专利名称：：抗人神经生长因子的高亲和力人抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及与人神经生长因子(NGF)特异性结合的人抗体和人抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗方法。
背景技术：
：神经生长因子(NGF)是最先确定的神经营养素，其在周围神经元和中枢神经元的发育和存活中的作用已被充分描述。NGF已被证明在周围交感和胚胎感觉神经元和基底前脑胆碱能神经元的发育中是一种关键的存活和维持因子(Smeyneetal.(1994)Nature368246-249；Crowleyetal.(1994)Cell76:1001_1011)。NGF上调感觉神经元中神经肽的表达(Lindsayetal.(1989)Nature337:362-364)且其活性是通过两种不同的膜结合受体-TrkA受体和p75普通神经营养素受体-介导的。NGF在患有类风湿性关节炎和其他类型关节炎的患者的滑液中含量增高。业已证明，在神经性和慢性炎症性疼痛动物模型中，NGF拮抗剂可预防痛觉过敏和异常性疼痛。抗NGF抗体在诸如W001/78698,WO02/096458、W02004/032870、美国专利申请公开说明书2005/0074821、2004/0237124和2004/0219144等文献中已有描述。
发明内容在第一个方面，本发明提供与人神经生长因子(NGF)特异性结合的完全人抗体及其抗原结合片段，其Kd值为大约5pM或更低，且不与神经营养素_3(NT-3)发生交叉反应。在一个优选的实施方案中，抗NGF抗体或其片段与人NGF结合的KD值为l.OpM或更低。这些抗体的特征是以高亲和力和高特异性与NGF结合，并能够中和NGF的活性。在优选的实施方案中，抗体或其片段与人NGF结合的能力比与大鼠NGF和/或小鼠NGF结合高大约2_10倍。这些抗体可以是全长的(例如IgGl或IgG4抗体)，或可仅包含一个抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可加以修饰以实现某种功能，例如消除残余的效应子功能(Glu可消除残余效应子功能(Reddyetal.(2000)J.Immunol.164=1925-1933)在一个实施方案中，本发明包括一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链可变区(HCVR):SEQIDN0:4，20，36，52，68，84，100，104，108，112，116，132，136，140，156，160，176，180，184，200，204，208，224，228，232，236，240，256，260，264，280，284，288，304，308，312，328，332，336，352，356，360，376，380，384，400，404，420，424，440，456，460，464，480，484，488，504，508，512，528和532，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；较优选的是，抗体或其片段包含SEQ10而108、100或84中所示的110^;更优选的是，其中的110^包含5￡0IDNO:108中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体或其片段进一步包含一个选自下列一组序列的轻链可变区(LCVR):SEQIDNO12,28,44,60,76,92,102,106,110,114,124,134,138,148,158,168,178，182，192，202，206，216，226，230，234，238，248，258，262，272，282，286，296，306，310，320，330，334，344，354，358，368，378，382，392，402，412，422，432，448，458，462，472，482，486，496，506，510，520，530和534，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列。在一个优选的实施方案中，该LCVR为SEQIDN0:110、102或92；更优选的是，该LCVR为SEQIDNO110中所示的氨基酸序列。在一些特定的实施方案中，抗体或其片段包含选自以下一组序列的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对SEQIDNO:4/12，20/28，36/44，52/60，68/76，84/92，100/102，104/106，108/110，112/114，116/124，132/134，136/138，140/148，156/158，160/168，176/178，180/182，184/192，200/202，204/206，208/216，224/226，228/230，232/234，236/238,240/248,256/258,260/262,264/272,280/282,284/286,288/296,304/306,308/310，312/320，328/330，332/334，336/344，352/354，356/358，360/368，376/378，380/382,384/392,400/402,404/412,420/422,424/432,440/448,456/458,460/462,464/472，480/482，484/486，488/496，504/506，508/510，512/520，528/530和532/534。在一个优选的实施方案中，该HCVR/LCVR序列对为SEQIDNO:108/110、100/102或84/92中的一个序列对；更优选的是，SEQIDNO:108/110o在第二个方面，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链CDR3(HCDR3)域SEQIDNO10，26，42，58，74，90，122，146，166，190，214，246，270，294，318，342，366，390，410，430，446，470，494和518，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；以及一个选自下列一组序列的轻链CDR3(LCDR3)域18，34，50，66，82，98，130，154，174，198，222，254，278，302,326,350,374,398,418,438,454,478,502和526，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列。在一个优选的实施方案中，HCDR3/LCDR3序列对为SEQIDNO:90和98、214和222、410和418、430和438或446和454之一；更优选的是，SEQIDNO90和98。在另一个实施方案中，本发明包括一种抗体或其片段，其中还包含一个选自以下序列的重链CDRl(HCDRl)域SEQIDNO:6，22，38，54，70，86，118，142，162，186，210，242，266，290，314，338，362，386，406，426，442，466，490和514，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；一个选自以下序列的重链CDR2(HCDR2)域:SEQIDNO:8，24，40，56，72，88，120，144，164，188，212，244，268，292，316，340，364，388，408，428，444，468，492和516，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；一个选自以下序列的轻链⑶Rl(IXDRl)域SEQIDNO14，30，46，62，78，94，126，150，170，194，218，250，274，298，322，346，370，394，414，434，450，474，498和522，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列；以及一个选自以下序列的轻链⑶R20XDR2)域SEQIDN0=16,32,48,64,80,96,128，152，172，196，220，252，276，300，324，348，372，396，416，436，452，476，500和524，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的基本上相似的序列。在一个优选的实施方案中，该重链和轻链⑶R序列为SEQIDNO=86,88,90,94,96和98；210,212,214,218,220和222；406，408，410，414，416和418；442，444，446，450，452和454；以及426，428，430，434，436和438；更优选的是，该CDR序列为SEQIDNO:86，88，90，94，96和98。在第三个方面，本发明提供了编码抗NGF抗体或其片段的核酸分子。本发明还包括携带本发明核酸的重组表达载体，以及引入这类载体的宿主细胞，并包括在允许产生抗体和收集所产生抗体的条件下通过培养宿主细胞而生产抗体的方法。