酸，剂量为0.25mmol Gd/kg的重量，然后对其进行磁进行磁共振成像(MRI)分析。整个脑部的TlW磁共振成像(MRI)是在通过接口与AVANCE 400系统(Bruker公司)相连的9.4T垂直孔磁铁中采用自旋回波序列依照前述获得(Penuelas等，CancerCell, 15:315-327, 2009)。肿瘤体积是采用制造商提供的软件通过测量对应于每幅图像中肿瘤组织的像素数进行量化。
[0133]统计分析
[0134]进行学生t_检验来用于统计分析。曲线中的数据以平均值土SD表示。
[0135]质粒和试剂
[0136]TGFM (R & D 公司)、TRP I 抑制剂 LY2109761 (Eli Lilly 公司)和 SB431542(Tocris公司)均以指定浓度`使用。将针对p_Smad2、Smad2 (Cell Signaling公司)；α -微管蛋白(Sigma公司)和Idl (C20, Santa CruzBiotechnology公司)的特异性抗体用于蛋白质印迹法。对慢病毒构建体依照前述进行制备和包装(Zufferey等，Nat.Biotechnol.，15:871-875, 1997)。在生长培养基中分离神经球，将其与病毒混合，接种。加入浓度为Syg/ml的聚凝胺(Sigma公司)。将细胞与病毒孵育12小时，用PBS冲洗，并依照前述在新鲜培养基中进行孵育(Zufferey等，Nat.Biotechnol., 15:871-875，1997)。
[0137]采用流式细胞计进行CD44阳性细胞群分析
[0138]将神经球分离，并将单个细胞在含有10 □ g/ml的人类IgG (免疫球蛋白)的封闭液中孵育15分钟，继之处理抗CD44抗体或所述对照IgG2b同型，二者都用FITC (异硫氰酸)标记(BD Pharmingen公司)。细胞在冰上避光孵育20分钟，在PBS中清洗，并用碘化丙锭(Sigma公司)染色来分辨死细胞。然后用流式细胞计对细胞进行分析(FACSCalibur; Beckton Dickinson)，或用 CD44-FITC 染色后进行分选(MoFlo; DAK0)。
[0139]从鼠脑内的原位移植物中分离人类细胞
[0140]对注入了神经球的鼠源大脑进行分解，和并用pan-MHC I类特异性mAb HP-1F7进行染色(Santa Cruz Biotechnology 公司)，接着用 PE-突光标记 mAb(Dako Cytomation 公司)进行第二次染色以便随后对人类MHC-1类阳性细胞(MoFlo-DAKO)进行细胞分选。将所获得的细胞进行清洗，并立即用于随后的实验。
[0141]神经球形成试验
[0142]以低细胞密度(4个细胞/μ I)的方式将同等数量的细胞接种到96孔板的孔中。细胞用指定化合物处理，并在培养7天后对新生成的神经球的总数进行计数(Lee等，CancerCell, 13:69-80，2008;Reynolds和 Weiss, Dev.Biol.175:1-13，1996)。
[0143]自我更新试验
[0144]采用指定化合物对取自指定GBM神经球并以100细胞/ μ I的细胞密度接种的细胞进行7天的处理。然后将神经球分离，在不予处理条件下再次接种，并另外再孵育7天。对新生成的神经球的总数进行计数。
[0145]实时PCR量化
[0146]使用Applied Biosystems公司的Taqman探针进行实时PCR量化(qRT-PCR),按照制造商的建议进行。反应在ABI 7000序列检测仪(Perkin Elmer公司)中进行，并且结果通过Λ ACt法以相对于对照样本所计算的倍数变化来表示。采用GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶)作为内部归一化对照。
[0147]免疫组织化学，免疫细胞化学
[0148]为了制备组织微列阵，分别从不同的区域采取三个0.6mm的芯，并将每个芯都排列到Imm间隔的网格内的载体腊块中。以下抗体用于蛋白质检测:抗IdKBioCheck公司)、抗 CD44 (Ab_4, Neomarkers 公司)，抗 CD31 (clone JC70A, DAKO 公司)。为了对 Idl 进行定量分析，使用光学显微镜以超大功率视域(x400)对组织切片中染色肿瘤细胞所占的百分比以及染色的强度进行估算。结果被表示为H-评分或阳性细胞的百分比。
[0149]神经球的Idl (Santa Cruz Biotechnology公司)免疫细胞化学依前所述进行(Geschwind 等，Neuron, 29:325-329，2001)。细胞核用 4’，6- 二氨基 _2_ 苯基吲哚(DAPI)复染。
[0150]微切割
