人源化抗因子d抗体及其用途

人源化抗因子d抗体及其用途
【专利摘要】本发明涉及人源化抗因子D抗体及其用途。本发明涉及抗因子D抗体、它们的核酸和氨基酸序列、包含这些抗体的细胞和载体及它们的生产和它们在制备用于治疗与补体活化过度或不受控制有关的疾病和病症的组合物和药物中的用途。这些抗体对于疾病的诊断、预防和治疗是有用的。
【专利说明】人源化抗因子D抗体及其用途
[0001]本申请是申请日为2009年04月27日、中国申请号为200980123668.2、发明名称为“人源化抗因子D抗体及其用途”的发明申请的分案申请。
[0002]对相关申请的交叉引用
[0003]依据37CFR § 1.53(b)提交的此非临时申请依据35USC § 119(e)要求2008年4月28日提交的美国临时申请流水号61/048，431和2008年4月29日提交的美国临时申请流水号61/048，689的好处，通过述及将其内容完整收入本文。[0004]发明背景
[0005]补体系统在清除免疫复合物和对传染剂、外来抗原、受到病毒感染的细胞和肿瘤细胞的免疫应答中发挥中枢作用。然而，补体还涉及病理性炎症和自身免疫病。因此，抑制过度的或不受控制的补体级联活化能给具有此类疾病和状况的患者提供临床好处。
[0006]补体系统涵盖两种截然不同的活化途径，称作经典和旁路途径(V.M.Holers，在Clinical Immunology !Principles and Practice 中，R.R.Rich 编，Mosby Press ；1996,363-391)。经典途径是一种钙/镁依赖性级联，其在正常情况中通过形成抗原-抗体复合物来活化。旁路途径是一种镁依赖性级联，其通过C3在某些易感表面(例如酵母和细菌细胞壁多糖，和某些生物聚合物材料)上沉积和活化来活化。补体途径的活化产生补体蛋白质的生物学活性片段，例如C3a、C4a和C5a过敏毒素和C5b_9膜攻击复合物(MAC)，其介导涉及白细胞趋化性，巨噬细胞、嗜中性粒细胞、血小板、肥大细胞和内皮细胞活化，血管通透性，细胞溶解，和组织损伤的炎症活性。
[0007]因子D是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶，其对于旁路补体途径的活化是至关重要的。它切割结合至C3b的因子B，产生C3b/Bb酶，即旁路途径C3/C5转化酶的活性成分。因子D可能是抑制的合适靶物，因为它在人体中的血浆浓度非常低(l.Syg/ml)，而且它已经显示出是旁路补体途径活化的限制酶(P.H.Lesavre和H.J.Miiller-Eberhard,J.Exp.Med.，1978 ；148:1498-1510 ； J.E.Volanakis et al.，New Eng.J.Med.，1985 ；312:395-401)。
[0008]已经在动物模型和离体研究中证明下调补体活化有效治疗数种疾病适应证，例如系统性红斑狼疮和肾小球肾炎(Y.Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.； 1996，93:8563-8568)、类风湿性关节炎(Y.Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.，1995 ；92:8955-8959)、心肺转流术和血液透析(C.S.Rinder，J.Clin.1nvest.，1995 ；96:1564-1572)、器官移植中的超急性排斥反应(T.J.Kroshus et al., Transplantation,1995;60:1194-1202)、心肌梗死(J.W.Homeister et al., J.1mmunol., 1993 ；150:1055-1064 ；H.F.Weisman et al.，Science，1990;249:146-151)、再灌注损伤(E.A.Amsterdam et al.，Am.J.Physiol.，1995 ；268:H448_H457)、和成人呼吸窘迫综合征(R.Rabinovici et al.，J.1mmunol.，1992 ；149:1744-1750)。另外，其它炎性状况和自身免疫/免疫复合物疾病也与补体活化密切有关(V.M.Holers,见上文；B.P.Morgan.Eur.J.Clin.1nvest., 1994:24:219-228)，包括热伤、严重的哮喘、过敏性休克、肠炎症、荨麻疹、血管性水肿、血管炎、多发性硬化、重症肌无力、膜性增生性肾小球肾炎、和斯耶格伦氏综合征。
[0009]补体介导的病症领域需要抗体治疗剂，而本发明的人源化抗因子D抗体及其抗体变体及其片段(例如抗原结合片段)提供对于满足这种需要有用的高亲和力抗体。
[0010]发明概述
[0011]一方面，本发明一般性涉及能够抑制与因子D有关的生物学活性的抗体。
[0012]一方面，本发明涉及具有多种治疗上想要的特征的人源化抗因子D抗体。本发明包括这些人源化抗因子D抗体的HVR的氨基酸序列，和它们相应的核酸序列。本发明包括所述人源化抗因子D抗体的重链和轻链可变域的氨基酸序列，和它们相应的核酸序列。本发明包括所述人源化抗因子D抗体的重链和轻链的氨基酸序列，和它们相应的核酸序列。
[0013]一方面，本发明范围内的具体抗体包括但不限于如下的人源化抗因子D抗体，其包含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11的HVR。在一个实施方案中，所述人源化抗因子D抗体包含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11的重链和/或轻链可变域。在一个实施方案中，所述人源化抗因子 D 抗体包含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11的重链和/或轻链。在一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11。在一个实施方案中，本发明包括人源化抗因子D Fab克隆#238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10 或 238-11 全长抗体的抗体片段(例如抗原结合片段)。在一个实施方案中，本发明包括全长抗体或其抗原结合片段，其包含人源化抗因子 D Fab 克隆 #238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10或238-11重链和/或轻链的抗原结合序列。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个、或三个重链HVR。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个、或三个轻链HVR。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个重链可变域。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个轻链可变域。