在一个实施方案中，本发明提供抗体或其片段，其中包含一个由选自下列序列的核酸序列编码的HCVR:SEQIDNO:3，19，35，51，67，83，99，103，107，111，115，131，135，139，155，159，175，179，183，199，203，207，223，227，231，235，239，255，259，263，279，283，287，303，307，311，327，331，335，351，355，359，375，379，383，399，403，419，423，439，455，459，463,479,483,487,503,507,511,527和531，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。更优选的是，该HCVR为SEQIDNO107或99所编码。在一个实施方案中，抗体或其片段进一步包含一个由选自下列序列的核酸序列编码的LCVR:SEQIDNO:11，27，43，59，75，91，101，105，109，113，123，133，137，147，157，167，177，181，191，201，205，215，225，229，233，237，247，257，261，271，281，285，295，305，309，319，329，333，343，353，357，367，377，381，391，401，411，421，431，447，457，461，471，481，485，495，505，509，519，529和533，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；优选的是，该LCVR为SEQIDNO109或101所编码。在一个实施方案中，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的HCDR3域:SEQIDNO:9，25，41，57，73，89，121，145，165，189，213，245，269，293，317，341，365，389，409，429，445，469，493和517，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；以及一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的LCDR3域:SEQIDNO17，33，49，65，81，97，129，153，173，197，221，253，277，301，325，349，373，397，417，437，453，477，501和525，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。在一个优选的实施方案中，HCDR3和LCDR3序列分别为SEQIDNO89和97所编码。在另一个实施方案中，该抗体或其片段还包含一个由选自以下核苷酸序列的序列编码的HCDR1域:SEQIDNO:5，21，37，53，69，85，117，141，161，185，209，241，265，289，313,337,361,385,405,425,441,465,489和513，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；一个由选自以下核苷酸序列的序列编码的HCDR2域SEQIDNO:7，23，39，55，71，87，119，143，163，187，211，243，267，291，315，339，363，387，407，427，443，467，491和515，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；一个由选自以下核苷酸序列的序列编码的LCDR1域SEQIDN013，29，45，61，77，93，125，149，169，193，217，249，273，297，321，345，369，393，413，433，449，473，497和521，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列；以及一个由选自以下核苷酸序列的序列编码的LCDR2域SEQIDNO:15，31，47，63，79，95，127，151，171，195，219，251，275，299，323，347，371，395，415，435，451,475,499和523，或与其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的基本上相同的序列。在一个优选的实施方案中，其中的抗体或其片段包含由SEQIDN0:85、87和89编码的重链CDR序列；以及由SEQIDNO:93、95和97编码的轻链CDR序列。在第四个方面，本发明的特点是一种与人NGF特异性结合的分离的抗体或抗体的抗原结合片段，该抗体或片段包含一个HCDR3和一个IXDR3，其中HCDR3包含结构式为f-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18^MSmi￥^J(SEQIDN0:537)，其中X1为Ala或Ser,X2为Thr或Lys，X3为Glu或lie，X4为Phe或Gly，X5为Val或Gly，X6为Val或Trp,X7为Val或Phe,X8为Thr或Gly,X9为Asn或Lys,X10为Phe或Leu,X11为Asp或Phe，X12为Asn或Ser，X13为Ser或缺失，X14为Tyr或缺失，X15为Gly或缺失，X16为Met或缺失，X17为Asp或缺失，X18为Val或缺失；LCDR3包含结构式为tmmf-f的氨基酸序列(SEQID而540)，其中父1为6111，铲为6111，父3为171~，父4为六卯，父5为六印或Asn,X6为Tyr或Trp,X7为Pro,X8为Tyr或Trp，且X9为Thr。在一个更特殊的实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个结构式为X1—X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的HCDR1序列(SEQIDN0:535)，其中X1为Gly,X2为Phe,X3为Thr或Asn,X4为Phe或Leu,X5为Thr或Asp,X6为Asp或Glu,X7为Tyr或Leu,且X8为Ser或Ala；一个结构式为f-fmfh的HCDR2序列(SEQIDNO:536)，其中X1为lie或Phe，X2为Asp或Ser,X3为Pro或Trp，X4为Glu或Asn，X5为Asp或Ser，X6为Gly,X7为Thr,Glu或Ser，X8为Thr或lie；—个包含结构式为乂工-铲-^-^-^-^-圹-^-^-乂”-乂“-父12-X13_X14_X15_X16_X17_X18的氨基酸序列的HCDR3(SEQIDNO537)，其中X1为Ala或Ser,X2为Thr或Lys，X3为Glu或Ile，X4为Phe或Gly，X5为Val或Gly，X6为Val或Trp，X7为Val或Phe，X8为Thr或Gly，X9为Asn或Lys,X10为Phe或Leu，X11为Asp或Phe，X12为Asn或Ser,X13为Ser或缺失，X14为Tyr或缺失，X15为Gly或缺失，X16为Met或缺失，X17为Asp或缺失，且X18为Val或缺失；一个结构式为f-fm-f的LCDR1序列(SEQIDNO538)，其中X1为Gin或Arg,X2为Ala、Ser或Thr,X3为Val或lie,X4为Arg或Thr,X5为Asn、Phe或Tyr，且X6为Asp或Asn；一个结构式为X:-X2-X3的LCDR2序列(SEQIDNO:539)，其中X1为Gly或Ala，X2为Ala，，且X3为Ser或Phe；以及一个包含结构式为fHf-fHf的氨基酸序列的LCDR3(SEQIDNO:540)，其中X1为Gin,X2为Gin,X3为Tyr,X4为Asn,X5为Arg或Asn,X6为Tyr或Trp,X7为Pro,X8为Tyr或Trp，且X9为Thr。在第五个方面，本发明的特点是一个完全人抗体或抗体片段，经基于PC12细胞的体外分析(如下所述)测量表明，该抗体或片段阻断NGF活性的IC5(I为低于大约lOnM。在一个优选的实施方案中，本发明抗体显示IC5(I为大约500pM或更低；较优选的是IC5(I为大约100pM或更低；大约50pM或更低；或大约25pM或更低。在一个实施方案中，本发明提供一种分离的人抗体或其抗原结合部分，经表面等离子体共振(BIAC0RE)测量表明，该抗体或片段结合NGF的KD为低于大约500pM，优选的是低于大约300pM，更优选的是低于大约100pM，低于大约50pM，低于大约20pM；低于大约10pM，低于大约5pM，或低于大约lpM。在一个优选的实施方案中，本发明的抗NGF抗体或抗体片段与人NGF结合的Kd值为大约0.5pM或更低。在一些优选的实施方案中，其中的抗体或其片段与人NGF结合的亲和力比与大鼠NGF结合的亲和力高1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍，且比与小鼠NGF结合的亲和力高1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。在一个优选的实施方案中，其中的抗体或其片段对人NGF显示高特异性，例如，不8会与密切相关的神经营养素-3(NT-3)发生交叉反应。因此，在一个优选的实施方案中，经表面等离子体共振测量表明，这种高亲和力和高选择性的抗体或其片段对人NGF的Kd为1.OpM或更低，抑制NGF与受体TrkA和p75的结合，且不与人NT-3发生交叉反应。NT-3在这样一些生理过程，如肌肉运动神经元协调中起着关键的作用，因此，不与NT-3发生交叉反应的抗体或抗体片段相对于现有技术中的抗体提供了意想不到的临床和治疗优势。现已证明，在神经性疼痛的CCI模型中，NT-3可防止产生热痛觉过敏(参见如Wilson-Gerwingetal.