[0151]确定冷冻样本的ΙΟμπι的四溴突光素(hematoxylineosin)染色部分上的远离坏死灶的典型肿瘤区域。肿瘤细胞采用徕卡LMD6000微切割仪进行微切割，并根据制造商的建议采用微量RNA提取试剂盒(Qiagen公司)进行处理来获得RNA。
[0152]荧光素酶检测
[0153]以不同的IDl启动子报告构建体和PRL-TK海肾萤光素酶(ReniIlaluciferase)质粒(Promega公司)作为标准对照，并采用脂质体2000 (Invitrogen公司)对GBM神经细胞进行瞬时转染。
[0154]实施例1:产生针对人类LIF的抗体的杂交瘤细胞系
[0155]为制备针对人类LIF的抗体而采用本领域任意技术人员公知的方法生产杂交瘤细胞系。由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所从这些杂交瘤细胞系中选取一个细胞系，并于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心。保藏编号为DSM ACC3054。此外，还要对由所述细胞系产生的抗体的同源细胞群进行选择。由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤细胞系DSMACC3054产生的抗人类LIF单克隆抗体(α-LIF)的结合特异性随后通过免疫沉淀反应来确定。为此目的，对用人类LIF蛋白的C-端EGFP-标记的变异体转染的293T细胞(图1A)进行裂解，并采用单克隆抗LIF抗体进行免疫沉淀反应，接着将蛋白质A/G添加到所述裂解物中，并洗脱免疫沉淀物。使用抗EGFP抗体通过免疫印迹检测LIF片段。这种分析显示，所述抗体可以识别LIF或其变异体，只要有包含氨基酸第160-202位的人类LIF蛋白的C端区域存在。单克隆抗体可以识别EGFP标记的全长LIF，而不是对应于氨基酸第广72位、第f 127位或第f 160位的EGFP-标记的LIF片段(图1B)。因此，所述由第160-202位氨基酸组成的人类LIF蛋白的C端区域是被抗LIF抗体识别所必需的。
[0156]实施例2:单克隆抗LIF抗体阻止细胞培养物和源于患者的胶质母细胞瘤神经球中的LIF对磷酸化信号转导和转录激活因子3 (Phospho-Stat3)的诱导。
[0157]为了测试由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗LIF抗体对于其在LIF下游的阻断作用中的效力的影响，在有或没有指定单克隆抗体存在的条件下，或者同型-匹配的IgG作为对照的条件下，采用或不采用人类重组LIF对U373细胞进行处理。之后通过蛋白质印迹测定磷酸化信号转导和转录激活因子3的水平，结果表明，以单克隆抗LIF抗体给药将会有效阻止LIF介导的磷酸化信号转导和转录激活因子3的诱导(图2A)。
[0158]为了试验所述抗体对源于患者的肿瘤细胞的影响，将源于患者的GBM神经球分离出来，并可选地将其在有所述抗体或同型-匹配的对照IgG存在条件下进行孵育。之后采用蛋白质印迹测定磷酸化信号转导和转录激活因子3的水平，结果表明，以源于患者细胞中的单克隆抗LIF抗体给药将会有效阻止LIF介导的磷酸化信号转导和转录激活因子3的诱导(图2B)。
[0159]实施例3:源于患者的GBM神经球含有⑶44A/IdlA细朐区室。
[0160]⑶44是一种被称为是在某些肿瘤的CIC中被高度表达的蛋白(Vi svader和Lindeman, Nat.Rev.Cancer, 8:755-768，2008)。此外，本项研究的作者发现，在GBM神经球中，存在两个表达不同水平CD44的彼此独立的群(图3A)。然而，迄今为止，脑胶质瘤中，⑶44s区室还没有被广泛研究。为了测试⑶44的表达是否与源自患者神经球的细胞中的Idl的表达相关，依照“材料和方法”部分所述，基于细胞的染色，通过流式细胞仪对取自四名不同患者的神经球的⑶44s群进行分选。随后，分别测定⑶44?和⑶44ffi群中的Idl的表达水平。令人关注的是，经检测，⑶4`4?区室中的Idl蛋白和RNA水平远高于⑶44<￡区室(图3B和3C)。令人关注的是，⑶44s群中的Id3也呈现出明显较高的水平，然而对于转录因子的Id家族中另一个成员Id2却不是这样的状况(图3B)。因此，高水平的⑶44与高水平的Idl和Id3相关。
[0161]实施例4:GBM神经球中CD44A/IdlA群富含脑胶质瘤起始细朐