[0014]一方面，本发明提供人源化抗因子D Fab克隆#111的抗体片段(例如抗原结合片段)或全长抗体，其包含对人源化抗因子D Fab克隆#111的至少一处序列修饰，其中此类全长抗体或此类抗原结合片段包含人源化抗因子D Fab克隆#111重链和/或轻链的抗原结合序列。在一个实施方案中，人源化抗因子D Fab克隆#111的抗体片段(例如抗原结合片段)或全长抗体包含对人源化抗因子D Fab克隆#111序列的至少一处修饰，包含人源化抗因子D Fab克隆#111重链和/或轻链的抗原结合序列，还与人源化抗体Fab克隆#111结合基本上相同的表位。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个或三个重链HVR。 在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少一个、两个或三个轻链HVR。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个重链可变域。在一个实施方案中，此类抗原结合序列包含至少部分或整个轻链可变域。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在重链中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在轻链中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在重链可变域中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在轻链可变域中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在至少一个、两个或三个重链HVR中。在一个实施方案中，此类所述抗体片段或所述全长抗体中的修饰在至少一个、两个或三个轻链HVR中。
[0015]一方面，本发明关注本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)，其以至少约10_9至10_12M的结合亲和力结合因子D。
[0016]一方面，本发明关注本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)，其中此类抗体的Fab片段以Fab片段对因子D摩尔比约0.05:1(0.05)至约10:1(10)、或约0.09:1(0.09)至约 8:1(8)、或约 0.1:1(0.1)至约 6:1(6)、或约 0.15:1(0.15)至约 5:1(5)、或约 0.19:1(0.19)至约 4:1 ⑷、或约 0.2:1(0.2)至约 3:1(3)、或约 0.3:1(0.3)至约 2:1 ⑵、或约 0.4:1(0.4)至约 1:1(1)、或约 0.5:1(0.5)至约 1:2(0.5)、或约 0.6:1(0.6)至约1:3(0.33)、或约 0.7:1(0.7)至约 1:4(0.25)、或约 0.8:1(0.8)至约 1:5(0.2)或约 0.9:1(0.9)至约1:6(0.17)抑制因子D的生物学功能。
[0017]一方面，本发明的抗体包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
[0018]另一方面、本发明包括人源化抗因子D抗体的抗体片段(例如抗原结合片段)。本发明的抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’ )2、scFv、(scFv) 2、dAb、互补决定区(O)R)片段、线性抗体、单链抗体分子、微型抗体、双抗体、或自抗体片段形成的多特异性抗体。
[0019]在本发明的其它方面，本发明包括组合物，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)。在另一个实施方案中，本发明提供编码本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)的至少一部分的载体和细胞系。一方面，本发明包括本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)和组合物的制备方法、生产方法、和使用方法。在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)的制备方法包括:(a)在适合于编码本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)的多核苷酸表达的条件下培养包含载体的宿主细胞，例如真核或CHO细胞，该载体进一步包含编码所述抗体或其片段(例如抗原结合片段)的多核苷酸，并(b)分离所述抗体或其片段(例如抗原结合片段)。
[0020]又一方面，本发明关注组合物，其包含与载体组合的本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)，如本文中所描述的。任选地，所述载体是药学可接受载体。