(2005)JNeuroscience25:758-767)。最近，外源NT-3已被证明可显著地降低在产生神经性疼痛方面起作用的两个钠通道的表达(Wilson-Gerwing&Verge(2006)Neuroscience141=2075-2085)。这些资料表明，NT-3在神经性疼痛方面具有有益的作用。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗NGF抗体。在一些应用中，修饰除去不需要的糖基化位点可能是有用的，或者缺少寡糖链上的岩藻糖部分的抗体，以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shieldetal.(2002)JBC277:26733)。在其他应用中，也可进行半乳糖基化修饰来改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。在第六个方面，本发明的特点是一种含有与NGF特异性结合的重组人抗体或其片段以及一种可接受载体的组合物。在一个相关的方面，本发明的特点是一种由NGF抑制剂和第二治疗剂的组合形成的组合物。在一个实施方案中，该NGF抑制剂为一种抗体或其片段。在一个优选的实施方案中，该第二治疗剂可为任何能够和NGF抑制剂有利组合的适当治疗剂。在第七个方面，本发明的特点是利用本发明的抗NGF抗体或抗体的抗原结合部分抑制人NGF活性的方法。所治疗的疾病是通过消除、抑制或降低NGF的活性而得到改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或症状。更具体地说，本发明通过施用一种NGF抑制剂，如本发明的抗体或抗体片段单独使用，或与第二治疗剂合用，提供了一种治疗NGF介导的病症或疾病的方法，如炎症性疼痛、手术后刀口疼痛、复合性局部疼痛综合征、原发性或转移性骨癌疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、骨质疏松骨折疼痛、烧伤、骨质疏松、痛风关节痛造成的疼痛、与镰刀细胞危象相关的疼痛和其他伤害性疼痛，以及肝细胞癌、乳腺癌和肝硬化。在一些优选的神经性疼痛实施方案中，优选地治疗牵涉性三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢痛、纤维肌痛、反射交感性营养不良和神经疼痛病症。第二治疗剂可为白介素-I(IL-I)抑制齐U，如美国第6，927，044号专利中描述的一种融合蛋白；或一种抗癫痫药物，如伽玛喷丁、普瑞巴林、托吡酯，或一种三环抗忧郁剂，如阿米替林、塞来考昔，一种细胞因子拮抗剂，如一种抗IL-1、IL-6、IL-6R、IL-18或IL-18R的拮抗蛋白或抗体。在一个实施方案中，第二治疗剂为另一种神经营养素，如NT-3。在第八个方面，本发明提供一种如上所述的抗体或抗原结合片段，用于减轻或抑制NGF介导的人的疾病或病症。NGF介导的病症或疾病得到抑制而不会对运动协调造成显著的影响，这种病症或疾病为以下疼痛性疾病之一炎症性疼痛、手术后刀口疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、痛风关节痛、疱疹后神经痛、烧伤疼痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿关节炎疼痛、坐骨神经痛、与镰刀细胞危象有关的疼痛，或疱疹后神经痛。在一个相关的方面，本发明包括如上所述的抗体或抗体的抗原结合片段在制造用于减轻或抑制NGF介导的人类疾病或病症的药物中的应用。通过阅读以下详细叙述，其他目标和优势将变得很明显。详细说明在描述本发明的方法之前，应该理解，本发明并非局限于所描述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语将具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管任何与此处所述的方法和材料类似或等同的方法和材料均可采用，下面说明的是优选的方法和材料。定义本文所用的术语“人神经生长因子”或“NGF”是指具有SEQIDNO1所示核酸序列和SEQIDNO:2所示氨基酸序列的人NGF，或其生物活性片段。本文所用的术语“抗体”意指由四条多肽链即两条重链(H)和两条轻链(L)以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子。每个重链由一个重链可变区(缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区组成。重链恒定区由三个域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由一个轻链可变区(缩写为LCVR或VL)和一个轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个域CL组成。VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着较保守的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列:FRUCDRUFR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”或“抗体片段”)系指一个或多个保留特异性结合一种抗原(如NGF)的能力的抗体片段。现已证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来完成。抗体的“抗原结合部分”这一术语所包含的结合片段的实例包括(i)一个Fab片段，即一个由VL、VH、CL和CHl域组成的单价片段；(ii)一个F(ab')2片段，即一个由在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段组成的二价片段；(iii)一个由VH和CHl域组成的Fd片段；(iv)—个由一个抗体的单臂VL和VH域组成的Fv片段；(ν)—个由VH域组成的dAb片段(Wardetal.(1989)Nature241544-546)；以及一个孤立的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH是由不同的基因编码的，但它们可以通过重组方法，由一个合成的连接体连接在一起成为一个单独的蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Birdetal.(1988)Science242:423-426；和Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879_5883)。这样的单链抗体也被包含在抗体的“抗原结合部分”这一术语的范围以内。其他形式的单链抗体，如双特异抗体(diabody)也包括在内。双特异抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL域表达在一个多肽单链上，但使用一个太短以致不允许同一链上的两个域配对的连接体，从而强迫这两个域与另一个链上的互补域配对并形成两个抗原结合位点(参见如Holligeretal.(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA906444-6448；Poljaketal.(1994)Structure21121-1123)。此外，一种抗体或其抗原结合部分可能为该抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽共价或非共价结合而形成的较大免疫粘附分子的一部分。这类免疫粘附分子的实例包括利用链霉抗生物素的核心区产生的四聚物scFv分子(Kipriyanovetal.(1995)HumanAntibodiesandHybridomas6:93_101)以及利用半胱氨酸残基、一个标记肽和一个C-端多聚组氨酸标签产生的二价生物素标记的scFv分子(Kipriyanovetal.(1994)Mol.Immunol.311047-1058)。抗体部分，如Fab和F(ab')2片段可从整个抗体利用常规技术制备，如对整个抗体分别用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶进行消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可利用本文描述的标准重组DNA技术获得。本文所用的术语“人抗体”意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可能包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如由体外随机或位点特异诱变或体内体细胞突变引入的突变)，如在CDR，尤其是CDR3中。但是，此处所用的术语“人抗体”无意包括得自另外的哺乳动物物种如小鼠的CDR序列植入到人类框架序列上的抗体。本文所用的“重组人抗体”意在包括所有利用重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，如利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体(下面进一步说明)、从一个重组的组合人抗体库分离的抗体(下面进一步说明)、从对于人免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(如小鼠)分离的抗体(参见如Tayloretal.