[0162]作者发现，在采用血清治疗的方式诱导源于患者的神经球分化时室消失(图4A)。接下来，对⑶44胃和⑶44ffi细胞进行分选，并以低密度接种。⑶44胃细胞产生的神经球比⑶44ffi区室多(图4B)，这表明与⑶44<￡细胞相比，⑶44*细胞具有较高的神经球-形成能力。接下来，对与CD44ffi区室相比的CD44SW肿瘤启动能力进行了分析。基于CD44的表达对肿瘤细胞进行分选，并且以在体内进行有限稀释的方式来将减少量的细胞植入NOD-SCID小鼠的右纹状体内。采用磁共振成像(MRI)监测肿瘤的进展。表达高水平⑶44的细胞比⑶44<￡表达细胞致瘤性更强。7只接种100.000⑶44ffi细胞的小鼠中只有I只产生了肿瘤，而当给他们接种相同数量的⑶44?细胞时，9只小鼠中有9只产生肿瘤(图4和4D)。此外，接种10.000或1.000⑶44胃细胞的小鼠均产生肿瘤，而接种相同数量的⑶44ffi则绝不会生成肿瘤。而对于来自另一患者的GBM2细胞也获得了类似的结果(图4D)。由⑶44s区室产生的肿瘤复制了包括相同的细胞异质性的患者的肿瘤的病理组织学特征(图4E)。例如，在小鼠体内产生的肿瘤含有与患者的肿瘤相同的百分比(约70%)的Sox2阳性和阴性细胞(图4E)。所有结果都表明⑶44胃区室富含GIC，这与在其他肿瘤类型中所显示的一样。
[0163]实施例5:杭LIF杭体减小了 GBM神经球内的CD44A/IdlA群的水平
[0164]将GBM神经球分离，并将其在有源自细胞系DSM ACC3054或同型-匹配的对照IgG的抗LIF单克隆抗体存在的条件下，在有EGF和FGF存在(A)或没有EGF和FGF存在(B)的条件下培养7天。很明显的是，用抗LIF抗体处理的神经球减少了⑶44s区室。因此，TGF3调节了表达高水平Idl并富含GIC的⑶44*区室。
[0165]实施例6:杭LIF杭体降低源自患者的GBM神经球内的⑶44和Idl水平
[0166]将GBM神经球分离，并将其在抗LIF单克隆抗体或同型对照IgG的存在条件下，在有或没有EGF和FGF存在条件下培养7天，并通过qRT-PCR分析指定基因的mRNA水平。与同型-匹配的对照IgG相比，Idl mRNA水平以及⑶44 mRNA水平在施用源于患者的GBM神经球内的抗LIF抗体时明显降低。
[0167]实施例7:在体内用抗LIF抗体治疗减小CD44A/IdlAM胞区室
[0168]为了评估作为对施用单克隆抗LIF抗体的反应肿瘤中的GIC群的减少是否会影响肿瘤复发，本发明的作者首先通过接种GBMl神经球的方式在小鼠体内产生肿瘤。接种细胞一个月后，通过磁共振成像检测到小鼠荷瘤。这时，用单克隆抗LIG抗体或同型-匹配的IgG对小鼠治疗10天，并处死。通过分选人类MHC-1类阳性细胞的方式从鼠脑中分离出人类肿瘤细胞(图7A)。
[0169]用TPRI抑制剂处理来自小鼠的细胞，结果表明，通过qRT-PCR测量显示ID1、ID3和⑶44的水平降低(图7B)。
[0170]实施例8:其脑胶质瘤`或胶质母细胞瘤呈现上调LIF水平的患者整体生命期望值麵
[0171]在所有脑胶质瘤患者的一个子集中，LIF水平上调> 2倍。在规定的时间段内，与对照组患者相比，这些患者的存活率显著降低。例如，1000天后存活率，与所有的脑胶质瘤患者相比减少到大约50%，而与LIF水平没有上调> 2倍的脑胶质瘤患者相比减少到大约35% (图8)。数据来自存储库为分子大脑肿瘤数据(伦布兰特)程序形式国家癌症研究所。
[0172]在所有脑胶质瘤患者的一个子集中，LIF水平上调> 9倍。在规定的时间段内，与对照患者相比，这些患者的存活率显著降低。例如，500天后存活率，与所有的脑胶质瘤患者相比减少到大约50% (图9)。数据来自存储库为分子大脑肿瘤数据(伦布兰特)程序形式国家癌症研究所。
[0173]【具体实施方式】
[0174]以下是本发明的优选的实施方式。然而，本发明不应被理解受限于这些优选的实施方式:
[0175]1.一种单克隆抗体或其片段，其能够识别全长度人类LIF，但不识别对应于氨基酸第广72位的LIF片段，更优选地是不识别对应于氨基酸第f 127位的LIF片段，甚至更为优选地是不识别对应于氨基酸第f 160位的LIF片段。
[0176]2.根据实施方式I所述的单克隆抗体，其中:所述抗体能够识别对应于人类LIF的氨基酸第160-202位的区域内所包含的人类LIF的抗原表位。
[0177]3.根据实施方式I所述的单克隆抗体，其中:所述抗体能够识别以下区域所包含的抗原表位，所述区域选自:对应于人类LIF的氨基酸第160-180位的区域，对应于氨基酸第17(Tl90位的区域，对应于氨基酸第180-200位的区域，对应于氨基酸182~202位的区域。
[0178]4.根据上述实施方式中任意一项所述的单克隆抗体，其中:所述抗体在与人类LIF的结合中受到由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤产生的单克隆抗体的竞争性抑制。
[0179]5.属于IgGl同型的根据上述实施方式中任意一项所述的单克隆抗体。