[0021]本发明的另一方面是这些人源化抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)制备用于预防和/或治疗与过度的或不受控制的补体活化有关的病症的药物或组合物的用途。它们包括心肺旁路手术期间的补体活化；急性心肌梗死、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官功能衰竭、hypobolemic shock、肠缺血或其它引起缺血的事件后缺血-再灌注损伤所致补体活化。补体活化已经显示出与炎性状况有关，诸如重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重的哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病症可以是不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应的结果。它还包括自身免疫病，诸如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。在另一个实施方案中，补体活化还与移植排斥有关。在另一个实施方案中，补体活化还与眼疾病有关(其病理涉及补体包括经典和旁路补体途径的所有眼状况和疾病)，诸如例如但不限于黄斑变性性疾病诸如所有阶段的老年性黄斑变性(AMD)包括干性和湿性(非渗出性和渗出性)形式、糖尿病视网膜病和其它缺血相关视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。在一个例子中，补体相关眼状况包括老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期(intermediate)干性AMD或地图样萎缩(geographic atrophy, GA))和渗出性(例如湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV)) AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个进一步的例子中，非渗出性AMD可包括硬玻璃疣、软玻璃疣、地图样萎缩和/或色素结块的存在。在另一个例子中，补体相关眼状况包括老年性黄斑变性(AMD)，包括早期AMD (例如包括多个小的玻璃疣至一或多个非渗出性的中等大小的玻璃疣)、中期AMD (例如包括广泛的中等玻璃疣至一或多个大玻璃疣)和晚期AMD (例如包括地图样萎缩或晚期湿性AMD(CNV)。在一个进一步的例子中，中期干性AMD可包括大的汇合的玻璃疣。在一个进一步的例子中，地图样萎缩可包括光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失。在一个进一步的例子中，地图样萎缩的区域可以是小的或大的，和/或可以在黄斑区域中或在周边视网膜中。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV))。
[0022]另一方面，本发明提供试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)。在一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)和使用指令。在一个实施方案中，本发明关注试剂盒，其包含本发明的抗体或其片段(例如抗原结合片段)和施用所述抗体来治疗补体相关病症的指令。在一个实施方案中，本发明提供试剂盒，其包含装有组合物的第一容器，该组合物包含本发明的一种或多种抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段);和装有缓冲剂的第二容器。在一个实施方案中，所述缓冲剂是药学可接受的。在一个实施方案中，包含本发明抗体或其片段(例如抗原结合片段)的组合物进一步包含载体，其在一些实施方案中是药学可接受的。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含对受试者施用所述组合物(例如抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)的指令。在一个实施方案中，试剂盒进一步包含使用所述试剂盒的指令。
[0023]一方面，本发明关注制品，其含有对于治疗、预防和/或诊断补体相关病症有用材料。在一个实施方案中，本发明`关注制品，其包含:(a)容器；(b)所述容器上的标签；和(C)装在所述容器中的组合物，其包含本发明的抗体或其变体或其片段(例如抗原结合片段)，其中所述容器上的标签指明所述组合物可用于治疗、预防和/或诊断补体相关病症。
[0024]一方面，本发明提供本发明的抗因子D抗体或其抗体片段(例如抗原结合片段)、本发明的核酸、本发明的表达载体或本发明的宿主细胞在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如补体相关眼状况的药物中的用途。在一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV)) AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎(endophthalmitis)和葡萄膜炎。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV))。
[0025]一方面，本发明提供本发明的制品在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如补体相关眼状况的药物中的用途。在一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV)) AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV))。
[0026]一方面，本发明提供本发明的试剂盒在制备用于治疗性和/或预防性处理疾病，诸如补体相关眼状况的药物中的用途。在一个实施方案中，所述补体相关眼状况选自老年性黄斑变性(AMD)包括非渗出性(例如中期干性AMD或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV) )AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个例子中，所述补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，所述补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，所述补体相关眼状况是湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV))。