(1992)Nucl.AcidsRes.206287-6295)或用任何其他涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的方法制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体含有得自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是，在有些实施方案中，这些重组人抗体会经受体外诱变(或者，当使用的是人Ig序列转基因的动物时，则经受体内体细胞诱变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列虽然得自或与人种系VH和VL序列有关，却可能并不自然存在于人体内抗体种系库中。本文所用的“分离抗体”意指基本上不含其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如特异性结合NGF的分离抗体就基本上不含能特异结合NGF之外的抗原的抗体)。但是，特异性结合NGF的分离抗体对于其他抗原如来自其他物种的NGF分子可具有交叉反应性。此外，分离抗体可能基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。本文所用的“中和抗体”(或“中和NGF活性的抗体”)意指其与NGF的结合将导致NGF的生物活性被抑制的抗体。这种NGF生物活性的抑制可通过测量NGF生物活性的一个或多个标志，如NGF诱发的细胞活化和NGF与NGF受体的结合来评估。这些NGF生物活性的标志可通过本领域人员熟知的一个或多个标准的体外或体内分析来评估(见下面的实施例)。“⑶R”或互补决定区为一个超变区，其中散布有称为“框架区”的较保守的区域。一组⑶R可定义为一个氨基酸共有序列。本文所用的术语“表面等离子体共振”是指一种光学现象，基于这种光学现象可利用例如BIAC0RE系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N.J.)来检测生物传感器基质中蛋白质浓度的变化，从而对实时生物特异性相互作用进行分析。本文所用的术语“KD”意指特定的抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。本文所用有关编码结合NGF的抗体或抗体部分(如VH，VL,⑶R3)的核酸的术语“分离的核酸分子”意指一个核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码结合NGF以外抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，这些其他序列可能天然出现在人基因组DNA中该核酸的侧翼。因此，例如，本发明编码抗NGF抗体VH区的分离核酸不含有编码其他结合除人NGF以外抗原的VH区的其他序列。术语“表位”包括任何决定簇，优选的是能够特异地结合免疫球蛋白或T-细胞受体的多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇可包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基类或磺酰基类；在某些实施方案中，表位决定簇可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是指抗原中与抗体结合的区域。在一些实施方案中，当抗体在复杂蛋白质和/或大分子混合物中优先识别目标抗原时，则称该抗体特异地结合一个抗原。在一些优选的实施方案中，当抗体与抗原结合的平衡解离常数小于或等于10_8M、更优选的是平衡解离常数小于或等于10_9M、最优选的是解离常数小于或等于ΙΟ,Μ的时候，则该抗体被称为特异地结合该抗原。术语“基本同一性”或“基本相同”当指核酸或其片段时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)最佳比对时，以下述任何公知的序列同一性算法如FASTA、BLAST或GAP测量，至少有大约90%的核苷酸碱基序列相同性，更优选的是至少有大约95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基序列相同性。当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”指两个肽序列用诸如GAP或BESTFIT等程序的默认空位权重达到最佳比对时，两者至少有90%的序列相同性，更优选的是至少有95%、98%或99%的序列相同性。优选的是，不同的残基位置的差别仅在于保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指这样一种取代，即一个氨基酸残基被另一个含有化学性质(例如电荷或疏水性)相似侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般来说，保守的氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别仅在于某些保守取代的情况下，可将序列相似性百分比或程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校正。进行这种调整的方法对熟悉本领域的人员来说是熟知的。参见如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307_331。含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括1)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和6)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸，以及7)含硫侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是缬氨酸_亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸_酪氨酸、赖氨酸_精氨酸、丙氨酸_缬氨酸、谷氨酸_天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gormetetal.(1992)Science256144345中所公开的PAM250对数似然矩阵(PAM250log-likelihoodmatrix)中具有正值的任何变化。“中度保守的”取代是PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。多肽的序列相似性通常用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件是用指定给各种取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其他修饰的相似性程度对相似的序列进行匹配。例如，GCG软件含有诸如“GAP”和“BESTFIT”的程序，这些程序可以使用默认参数，以确定紧密相关的多肽，如来自不同生物物种的同源多肽之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCGVersion6.1。还可以用GCGVersion6.1中的FASTA程序以默认参数或推荐参数来比较多肽序列。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)能提供被查询序列和被搜索序列之间的最佳重迭区域的比对和序列同一性百分数(Pearson(2000)，同上)。当将本发明的序列与含有大量的源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一优选的算法是BLAST计算机程序，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用默认参数。参阅如Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215:403410及Altschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389402。人抗体的制备产生人抗体的方法包括，如VEL0CIMMUNE和XEN0M0USE技术(Greenetal.(1994)NatureGenetics7:13_21)、“微基因座(minilocus)”法以及噬菌体展示。VELOCIMMUNE技术(美国第6，596，541号专利，RegeneronPharmaceuticals)包括产生针对选择的抗原的高特异性完全人抗体的方法。这一技术包括这样一种转基因小鼠的产生该小鼠的基因组包含一些与内源小鼠恒定区基因座有效地连接(operablylinked)的人重链和轻链可变区，使得该小鼠能响应抗原刺激而产生一种包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。将编码该抗体的重链和轻链的可变区的DNA分离出来，并与编码人重链和轻链恒定区的DNA有效地连接。然后在能够表达完全人抗体的细胞中表达该DNA。在具体的实施方案中，该细胞是CHO细胞。抗体可在治疗上用于阻断配体_受体之间的相互作用或抑制受体组分之间的相互作用，而不是通过固定补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)来杀灭细胞，或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来杀灭细胞。