[0180]6.根据上述实施方式中任意一项所述的单克隆抗体，其中:其由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的保藏编号为DSM ACC3054的杂交瘤细胞系产生。
[0181]7.由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤。
[0182]8.一种用于测量人类LIF的免疫分析试剂，其包含根据实施方式1飞中任意一项所述的单克隆抗体或其片段。
[0183]9.根据实施方式广6中任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其中:所述抗体或其片段通过抑制肿瘤干细胞的自我再生起作用。
[0184]10.一种用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的针对人类LIF的抗体或其片段。
[0185]11.用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的根据实施方式1~6或9中任意一项所述的抗体或其片段。
[0186]12.一种含有根据 实施方式1~6或扩11中任意一项所述的抗体或其片段以及药学可接受载体的药物组合物。
[0187]13.体外方法，用于诊断与主体患有与害细胞增殖相关的疾病，或用于确定主体罹患与有害细胞增殖相关的所述疾病的倾向性，或用于确定主体患有与有害的细胞增殖相关的所述疾病的阶段或严重程度，或用于监测对患有与有害的细胞增殖相关的所述疾病的主体的治疗效果，其包括来自所述主体的生物学样本中的LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的表达水平的量化，其中，相对于对照样本中编码LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的基因的表达，编码LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的基因的表达的增加是与有害细胞增殖相关的疾病、或所述主体具有罹患与有害细胞增殖相关疾病的较大倾向性、或所述主体对所施与的治疗无反应的体现。
[0188]14.一种含有用于为诊断主体患有的与有害细胞增殖相关的疾病、或者为了确定主体罹患所述疾病的倾向性、或者为确定主体患有所述疾病的阶段或严重程度、或者为监测对患有所述疾病的主体的治疗效果而对LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体、或者这些分子的任意组合的表达水平进行量化的试剂的试剂盒的应用，其中，如果试剂检测出相对于对照样本的所述基因或所述蛋白或其功 能等同变异体的表达增加，则所述主体患有所述疾病，或呈现很大罹患所述疾病的可能性，或罹患所述疾病较为严重，或所接受的治疗无效。[0189]15.一种用于设计对于患有与LIF水平增加相关的疾病的患者进行个体化治疗的体外方法包括:
[0190](a)量化所述患者体内LIF的表达水平，以及
[0191](b)将表达水平与对照水平进行比较，
[0192]其中:如果所述患者体内LIF的表达水平大于对照值，则将LIF的抗体施用于患者。
[0193]16.一种用于选择患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者以采用针对LIF的抗体进行治疗的体外方法，包括:
[0194](a)量化所述患者体内LIF的表达水平，以及
[0195](b)将表达水平与对照水平进行比较，
[0196]其中:如果所述患者体内LIF的表达水平大于对照值，则选择所述患者接受根据实施方式1-6或扩12所述的抗体或其片段的治疗。
[0197]17.一种对患有有害细胞增殖相关的疾病的主体的生命期望值或存活率进行预测的体外方法，包括:对来自所述主体的生物样本的LIF或其功能等同变异体的表达水平进行量化，其中:与对照样本中的LIF或其功能等同变异体的表达相比，LIF或其功能等同变异体的表达的增加表明生命期 望值缩短。
[0198]18.根据实施方式10-14中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物，或方法或试剂盒，其中:表现为有害细胞增殖的所述疾病的特征是呈现高水平的LIF。
[0199]19.根据实施方式10-17中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物，或方法或试剂盒，其中:表现为有害细胞增殖的所述疾病的特征是具有高表达水平的CD44和Idl的细胞群。