[0027]附图简述
[0028]图1A-1C显示下述各项的轻链可变域的序列比对:人源化抗因子D Fab克隆#111 (SEQ ID NO:1)，人源化抗因子 D Fab，238、238-1、238-2、238-3、238-4、238-5、238_6、238-7、238-8、238-9、238-10 和 238-11 (分别为 SEQ ID NO:6_17)和 VLkI 共有序列(SEQID N0:65)。位置依照Kabat编号且高变区(依照Kabat+Chothia HVR定义)框示(HVR:(I)HVR-Ll 鉴定为 Al-AlldTSTDIDDDMN(SEQ ID NO:30), ITSTDIDDDLN(SEQ ID NO:31)、ITSTDIDDDIN(SEQ ID NO:32)、ITSTDIDDDMA(SEQ ID NO:33)或 ITSTDIDDDMQ(SEQ ID NO:34))，(2)HVR-L2 鉴定为 B1-B7(GGNTLRP(SEQ ID NO:35), GGSTLRP(SEQ ID NO:36)或GGATLRP (SEQ ID NO:37))，(3) HVR-L3 鉴定为 C1-C9 (LQSDSLPYT (SEQ ID NO:38))。每种人源化抗因子D Fab中的氨基酸变化以粗体和斜体标示。
[0029]图2A-2C显示下述各项的重链可变域的序列比对人源化抗因子D Fab克隆#111 (SEQ ID NO:2)和人源化抗因子 D Fab，238、238-1、238-2、238-3、238-4、238_5、238-6、238-7、238-8、238-9、238-10 和 238-11 (分别为 SEQ ID NO: 18-29)和 VH 亚组 7共有序列(SEQ ID N0:66)。位置依照Kabat编号且高变区(依照Kabat+Chothia HVR定义)框示(HVR: (I) HVR-Hl 鉴定为 D1-D10 (GYTFTNYGMN (SEQ ID NO:39)，(2) HVR-H2 鉴定为 E1-E19(WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:40)，(3)HVR_H3 鉴定为 F1-F6(EGGVNN(SEQID NO:41)、EGGVAN(SEQ ID NO:42)、EGGVQN(SEQ ID NO:43)、EGGVNA (SEQ ID NO:44)或EGGVNQ(SEQ ID NO:45))。每种人源化抗因子D Fab中的氨基酸变化以粗体和斜体标示。
[0030]图3显示人源化抗因子D Fab238轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:46)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab238的轻链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图4(SEQ ID NO:47)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。
[0031]图4显示人源化抗因子D Fab238轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:47)。该氨基酸序列缺少由图3中所示SEQ ID NO:46编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CLl标有下划线。显示了框架(FR)区和 HVR 区:FRl-LC (SEQ ID NO:48)，FR2-LC (SEQ ID NO:49)，FR3-LC (SEQ ID NO:50)，FR4-LC(SEQ ID NO: 51), HVRl-LC(SEQ ID NO:30 (ITSTDIDDDMN))，HVR2-LC(SEQ ID NO:35(GGNTLRP))，HVR3-LC(SEQ ID NO:38 (LQSDSLPYT))和 CLl(SEQ ID NO:52)。
[0032]图5显示人源化抗因子D Fab238重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:53)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab238的重链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图6 (SEQ ID NO:54)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。[0033]图6显示人源化抗因子D Fab238重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:54)。该氨基酸序列缺少由图5中所示SEQ ID NO:53编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CHl标有下划线。显示了框架(FR)区和 HVR 区:FRl-HC (SEQ ID NO:55)，FR2-HC (SEQ ID NO:56)，FR3-HC (SEQ ID NO:57)，FR4-HC(SEQ ID NO: 58),HVRl-HC(SEQ ID NO:39 (GYTFTNYGMN))，HVR2-HC(SEQ ID NO:40(WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC(SEQ ID NO:41 (EGGVNN))和 CHl(SEQ ID NO:59)。
[0034]图7显示人源化抗因子D Fab238-1轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO:60)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab238-1的轻链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图8(SEQ ID NO:61)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。