因此，抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力是重要的。因此，可根据是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同种型。人免疫球蛋白可以两种与铰链异质性有关的形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包含一种约150-160kDa的稳定四链构建物，其中两个二聚体通过一个重链间的二硫键连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是通过链间二硫键连接在一起，而是形成了一种由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。这两种形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化之后也是如此。第二种形式在各种完整IgG同种型中的出现频率，取决于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单氨基酸取代可将第二种形式(Angaletal.(1993)MolecularImmunology30:105)的出现频度显著地降低到利用人IgGl铰链通常所观察到的水平。本发明包括在铰链区、CH2区或CH3区中含有一个或多个突变的抗体，所述的突变可能是合乎需要的，例如在生产中用于提高所需抗体形式的产率。本发明的抗体优选的制备方法是采用VELOCIMMUNE技术。用所研究的抗原激发内源性免疫球蛋白的重链和轻链可变区被置换为对应的人可变区的转基因小鼠，并从表达抗体的小鼠中收获淋巴细胞(如B-细胞)。淋巴细胞可与一个骨髓瘤细胞系融合来制备永生杂交瘤细胞系，然后对这种杂交瘤细胞系进行筛选，以鉴定出能产生对相关抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可将编码重链和轻链可变区的DNA分离出来，并与合乎需要的重链和轻链的同种型恒定区连接。这种抗体蛋白可在一种细胞如CHO细胞中产生。另夕卜，编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链可变区的DNA可直接从抗原特异的淋巴细胞中分离出来。一般来说，本发明的抗体具有很高的亲和力，当根据其与固定于固相上的抗原或溶液相中的抗原的结合进行测量时，典型情况下Kd为从大约10_9直到大约ICT12M或更高，例如，至少为大约10_9M、至少为大约ΙΟ,Μ、至少为大约10_"Μ或至少为大约10_12Μ。首先，分离包含一个人可变区和一个小鼠恒定区的抗体的高亲和力嵌合抗体。如下所述，根据所需的特征，包括亲和力、选择性、表位等，鉴定和选择抗体。用合乎需要的人恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明的完全人抗体，例如野生型的或经修饰的IgGl或IgG4(例如SEQIDN0:541、542或543)。所选择的恒定区可根据特定的用途而改变，而高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特性则存在于可变区中。表位作图和相关技术为筛选能与特定表位结合的抗体(例如能阻断IgE与其高亲和力受体结合的抗体)，可进行常规的交联-阻断分析，如HarlowandLane(1990，见上)中所述。其他方法包括丙氨酸扫描突变体分析、肽印迹分析(Reineke(2004)MethodsMolBiol248443-63)或肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer(2000)ProteinScience9:487-496)。术语“表位”是指抗原上B细胞和/或T细胞对其作出响应的位点。B细胞表位可由毗连的氨基酸形成，或者由通过蛋白质的三级折叠而并列在一起的非毗连氨基酸形成。由毗连氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常可得以保留，而通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包括至少3个、更经常是至少5个或8-10个以独特空间构象出现的氨基酸。修饰辅助概况分析(Modification-AssistedProfiling，MAP)，也被称为基于抗原结构的抗体概况分析(AntigenStructure-basedAntibodyProfiling，ASAP)，是一种根据每种抗体与经化学或酶学修饰的抗原表面的结合状况的相似性对大量的抗同一抗原的单克隆抗体(mAbs)进行分类的方法(美国专利2004/0101920号)。每一类均可反映与另一类所代表的表位截然不同或部分重叠的独特表位。这种技术可以快速过滤遗传上相同的抗体，从而可使鉴定工作集中在遗传上不同的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP有助于鉴定某些能产生具有所需特性的mAb的罕见杂交瘤克隆。MAP可用来将本发明的抗NGF抗体分类成结合不同表位的抗体组。免疫偶联物本发明包括一种与治疗部分(“免疫偶联物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联的人抗NGF单克隆抗体。细胞毒素包括任何损害细胞的试剂。适宜于形成免疫偶联物的细胞毒素和化疗剂的例子是本领域内周知的。参阅如WO05/103081。双特异性本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的，或多特异性的。多特异性抗体可以针对同一目标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上目标多肽的抗原结合域。参阅，如Tuttetal.(1991)J.Immunol.147:60-69。人抗NGF抗体可连接到另一个功能分子，如另一个肽或蛋白质上，或与之共同表达。例如，一种抗体或其片段可与一种或多种其他分子实体如另一种抗体或抗体片段实现功能性(例如以化学偶联、基因融合、非共价键连接或其他方式)连接，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。治疗给药和制剂本发明提供了一些含有本发明的抗NGF抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。本发明的治疗组合物将与适宜的载体、赋形剂以及其他加入制剂中改善转移、递送、耐受性等的试剂一起施用。在药剂化学师众所周知的处方集里可以找到大量适宜的制剂雷氏药学大全(Remington'sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany,Easton，PA.)。这些制剂包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂(阳离子或阴离子)的泡囊(如LIP0FECTIN)、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水型乳剂、乳胶状碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有聚乙二醇的半固体状混合物。还可参阅Powelletal.CompendiumofExcipientsforParenteralFormulations,PDA(1998)JPharmSciTechnol52:238-311。其剂量可根据即将受药的受试者的年龄和体形大小、目标疾病、病症、给药途径等因素而改变。当本发明的抗体用于治疗与NGF相关的各种病症和疾病，包括炎症性疼痛、神经性和/或伤害性疼痛、肝细胞癌、乳腺癌、肝硬化等时，对于一名成年患者来说经静脉施用本发明的抗体是有利的，通常是按照约0.01至约20mg/kg体重，较佳的是按照约0.02至7、约0.03至约5，或约0.05至约3mg/kg体重，优选的是按照约0.1至约10mg/kg体重，更优选的是按照约0.1至约5mg/kg体重的单一剂量施用。取决于病症的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调节。各种给药系统是周知的，它们可用于本发明的药物组合物的给药，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊中、能表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅例如Wuetal.(1987)J.Biol.Chem.262=4429-4432)0给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉、皮下、经鼻、硬膜外以及经口腔给药。该组合物可以任何方便的途径给药，例如，输注或快速注射，经上皮或皮肤粘膜内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并可与其他生物活性剂一起给药。给药方式可以是全身性或局部性的。该药物组合物也可以微囊尤其是脂质体形式给药(参阅Langerl990Science2491527-1533；Treatetal.(1989)inLiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-BeresteinandFidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365;Lopez-Berestein,ibid.