[0200]20.根据实施方式10-19中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物，或方法或试剂盒，其中:表现为有害细胞增殖的所述疾病是癌症。
[0201]21.根据实施方式18~20中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物，或方法或试剂盒，其中:所述癌症为下列之一:脑胶质瘤、前-B细胞急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、肺腺癌、前列腺癌、直肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。
[0202]22.根据实施方式21所述的抗体或其片段或药物组合物，或方法或试剂盒，其中:所述脑胶质瘤为IV级脑胶质瘤。
[0203]23.根据实施方式13~22中任意一项所述的方法或试剂盒，其中:所述LIF水平的量化通过蛋白质印迹、免疫组织化学或酶联免疫吸附测定进行。
[0204]24.根据实施方式13~23中任意一项所述的方法或试剂盒，其中:用于测量LIF的表达水平的方法或试剂盒包括根据实施方式I飞或9中任意一项所述的单克隆抗体或其片段。
[0205]25.根据实施方式f 6或扩12或20-22中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合，其中:所述抗体或其片段能够减少特征为高水平CD44和Idl的细胞群体。
[0206]26.根据实施方式f 6或扩12或20-22中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合，其中:所述抗体通过抑制肿瘤干细胞的自我再生起作用。
[0207]27.根据上述实施方式中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物，或方法或试剂盒，其中:术语“LIF或其功能等同变异体、或者CD44或其功能等同变异体、或者Idl或其功能等同变异体、或者Id3或其功能等同变异体”仅限于LIF或其功能等同变异体。
[0208]PCT
[0209]打印件(原件为电子形式)
[0210]该页不属于国际申请部分，并且不视为国际申请页
[0211]
【权利要求】
1.一种单克隆抗体或其片段，其能够识别全长度人类LIF，但不识别对应于氨基酸第1-72位的LIF片段，更为优选地是不识别对应于氨基酸第f 127位的LIF片段，甚至更为优选地是不识别对应于氨基酸第f 160位的LIF片段。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于:所述抗体能够识别对应于人类LIF的氨基酸第160-202位的区域内所包含的人类LIF的抗原表位。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于:所述抗体识别以下区域所包含的抗原表位，所述区域选自:对应于人类LIF的氨基酸第160-180位的区域，对应于氨基酸第17(Tl90位的区域，对应于氨基酸第180-200位的区域，对应于氨基酸第182~202位的区域。
4.根据上述权利要求中任意一项所述的单克隆抗体，其特征在于:所述抗体在与人类LIF的结合中受到由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤产生的单克隆抗体的竞争性抑制。
5.属于IgGl同型的根据上述权利要求中任意一项所述的单克隆抗体。
6.根据上述权利要求中任意一项所述的单克隆抗体，其特征在于:其由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的保藏编号为DSMACC3054的杂交瘤细胞系产生。
7.由瓦尔德希伯伦肿瘤研究所于2010年4月I日保藏于德国微生物菌种保藏中心的杂交瘤细胞系DSM ACC3054。
8.一种用于测量人类LIF的免疫分析试剂，其包含根据权利要求f 6中任意一项所述的单克隆抗体或其片段。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于:所述抗体或其片段通过抑制肿瘤干细胞的自我再生起作用。
10.一种用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的针对人类LIF的抗体或其片段。
11.用于治疗与有害细胞增殖相关疾病的根据权利要求1-6或9中任意一项所述的的抗体或其片段。
12.—种含有根据权利要求1-6或扩11中任意一项所述的抗体或其片段以及药学可接受载体的药物组合物。