[0035]图8显示人源化抗因子D Fab238_l轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO:61)。该氨基酸序列缺少由图7中所示SEQ ID NO:60编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CLl标有下划线。显示了框架(FR)区和 HVR 区:FRl-LC (SEQ ID NO:48)，FR2-LC (SEQ ID NO:49)，FR3-LC (SEQ ID NO:50)，FR4-LC(SEQ ID NO:51),HVRl-LC(SEQ ID NO:30 (ITSTDIDDDMN))，HVR2-LC(SEQ ID NO:35 (GGNTLRP))，HVR3-LC(SEQ ID NO:38 (LQSDSLPYT))和 CLl(SEQ ID NO:52)。
[0036]图9显示人源化抗因子D Fab238-1重链的核苷酸序列(SEQ ID NO:62)。该核苷酸序列编码人源化抗因子D Fab238-1的重链，其中起始和终止密码子以粗体显示并标有下划线。与图10 (SEQ ID NO:63)中的第一个氨基酸对应的密码子以粗体和斜体标示。
[0037]图10显示人源化抗因子D Fab238_l重链的氨基酸序列(SEQ ID NO:63)。该氨基酸序列缺少由图9中所示SEQ ID NO:62编码的多肽的N端信号序列。HVR序列以粗体和斜体标示。可变区是未标有下划线的区域，而第一恒定域CHl标有下划线。显示了框架(FR)区和 HVR 区:FRl-HC (SEQ ID NO:64)，FR2-HC (SEQ ID NO:56)，FR3-HC (SEQ ID NO:57)，FR4-HC(SEQ ID NO: `58),HVRl-HC(SEQ ID NO:39 (GYTFTNYGMN))，HVR2-HC(SEQ ID NO:
40(WINTYTGETTYADDFKG)), HVR3-HC(SEQ ID NO:41 (EGGVNN))和 CHl(SEQ ID NO:59)。
[0038]图11显示人源化抗因子D Fab克隆#111和人源化抗因子D Fabs238和238_1的溶血测定法结果，显示了对旁路补体活性的抑制。显示了 IC5tl值。
[0039]图12显示在因子D的三种血清浓度(9.7nM、16.2nM和26.5nM)，人源化抗因子DFab238的溶血测定法结果，显示了对旁路途径(AP)补体活性的抑制。表3显示与因子D的三种血清浓度对应的IC5(l(nM)和IC9(l(nM)值(数值代表三项重复实验的平均值)。表3中还显示了抗体对靶因子D摩尔比。
[0040]图13显示使用2.5mg剂量单次玻璃体内(IVT)注射抗因子D Fab 238，对人眼中旁路途径(AP)补体活化的抑制的模拟持续时间(假设抗因子D Fab 238的半衰期(t1/2)=11.5天，基于自家兔种间缩放)。单次IVT注射抗因子D Fab238估计抑制视网膜组织中的AP补体活化至少约74天和玻璃体液中的AP补体活化至少约97天。在图13中，虚线显示玻璃体内施用后玻璃体液中的模拟抗因子D Fab 238浓度。在图13中，实线显示玻璃体内施用后视网膜组织中的模拟抗因子D Fab 238浓度。玻璃体液和视网膜组织中的浓度差异基于视网膜组织分配系数估值20% ;换言之，对玻璃体液施用的总药物中20%会到达视网膜组织。
[0041]发明详述[0042]1.定义
[0043]贯穿本申请所使用的术语应当用对本领域普通技术人员通常的和典型的意义来解释。然而， 申请人:希望下列术语被给予如下文所限定的特定定义。
[0044]关于抗体链多肽序列的短语“基本上相同的”可解释为展现出与参照多肽序列至少70%、或80%、或90%、或95%序列同一性的抗体链。关于核酸序列的该术语可解释为展现出与参照核酸序列至少约85%、或90%、或95%、或97%序列同一性的核苷酸序列。
[0045]术语“同一性”或“同源性”应当解释为指比对序列并在必要时引入缺口以获取整个序列的最大百分比同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与同其比较的相应序列中的残基相同的氨基酸残基的百分比。N端或C端延伸或插入均不应当解释为降低同一性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是本领域中公知的。可使用序列分析软件来测量序列同一性。
[0046]术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定靶物的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏靶物特异性的抗体样分子两者。天然抗体和免疫球蛋白通常是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成。每个重链具有在一端的可变域(Vh)，接着是若干恒定域。每个轻链具有在一端的可变域(')和在其另一段的恒定域。
[0047]“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一个例子中，将抗体纯化至⑴根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
[0048]如本文中所使用的，“抗人因子D抗体”指以如下方式特异性结合人因子D的抗体，所述结合方式使其抑制或实质性降低补体活化。
[0049]术语“因子D”在本文中用于指天然序列和变体因子D多肽。
[0050]“天然序列”因子D指与自自然界衍生的因子D多肽具有相同氨基酸序列的多肽，无论其制备模式。如此，天然序列因子D可以从自然界分离，或者可以通过重组和/或合成手段生成。在成熟因子D蛋白诸如成熟人因子D蛋白(NM_001928)之外，术语“天然序列因子D”明确涵盖因子D的天然存在前体形式(例如无活性的前蛋白，其受到蛋白水解切割而生成活性形式)、因子D的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体，以及因子D分子的与来源于自然界的因子D多肽具有相同氨基酸序列的结构构象变体。非人动物(包括高等灵长类和非人哺乳类)的因子D多肽被明确包括在此定义内。