，PP.317-327；一般参阅同上)。在某些情况下，该药物组合物可以一种控制性释放系统给药。在一个实施方案中，可使用一个泵(参见Langer，见上；Sefton(1987)CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料(参阅MedicalApplicationsofControlledRelease,Langerandffise(eds.),CRCPres.,BocaRaton,Florida(1974))。在另一个实施方案中，可在该药物组合物的目标附近放置一个受控释放系统，因此仅需要全身剂量的一部分(参见如Goodson，inMedicalApplicationsofControlledRelease(1984)同上，vol.2，pp.115-138)。其他受控释放系统的讨论见Langer(1990)，Science2491527-1533。可注射制剂可包括静脉注射、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些可注射制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在通常用于注射的无菌水性介质或油性介质中，以此方式制备该可注射制剂。作为注射用的水性介质有例如生理盐水、含葡萄糖和其他助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HC0_50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制备的注射液最好是装入一种适当的安瓿瓶中。有利的是，上述口服或肠胃外使用的药物组合物制备成单位剂量的剂型，以包含一定剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。单位剂量的抗体含量一般为每剂约5至约500mg；对注射剂型，优选的是抗体含量为约5至lOOmg，其他剂型中抗体含量为约10至250mg。单一治疗和组合治疗。本发明提供了一些治疗方法，其中将本发明的抗体或抗体片段用于治疗与各种涉及NGF的疾病有关的疼痛。本发明的抗NGF抗体或抗体片段对于治疗与神经源性、神经性或伤害性疼痛相关的任何病症所造成的疼痛特别有用。在一些优选的神经性疼痛实施方案中，优选治疗牵涉性三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢痛、纤维肌痛、反射交感性营养不良和神经疼痛病症。在其他优选的实施方案中，优选治疗癌症疼痛、尤其是骨癌疼痛、骨关节炎或类风湿关节炎疼痛、下背疼痛、手术后刀口疼痛、骨折疼痛、骨质疏松骨折疼痛、骨质疏松、痛风关节痛、糖尿病性神经病变、坐骨神经痛、与镰刀细胞危象相关的疼痛、偏头痛以及其他神经性和/或伤害性疼痛。其他适应症包括诸如乳腺癌(Adriaenssensetal.(2008)CancerRes68346-51)。在本发明治疗方法的具体实施方案中，患有与痛风有关的关节痛的受试者接受了本发明的抗体或抗体片段以及任选的第二治疗药剂的组合治疗。在一个实施方案中，优选地第二治疗剂为白介素I(IL-I)拮抗剂，如利洛纳塞(rilonac印t)("IL-1抗酒石酸酸性磷酸酶”;Regeneron)。适当的第二治疗药剂可为选自以下的一种或多种药剂利洛纳塞、阿那白滞素(KINERET，Amgen)、人IL-I受体拮抗剂(ILlRa)的重组、非糖基化形式、抗-IL-18药物，如IL-18BP或衍生物、IL-18抗酒石酸酸性磷酸酶、或一种抗体，如抗-IL-18、抗-IL-18R1、抗-IL-18Racp、抗-IL-6和/或抗_IL6Ra抗体。可与NGF抗体或其抗原结合片段结合使用的其他组合治疗，单独使用或与IL-I拮抗剂组合使用，包括低剂量秋水仙碱、阿司匹林或其他NSAID、类固醇，如泼尼松龙、氨甲喋呤，低剂量环孢霉素A、TNF抑制剂，如ENBREL或HUMIRA、其他炎症性抑制剂，如半胱天冬蛋白酶-1的抑制齐IJ、p38、IKK1/2、CTLA-4Ig等、和/或共治疗药物，如尿酸合成抑制剂来抑制尿酸在体内的积聚，如别嘌呤醇、尿酸分泌启动子来加速体内积聚的尿酸的快速分泌，例如，羧苯磺胺、苯磺唑酮和/或苯溴马隆为尿酸分泌启动子的实例；皮质类固醇；以及其他非类固醇抗炎药物(NSAID)，抗癫痫药物，如托吡酯、加巴喷丁、普瑞巴林；塞来考昔；或另一种神经营养素，如NT-3。实施例举出以下实例是为了向本领域一般技术人员就如何准备和利用本发明的方法和组合物提供一个完整的披露和说明并非意在限制发明者视为其发明的范围。已作出许多努力以确保所用数字(如数量、温度等)的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，份数指的是重量份数，分子量指平均分子量，温度指摄氏度，压力指大气压或接近大气压。统计分析是采用带有Bondferroni事后检验和TurkeyHSD事后检验的混合析因ANOVA进行的。实施例1.免疫接种和抗体生成啮齿类动物的免疫可采用本领域任何已知的方法进行(参见如HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual(实验室手册)ColdSpringHarborPress,NewYork；MalikandLillehoj,Antibodytechniques(抗体技术)AcademicPress,SanDiego)。在一个优选的实施方案中，直接对具有编码人Ig重链可变区和κ轻链可变区的DNA基因座的小鼠施用人NGF蛋白(VEL0CIMMUNE，Regeneron；美国第6，596，541号专利)，并用佐剂刺激免疫应答。这样的佐剂包括完全和不完全弗氏佐剂、MPL+TDM佐剂系统(Sigma)，或RIBI(胞壁酰二肽)(参见0，Hagan,VaccineAdjuvant,HumanPress,2000，Totawa,NJ)。这样的佐剂通过将抗原隔离在局部储库中而防止多肽快速分散，可能包含能够刺激宿主免疫应答的因子。在一个实施方案中，NGF是利用宿主细胞蛋白表达机制作为包含NGF基因并表达NGF的DNA质粒间接施用的，以在体内产生抗原多肽。在这两种方法中，为了获得最佳的抗抗原应答，对小鼠每34周给予加强注射，每次注射10天后收集血清样本。利用标准抗原直接结合ELISA方法监测抗体免疫应答。加强后的血清样本经3倍系列稀释后，力口到NGF包被的板上。血清滴度定义为在分析中能产生本底信号两倍的血清样本的稀释度。具有最佳应答的动物在处死前34天通过静脉和腹膜内注射接受最后一次没有佐剂的加强免疫。收获的脾细胞按下述方法处理，以获得抗原特异性的单克隆抗体。实施例2.单克隆抗体的分离在一个实施方案中，将表达抗体的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞涂布在HAT选择下的96孔板上，并让其生长10到20天。按下述方法对得自具有成长中的杂交瘤细胞的孔中的条件培养基进行筛查，检查抗原结合和受体阻断活性。对表达目标抗体的杂交瘤细胞利用流式细胞术进行单细胞亚克隆，并对克隆细胞瘤细胞的VH和VL基因进行克隆和排序。还利用IgG贫化培养基(Invitrogen)从抗原特异性杂交瘤培养物中纯化抗体蛋白质，其特征说明见下。在另一个实施方案中，抗原特异性抗体直接从抗原阳性B细胞中分离而没有利用特定骨髓瘤细胞进行永生化，并产生了一个产生稳定重组抗体的宿主CHO细胞，如USSNl1/809,482(美国专利公开书2007/0280945)所述。实施例3.原始抗原结合和受体阻断筛查为了鉴定产生抗原特异性抗体的杂交瘤，融合后10到20天，从96孔板上采集了条件培养基样本，并利用高通量直接结合ELISA测定了抗原结合特异性。简而言之，即让110和1100倍稀释的条件培养基以IOOng/孔结合到重组NGF蛋白包被的MAXIS0RB板上(Nunc)。结合在板上的抗体利用山羊抗小鼠IgGFcy特异性HRP偶联的多克隆抗体(JacksonImmunoLab)检测。板用TMB物质显影(BDPharmigen)并记录了OD45tlnm光密度。平行进行实验的还有，同样稀释度的样品被加到链霉抗生物素呈递的生物素标记的NGF板上，并检测了结合在板上的抗体。选择对两个板任意一个显示结合活性的孔进行细胞培养扩大并低温保存，包含抗体的上清液则用于进一步分析，以获得特异性、亲和力和功能性概况。除了直接抗原结合筛查之外，还利用功能性筛查来鉴定可分泌带有符合需要的性质的抗体的克隆。用IOOng/孔重组人TrkA-hFc包被1&化0计板并在41放置过夜。让稀释度为12和110的条件培养基在溶液中结合到2ng/ml生物素NGF上1小时，然后转移到TrkA-hFc包被的板上测量结合到板上的生物素NGF。结合到板上的生物素NGF用HRP偶联的链霉抗生物素(Pierce)检测，用TMB物质显影(BDPharmingen)，并记录了光密度。培养基阻止生物素-NGF结合到TrkA-hFc上的杂交瘤被鉴定为可能的阻断剂，并对其进行了进一步特征研究。对96孔条件培养基进行了类似的体外筛查，该培养基得自利用含有从抗原阳性B细胞直接分离的V基因的完全人IgG转染的CHO细胞。此外，还利用抗原包被的LUMINEX珠对NGF的结合活性进行了筛查，利用PE偶联的山羊抗人IgGFcy特异性多克隆抗体检测了珠上的抗原特异性结合抗体。用BIAC0RE对抗原结合抗体进行亲和力测定。简而言之，得自粗培养上清液的抗体被捕获在一个胺偶联的hFc特异性多克隆抗体表面上。监测了单一浓度下抗体的结合。利用一个11双分子相互作用模型来拟合结合传感图，以便利用同样条件下每个抗体相互作用的动态速率常数ka和kd来确定抗原结合的亲和力(Kd)。