13.用于诊断与主体患有与害细胞增殖相关的疾病、或用于确定主体罹患与有害细胞增殖相关的所述疾病的倾向性、或用于确定主体患有与有害的细胞增殖相关的所述疾病的阶段或严重程度、或用于监测对患有与有害的细胞增殖相关的所述疾病的主体施与的治疗效果的体外方法，包括来自所述主体的生物学样本中的LIF或其功能等同变异体的表达水平的量化，其中，相对于对照样本中的编码LIF或其功能等同变异体的基因的表达，编码LIF或其功能等同变异体的基因的表达的增加是与有害细胞增殖相关的疾病、或所述主体具有罹患与有害细胞增殖相关的疾病的较大倾向性、或对所述主体施与的治疗无反应的体现。
14.一种含有用于为诊断主体患有的与有害细胞增殖相关的疾病、或者为了确定主体罹患所述疾病的倾向性、或者为确定主体患有所述疾病的阶段或严重程度、或者为监测对患有所述疾病的主体的治疗效果而对LIF或其功能等同变异体的表达水平进行量化的试剂的试剂盒，其中，如果试剂检测出相对于对照样本的编码LIF或其功能等同变异体的基因的表达增加，则所述主体患有所述疾病，或呈现很大罹患所述疾病的可能性，或罹患所述疾病较为严重，或所接受的治疗无效。
15.权利要求14所述的试剂盒的应用。
16.一种用于设计对于患有与LIF水平增加相关的疾病的患者进行个体化治疗的体外方法，包括: (a)量化所述患者体内LIF的表达水平，以及 (b)将所述表达水平与对照水平进行比较， 其中:如果所述患者体内LIF的表达水平大于对照值，则将LIF抗体施用于所述患者。
17.一种用于选择患有与有害细胞增殖相关的疾病的患者以采用针对LIF的抗体进行治疗的体外方法，包括: (a)量化所述患者体内LIF的表达水平，以及 (b)将所述表达水平与对照水平进行比较， 其中:如果所述患者体内LIF的表达水平大于对照值，则选择所述患者接受根据权利要求f 6或9~12所述的抗体或其片段的治疗。
18.—种对患有有害的细胞增殖相关的疾病的主体的生命期望值或存活率进行预测的体外方法，包括:对来自所述主体的生物样本中的LIF或其功能等同变异体的表达水平进行量化，其中:与对照样本中的LIF或其功能等同变异体的表达水平相比，LIF或其功能等同变异体的表达的增加表明生命期望值缩短。
19.根据权利要求10-14中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物或方法或试剂盒，其特征在于:表现为有害细胞增殖的所述疾病的特征是呈现高水平的LIF。
20.根据权利要求10-18中的任意一项或多项所述的抗体或其片段或药物组合物或方法或试剂盒，其特征在于:表现为有害细胞增殖的所述疾病的特征是CD44和Idl的细胞群的表达水平高。
21.根据权利要求10-20中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物或方法或试剂盒，其特征在于:表现为有害细胞增殖的所述疾病是癌症。
22.根据权利要求1f21中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物或方法或试剂盒，其特征在于:所述癌症为下列之一:脑胶质瘤、前B细胞急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞白血病、肺腺癌、前列腺癌、直肠癌、膀胱癌、乳腺导管癌或乳腺癌。
23.根据权利要求22所述的抗体或其片段或药物组合物或方法或试剂盒，其特征在于:所述脑胶质瘤为IV级脑胶质瘤。
24.根据权利要求13~23中任意一项所述的方法或试剂盒，其特征在于:LIF的水平的量化通过蛋白质印迹、免疫组织化学或酶联免疫吸附测定进行。
25.根据权利要求13~24中任意一项所述的方法或试剂盒，其特征在于:用于测量LIF的表达水平的方法或试剂盒包括根据权利要求1飞或9中任意一项所述的单克隆抗体或其片段。
26.根据权利要求f6或扩12或23中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物，其特征在于:所述抗体或其片段能够减少特征为高水平CD44和Idl的细胞群。
27.根据权利要求f6或扩12或23中任意一项所述的抗体或其片段或药物组合物，其特征在于:所述抗体通过抑制肿瘤干细胞的自我再生起作用。
【文档编号】C07K16/24GK103797031SQ201180027552
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2011年4月5日 优先权日:2010年4月5日
【发明者】琼·塞奥尼·苏亚雷斯, 茱蒂特·艾尼多·弗古艾拉, 安德里亚·塞斯·鲍德拉斯 申请人:瓦尔德希伯伦肿瘤研究所, 加泰罗尼亚研究和深造学院