[0051]“因子D变体”意指与天然序列因子D多肽，诸如天然序列人因子D多肽(NM_001928)具有至少约80%氨基酸序列同一性的如下文中所定义的活性因子D多肽。通常，因子D变体与成熟人氨基酸序列(NM_001928)具有至少约80%的氨基酸序列同一性，或至少约85%的氨基酸序列同一性，或至少约90%的氨基酸序列同一性，或至少约95%的氨基酸序列同一性，或至少约98%的氨基酸序列同一性，或至少约99%的氨基酸序列同一性。
[0052]“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照因子D序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后计算相对于较长序列的序列同一'I"生，即即使较短序列显不与较长序列一部分的100%序列同一'I"生，总体序列同一性也会小于100%。
[0053]“百分比(%)核酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与参照因子D编码序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。为测定百分比核酸序列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然后计算相对于较长序列的序列同一性，即即使较短序列显示与较长序列一部分的100%序列同一性，总体序列同一性也会小于100%。
[0054] “分离的”核酸分子指已经鉴定且与核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达所编码多肽的细胞中包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
[0055]“分离的”因子D多肽编码核酸分子指已经鉴定且与因子D编码核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分尚的因子D多肽编码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的因子D多肽编码核酸分子因此与存在于天然细胞中时的编码核酸分子有区别。然而，分离的因子D编码核酸分子包括通常表达因子D的细胞中包含的因子D编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。
[0056]术语“拮抗剂”以最广义使用，包括能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、降低或干扰因子D生物学活性的任何分子。因子D拮抗剂包括但不限于抗因子D抗体及其抗体变体、其抗原结合片段，结合因子D且能够中和、阻断、部分或完全抑制、消除、降低或干扰因子D活性(诸如因子D参与补体相关眼疾的病理学的能力)的其它结合性多肽、肽、和非肽小分子。
[0057]“小分子”在本文中定义为具有低于约600，优选低于约1000道尔顿的分子量。
[0058]“有活性的”或“活性”或“生物学活性”在本发明因子D拮抗剂的语境中指拮抗(部分或完全抑制)因子D生物学活性的能力。因子D拮抗剂的生物学活性的一个例子是在因子D相关疾病或疾患(诸如例如补体相关眼疾)的状态(例如病理学)中实现可测量的改善的能力。所述活性可在体外或在体内测试中测定，包括结合测定法，旁路途径溶血测定法(例如测量对旁路途径补体活性或活化的抑制的测定法)，使用有关动物模型，或人体临床试验。[0059]术语“补体相关病症”以最广义使用，包括与过度的或不受控制的补体活化有关的病症。它们包括心肺旁路手术期间的补体活化；急性心肌梗死、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官功能衰竭、hypobolemic shock、肠缺血或其它引起缺血的事件后缺血-再灌注损伤所致补体活化。补体活化已经显示出与炎性状况有关，诸如重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析；过敏性休克、严重的哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。所述病症可以是不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应的结果。它还包括自身免疫病，诸如系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。补体活化还与移植排斥有关。补体活化还与眼疾病有关，诸如老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病和其它缺血相关视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippe1-Lindau病、眼的组织胞衆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。
[0060]术语“补体相关眼疾”以最广义使用，包括病理学涉及补体(包括经典途径和旁路途径，特别是补体旁路途径)的所有眼疾。补体相关眼疾包括但不限于黄斑变性性疾病诸如所有阶段的老年性黄斑变性(AMD)(包括干性和湿性(非渗出性和渗出性))形式、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变和其它缺血相关视网膜病变、和其它眼内新血管疾病诸如糖尿病性黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞衆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成、和视网膜新血管形成。在一个例子中，补体相关眼疾包括老年性黄斑变性(AMD)(包括非渗出性(例如中期干性AMD(intermediatedry AMD)或地图样萎缩(GA))和渗出性(例如湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV)) AMD、糖尿病视网膜病(DR)、眼内炎和葡萄膜炎。