具体来说，山羊抗人IgGFcy特异性多克隆抗体被共价偶联到CM-5芯片表面，然后注入含抗体的CHO上清液5分钟，速率为1μ1/min,再用缓冲液清洗。注入人NGF(25nM)3分钟，以便让NGF结合到人抗体固定的表面。注入NGF后，立即在表面上以100μ1/min的速率注射缓冲液10分钟，并记录RU信号的衰减。再生表面以除去结合的抗体和NGF，然后用下一个CHO上清液样品重复该循环。实施例4抗原结合亲和力测定人NGF抗体的抗原结合亲和力通过表面动力学利用实时生物传感器表面等离子体共振分析(BIAC0RE)进行测定。抗体被捕获在由捕获抗体直接胺偶联到BIAC0RE芯片上产生的山羊抗人或抗小鼠IgG多克隆抗体表面上。在捕获的抗体表面上注射了各种浓度的人NGF，同时对抗原与抗体的结合以及对结合的复合物的解离进行了实时监测。进行了动力学分析以获得平衡解离常数(Kd)和解离速率常数，后者被用来计算抗原/抗体复合物的解离t1/2(表1)。人源化抗人NGF单克隆抗体E3(“RN624”)(他尼珠(tanezumab)；CAS编号880266-57-9；美国专利公开书2004/0237124)被用作对照。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>NGF与选择的纯化抗体的抗原结合亲和力也通过表面动力学采用上述实时生物传感器表面等离子体共振分析(BIAC0RE)测定。为方便起见，抗体301272-3H10-A10被重新命名为“REGN261”(HCVR/LCVRSEQIDNO:84/92和hlgGlSEQIDNO541)；301272-6E07-D10被重新命名为“REGN263”(HCVR/LCVRSEQIDNO:208/216和hlgGlSEQIDNO:541)。测试的衍生抗体包括REGN472(HCVR/LCVRSEQIDNO100/102和hlgGlSEQIDNO541),REGN474(HCVR/LCVRSEQIDNO100/102和突变的hIgG4SEQIDNO543),REGN475(HCVR/LCVRSEQIDNO:108/110和突变的hIgG4SEQIDNO543)，REGN476(HCVR/LCVRSEQIDNO:224/226和突变的hIgG4SEQIDNO:543)，以及REGN477(HCVR/LCVRSEQIDNO:232/234和突变的hIgG4SEQIDNO543)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例5.对神经营养素_3(ΝΤ-3)的交叉反应性NGF和ΝΤ-3属于神经生长因子家族，是能使特定的神经元群存活的碱性分泌性小蛋白。尽管这两种神经营养素具有一定的氨基酸同一性，但是，它们的生物功能可能不同(Bardeetal.1990ProgGrowthFactorRes2(4):237_48)。检查了抗NGF抗体与人NT-3的结合交叉反应性。简而言之，将山羊抗人IgG多克隆抗体以化学方式连接到CM5芯片上。注射抗NGF单克隆抗体，通过与芯片偶联的多克隆抗体相互作用形成了一个大约50到900RU的固定抗体的表面。在该表面上注射浓度为20nM的NGF或NT-3蛋白质，接着用缓冲液清洗，以便使结合的配体解离。对结合相和解离相都进行了监测，并对数据进行了分析。结果示于表3(NB=未观察到结合活性)。与对照抗体(RN624)相比，所有测试的抗体均未显示可测量的与NT-3的结合，因此表明相对于对照抗体有较高程度的抗原特异性。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>还采用了基于OCTET的溶液竞争分析来测量REGN475和RN624在溶液中竞争结合NT-3、NGF或人脑衍生的神经营养因子(hBDNF)的能力。简而言之，抗体-抗原样品是在30°C下通过各种浓度的NT-3(0到4μM)、hBDNF(0到4μM)或NGF(0到0.2μΜ)与对照抗体RN624(2.5μg/ml)或REGN475(2.5μg/ml)预孵育1小时制备的。将链霉抗生物素高结合FA传感器(HBS，ForteBio，Inc.，CA)与2μg/ml生物素NGF在30°C下孵育lOmin。然后将生物素-NGF结合的传感器与预孵育的抗原-抗体样品一起在30°C下孵育lOmin。孵育后，测量了生物层厚度的变化。将结合标准化为相对于抗体在无竞争情况下的结合的结合百分数。如表4所示，NGF和RN624之间的结合被NT-3以剂量依赖性的方式阻断，而REGN475和NGF之间的结合未被NT-3所阻断。存在hBDNF并不能阻断RN624或REGN475与NGF的结合，而可溶性NGF的存在则几乎完全阻断了RN624和REGN475结合到固定的NGF上。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>还利用BIAC0RE分析评估了选择的纯化人抗NGF抗体REGN472、REGN474、REGN475、REGN476、REGN477或对照抗体RN624与NT-3之间的结合，NT-3的浓度范围为从1.25nM到40nM。尽管对照抗体(RN624)与NT-3结合的Kd为1.InM，所有测试的抗体均未显示对NT-3的任何可测量的亲和力。实施例6.与鼠和大鼠NGF的交叉反应性在氨基酸序列上，人NGF(NGF)与小鼠NGF(mNGF)和大鼠NGF(rNGF)是高度同源的，同一性为大约90%。如上所述，对抗体与mNGF和rNGF的结合亲和力进行了测定。所有抗体对mNGF和rNGF均显示交叉反应性。一组抗体与所有物种的NGF强力结合，Kd值低于IOpM；第二组优先结合NGF，对mNGF和rNGF显示Kd>IOOpM(对照=RN624)(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>还测定了选择的纯化抗NGF抗体与mNGF和rNGF的结合亲和力(表6)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例7.NGF与受体TrkA/hFc和p75/hFc的结合的抑制为了鉴定阻断抗体，利用BIAC0RE3000仪器设计了受体阻断分析。重组人TrkA-hFc和人p75_hFc蛋白经胺偶联到CM5芯片上，密度为大约5000-6000RU。人NGF(IOnM到25nM)被结合到TrkA和p75表面以测定NGF结合的最大RU。然后对表面进行再生，将IOnM到25nMNGF与过量摩尔浓度的各个抗体或可溶受体相混合，并将溶液注射到再生的芯片表面，以确定剩余的游离NGF结合信号。表7显示在抗体或受体存在的情况下，游离NGF结合到TrkA和p75的百分数。在不存在抗体的情况下人NGF的最大RU结合被指定100%的相对值。阳性对照采用RN624、TrkA-hFc和p75_hFc溶液，阴性结合对照采用IgGl对照(AVASTIN;Genentech，CA)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>还利用竞争夹心酶免疫吸附法(ELISA)定量地测量了选择的测试抗体REGN472、REGN474、REGN475、REGN476和REGN477以及对照抗体RN624阻断人NGF结合到人TrkA和P75受体的能力，其中固定浓度NGF溶液中有抗体存在时可防止NGF与包被在微量滴定板上的TrkA-hFc或p75-hFc结合。分析中所用的人NGF为从大肠杆菌产生的重组蛋白，人TrkA-hFc和p75-hFc蛋白为由与人IgGl的Fc部分直列融合的相应受体细胞外域组成的二聚融合蛋白。在室温下，用从1.5pM到1.5nM之间各种含量的抗体溶液滴定固定浓度为50pM、生物素标记的NGF蛋白1小时。通过将生物素-NGF捕获在hTrkA_hFc或hp75_hFc包被的微量滴定板上，接着用链霉抗生物素-HRP检测板结合的生物素标记的NGF来对溶液混合物中未结合的游离生物素-NGF进行定量。具体来说，微量滴定板是在4°C下，通过在板上包被0.5μg/mlhTrkA-hFc或1μg/mlhp75_hFc的PBS缓冲溶液过夜，然后在使用前用0.5%BSA封闭板而制备的。为了测量未结合的生物素-NGF，将预孵育的抗体和生物素-NGF溶液转移到受体包被的板上，并在室温下孵育1小时。利用链霉抗生物素-HRP检测结合在板上的生物素标记的NGF，用比色TMB底物显影，并记录了OD45tlnm光密度。利用raiSMTM(GraphPad,CA)提供的S型剂量-响应模型分析了OD45tlnm值对预结合溶液中REGN475浓度的依赖性。预测的IC5tl值定义为阻断50%的50pM生物素标记NGF与受体包被板的结合所需要的抗体浓度，用来指示抗体阻断NGF结合到hTrkA-hFc或hp75_hFc上的效能。表8显示针对hTrkA-hFc和hp75_hFc测试的每种抗体的IC5tl值。对照mAb=RN624。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>实施例8.对ΝΤ-3与受体TrkA-、TrkB-,TrkC-和p75_hFc结合的抑制还测试了在500nMREGN475、RN624和AVASTIN(IgGl对照)存在的条件下，20nM人NT-3分别与人TrkA-、TrkB-,TrkC-和p75_hFc表面的结合。利用胺偶联程序将人TrkA-hFc(9300RU)、人TrkB-hFc(6000RU)、人TrkC-hFc(9100RU)和人p75_hFc(7500RU)共价偶联到BIACORECM5芯片表面。将20nM人NT-3与500nM对照(IgGl对照AVASTIN)、REGN475、RN624、hTrkA-hFc、TrkB-hFc、TrkC-hFc或p75_hFc在溶液中混合。