在一个进一步的例子中，非渗出性AMD可包括硬玻璃疣、软玻璃疣、地图样萎缩和/或色素结块的存在。在另一个例子中，补体相关眼状况包括老年性黄斑变性(AMD)，包括早期AMD (例如包括多个小的玻璃疣至一或多个非渗出性的中等大小的玻璃疣)、中期AMD (例如包括广泛的中等玻璃疣至一或多个大玻璃疣)和晚期AMD (例如包括地图样萎缩或晚期湿性 AMD (CNV)。(Ferris et al., AREDS Report N0.18 ；Sallo et al., Eye Res.,34(3):238-40 (2009) ； Jager et al., New Engl.J.Med.,359(1):1735(2008))。在一个进一步的例子中，中期干性AMD可包括大的汇合的玻璃疣。在一个进一步的例子中，地图样萎缩可包括光感受器和/或视网膜色素上皮(RPE)损失。在一个进一步的例子中，地图样萎缩的区域可以是小的或大的，和/或可以在黄斑区域中或在周边视网膜中。在一个例子中，补体相关眼状况是中期干性AMD。在一个例子中，补体相关眼状况是地图样萎缩。在一个例子中，补体相关眼状况是湿性AMD (脉络膜新血管形成(CNV))。
[0061]“治疗”或“处理”指旨在预防病症发展或改变病症病理而实施的干预。因而，“治疗”或“处理”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及要预防病症的受试者。在免疫相关疾病的治疗中，治疗剂可直接改变免疫应答成分的应答程度，或者使得疾病对其它治疗剂(例如抗生素、抗真菌剂、抗炎剂、化疗剂等)的治疗更敏感。
[0062]疾病(诸如补体相关眼疾)的“病理”或“病理学”包括所有危及患者康乐的现象。这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋巴细胞)、抗体生成、自身抗体生成、补体生成、对邻近细胞正常机能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放、任何炎性或免疫学应答的抑制或恶化、炎症细胞(嗜中性细胞、嗜酸性细胞、单核细胞、淋巴细胞)浸润入细胞间隙(cellular spaces)等。
[0063]如本文中所使用的，术语“哺乳动物”指归为哺乳类的任何动物，包括但不限于人，高等灵长类，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如马、猪、牛、犬、猫和雪貂等。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物指人。
[0064]与一种或多种其它治疗剂“联合/组合”施用包括同时(共同)施用和任何次序的序贯施用。
[0065]“治疗有效量”指在目标疾病或疾患(诸如例如补体相关眼疾)的状态(例如病理学)中实现可测量的改善所需要的“因子D拮抗剂”量。
[0066]术语“调控序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。 [0067]若一段核酸与另一段核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接的”。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与该多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。一般而言，“可操作连接的”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接来实现。若没有此类位点，则依照常规实践使用合成的寡核昔Ife衔接头或接头。
[0068]杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度会趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel等，((CurrentProtocols in Molecular Biology)), Wiley Interscience Publishers, 1995。
[0069]“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴定:(1)采用低离子强度和高温进行清洗，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1%十二烷基硫酸钠，于500C ； (2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50%(v/v)甲酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.l%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42V -M (3)采用50%甲酰胺，5x SSC (0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1%焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA (50 μ g/ml), 0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷，于42。。，及于42。。在0.2x SSC (氯化钠/柠檬酸钠)和50%甲酰胺中清洗，于55°C，接着于55°C在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性清洗。
[0070]“中等严格条件”可以如 Sambrook 等，《Molecular Cloning:A LaboratoryManual)), New York, Cold Spring Harbor Press, 1989中所述鉴定,包括使用比上文所述较不严格的清洗溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于 37°C 在含 20% 甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM 柠檬酸三钠)，50mM 磷酸钠(ρΗ7.6)，5χDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性的经剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50°C在Ix SSC中清洗滤膜。技术人员会认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。
[0071]术语“可变的”在抗体可变域的语境中指可变域的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链二者可变域中称作互补决定区(OTR)也称作高变区(HVR)的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区，它们大多采取β -折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR区非常接近的保持在一起，并与来自另一条链的CDR —起促成抗体的祀物结合位点的形成(参见Kabat etal.)。如本文中所使用的,免疫球蛋白氨基酸残基的编号是依照Kabat et al., (Sequencesof Proteins of Immunological Interest， National Institute of Health， Bethesda，Md.1987)的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统进行的，除非另外指明。
[0072]术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区:三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(O)R)是以序列变异性为基础的且是最常用的(Kabat et al., Sequences of Proteinsof Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD.(1991))。Chothia 改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)) oChothia CDR-Hl环的末端在使用Kabat编号规则编号时在H32与H34之间变化，取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入；如果35A和35B都不存在，那么该环在32处结束；如果只有35A存在，那么该环在33处结束；如果35A和35B都存在，那么该环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat⑶R与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结`构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
[0073]
【权利要求】
1.一种抗因子D抗体或其抗原结合片段，其包含: (a)轻链可变域，该轻链可变域包含:具有氨基酸序列ITSTDIDDDMN(SEQID NO:30)的轻链高变区(HVR)-1、具有氨基酸序列GGNTLRP (SEQ ID NO:35)的轻链HVR-2、和具有氨基酸序列 LQSDSLPYT (SEQ ID NO:38)的轻链 HVRUP (b)重链可变域，该重链可变域包含:具有氨基酸序列GYTFTNYGMN(SEQID NO:39)的重链HVR-1、具有氨基酸序列WINTYTGETTYADDFKG(SEQ ID NO:40)的重链HVR-2、和具有氨基酸序列 EGGVNN(SEQ ID NO:41)的重链 HVR-3 ； 其中该轻链可变域在轻链框架区4 (FR4) (SEQ ID NO:51)第7位处包含氨基酸V，且其中该重链可变域在第I位处包含氨基酸E。
2.一种试剂盒，其包含权利要求1的抗因子D抗体或抗原结合片段和施用所述抗体或片段来治疗与过度的或不受控制的补体活化有关的病症的指令。
3.权利要求2的试剂盒，其中所述与过度的或不受控制的补体活化有关的病症是眼病。
4.权利要求3的试剂盒，其中所述眼病是老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞浆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成或视网膜新血管形成。
5.权利要求4的试剂盒，其中所述老年性黄斑变性是中期干性AMD或地图样萎缩。
6.权利要求1的抗因子D抗体或抗原结合片段在制备药物中的用途，所述药物可用于治疗与过度的或不受控制的补体活化有关的病症，其中所述与过度的或不受控制的补体活化有关的病症是炎性病症或眼病。
7.权利要求6的用途，其中所述与过度的或不受控制的补体活化有关的病症是炎性病症，且其中所述炎性病症是自身免疫病。
8.权利要求7的用途，其中所述自身免疫病是系统性红斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病或多发性硬化。
9.权利要求6的用途，其中所述与过度的或不受控制的补体活化有关的病症是眼病，且其中所述眼病是老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病、脉络膜新血管形成(CNV)、葡萄膜炎、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、von Hippel-Lindau病、眼的组织胞衆菌病、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、角膜新血管形成或视网膜新血管形成。
10.权利要求9的用途，其中所述老年性黄斑变性是中期干性AMD或地图样萎缩。
【文档编号】C07K16/40GK103724433SQ201310681246
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2009年4月27日 优先权日:2008年4月28日
【发明者】阿瑟.J.黄, 罗伯特.F.凯利, 亨利.洛曼, 曼诺.范卢克伦坎帕格尼, 查尔斯.M.温特 申请人:健泰科生物技术公司