结合混合物首先在室温下孵育以达到平衡(大约1小时)，然后注射到上述TrkA-hFc、TrkB-hFc、TrkC-hFc和p75_hFc的表面。测定了每个样品中人NT-3结合的水平。每个样品混合物的结合RU按照阴性对照样品(即带有500nMAVASTIN的20nM人NT-3)的RU值标准化，并表示为与Trk表面结合的％(表9)。对ΝΤ-3与受体的结合，REGN475几乎未显示任何干扰，而其余样品则对ΝΤ-3与受体的结合显示显著的阻断。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>实施例9.NGF生物活性的体外中和NGF抗体阻断NGF依赖性和TrkA受体介导的细胞生长活性的能力的研究是利用由编码人TrkA受体的质粒稳定转染的MG87细胞进行的。简而言之，转染的细胞被胰蛋白酶化并以每毫升大约2.5x10s细胞的密度重新悬浮，然后以每孔5，000细胞涂布到96孔组织培养板上。纯化的抗体蛋白质用确定的培养基加0.BSA进行系列稀释，并加到涂布的细胞上，浓度范围为从0到500nM。向孔中加入人NGF，最终浓度为373pM。在一个加湿的5%CO2培养箱中于37°C培养3天后，测量应答。用CCK8试剂盒(Dojindo)测量了细胞生长活性并记录了OD45tlnm光密度。分析了信号对抗体浓度的依赖性并报告了IC5tl值(表10，第2栏)。另外还用大鼠肾上腺髓质细胞系PC12对NGF抗体阻断NGF信号p75和TrkA受体介导的活性的能力进行了体外测量，PC12可内源性表达上面两种受体(Urdialesetal.1998J.Neuroscience18(17):6767_6775)。简而言之，PC12细胞被含有连接到萤光素酶基因的血清应答元件(SRE)的报道质粒稳定转染。转染的细胞以每毫升大约2.5x10s细胞的密度重新悬浮，然后以每孔50，000细胞加到96孔组织培养板上的Opti-MEM培养基中过夜。纯化的抗体蛋白质用培养基(DMEM加0.1%BSA)进行系列稀释，并加到涂布的细胞上，浓度范围为从0到ΙΟΟηΜ。向孔中加入人NGF，最终浓度为12.5pM。将细胞于37°C在一个加湿的7.5%CO2培养箱中培养6小时后，利用BRIGHTGLOW萤光素酶分析系统(Promega)测量了萤光素酶活性。IC5tl值按如上所述的方法测定并报各于表10第3栏中。对照mAb=RN624。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>另外，还利用上述萤光素酶分析方法评估了选择的纯化抗NGF抗体REGN472、REGN474和REGN475以及对照mAbRN624通过PC12细胞系中p75和TrkA受体介导的活性阻断NGF信号的能力(表11)。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>利用上述萤光素酶分析方法评估了抗NGF抗体REGN475和对照抗体通过PC12细胞系中ρ75和TrkA受体介导的活性阻断ΝΤ-3信号的能力，所做的变动是12.5pMNGF换成了75ηΜΝΤ-3。结果表明，对照mAbRN624阻断NT-3信号的IC5tl大约为104.8nM，而在当前的实验条件下，REGN475并不影响ΝΤ-3的信号传递。进一步还研发了测量抗NGF抗体REGN475和RN624通过TrkC在体外中和ΝΤ-3介导的细胞功能的生物分析方法。用一个SRE-萤光素酶报道质粒转染了表达TrkC的工程ΗΕΚ293细胞系。在一个6小时的分析中，ΝΤ-3驱动萤光素酶的表达。利用萤光素酶分析评估了REGN475和RN624通过TrkC受体介导的活性在此工程细胞系中阻断ΝΤ-3信号的能力。将工程ΗΕΚ293细胞系以每孔IxlO4细胞加入到96孔板上的无血清培养基中，并在37°C和5%CO2下培养过夜。浓度范围为1.6μM到28ρΜ的REGN475和RN624与15ρΜΝΤ-3一起预孵育1小时，然后将该混合物加到细胞中。然后在37°C、5%C02下培养细胞6小时。通过加入相等孔体积的BRIGHTGLOW(Promega)测定萤光素酶活性。结果显示，在15pM恒定浓度NGF存在的条件下，RN624抑制NT-3介导的萤光素酶活性的IC5tl值为150_200ηΜ，而REGN475对于ΝΤ-3介导的萤光素酶活性没有抑制作用。实施例10.NGF生物活性的体内中和炎症性疼痛的完全弗氏佐剂(CFA)测试。为了确定抗NGF抗体在一个慢性周围炎症性小鼠模型中是否能够减轻疼痛，在C57BL/6雄性小鼠的后爪皮下注射了完全弗氏佐剂(CFA)，造成热痛觉过敏，并用Hargreaves实验(Torresetal.(2007)Pain130:267-278)对疼痛进行测量。对照小鼠仅接受载体(即PBS)。在小鼠经过3天每天2-3小时适应了Hargreaves装置(336型，IITCLifeScience)之后，将活动强度设置为17%，在该装置中进行测试。采用25秒截止时间以避免组织损伤。对每只小鼠，每天在30分钟时间内获得3个读数，中值潜伏时间用于分析。获得了Hargreaves装置的基线读数之后，在后爪脚掌内注射50%CFA溶液(10mg/20μ1)之前一小时，皮下注射10mg/kg或25mg/kg的测试抗NGF抗体301272-7E05-F6(REGN268)和301272-7G09-E4(REGN270)，以及作为阳性对照的人源化抗NGF抗体(RN624)。CFA注射之后，Hargreaves实验每天重复进行多达4天，计算了爪收回潜伏时间相对于基线的降低％(表12和表13，平均％变化士SEM)。与仅接受载体的动物相比较，对于每种受试的抗体，至少在实验中有一天观察到热痛觉过敏有显著的降低(ρ<0.001-0.05)。测试抗体和对照抗体之间没有统计学差异。表12每组η=7；所有组10mg/kg。表13载体:n=5；对照RN624:n=5，10mg/kg；两个REGN269:n=9)。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>表13<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>手术后伤口疼痛模型。利用一个啮齿动物手术后疼痛模型来研究抗NGF抗体治疗的有效性，该模型中，一个后爪脚掌切口造成对触摸的敏感性增加、保护行为和热痛觉过敏。脚掌切口手术中，C57BL/6小鼠在异氟烷麻醉下接受通过皮肤、筋膜的切口，然后分离下面的屈肌并垂直切为两部分。缝合恢复后，小鼠5天中在Hargreaves试验中接受热痛觉过敏测试，并在负重测试(600型，IITCLifeScience)中接受保护行为测试。在切口前1小时，单次皮下注射载体(η=7)、mAbREGN268(η=7)或对照mAbRN624(η=7)，剂量为10mg/kg(表14，相对于Hargreaves基线的平均百分变化士SEM)。表15显示负重测试的结果(受影响的后肢上平均重量分布百分数士SEM)(每组η=7，对照RN624和REGN268各为10mg/kg)。在两次测试中，与仅接受载体的对照小鼠相比，用测试抗体或对照抗体预治疗显著降低了手术后疼痛(P<0.001-0.05)。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表15<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>为了研究抗NGF抗体是否能够在手术后刀口疼痛模型中减轻形成的疼痛，在手术后的第一天进行了行为研究工作后，对动物腹膜内注射了REGN475(25mg/kg，η=7)、RN624(25mg/kg，n=7)和IgGl对照抗体(25mg/kg，n=7)。热痛觉过敏测试用Hargreaves试验进行，机械异常性疼痛用vonFrey试验进行。在vonFrey试验中，小鼠在一个底部是金属网的装置中每天适应了2-3个小时，共适应4天后进行测试。按照递增的次序通过金属网孔用一系列vonFrey丝线接触有切口的后爪的脚掌表面，进行测试。如果对丝线触动的反应是爪子从平台上举起，则被认为是阳性反应。从最细的丝线开始，用每根vonFrey丝线触动多达5次，直到观察到反应。Hargreaves试验的结果(表16)表明到手术后72小时，REGN475抗体治疗导致热痛觉过敏显著逆转(ρ<0.001-0.01)。RN624治疗的小鼠群未见这种回到基线的情况，而是与IgG对照治疗组行为相似。在vonFrey试验中(脚掌收缩阈值)(g)(表17)，两种抗NGF抗体对机械异常性疼痛都产生了类似的减轻作用(P<0.001-0.05)(IgGl对照=AVASTIN,25mg/kg,η=7；RN624,25mg/kg,η=7；REGN475，25mg/kg，η=7)。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表17<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>第4天，在切口后疼痛模型的行为试验完成后，收集了小鼠的血清并用夹心酶免疫吸附法(ELISA)分析了神经营养素-3(ΝΤ-3)的循环水平。检测极限(40pg/ml)被定义为背景之上两倍标准偏差(2σ)，并用至少5个ΝΤ-3标准定义对浓度曲线的响应。与用REGN475(未检测到=ND,η=7)或IgG对照(AVASTIN;ND，η=7)治疗的小鼠相比，用RN624治疗的小鼠的ΝΤ-3水平(平均值士标准偏差pg/ml，表18)显示出显著的增力口(172士114pg/ml，η=7)。表18<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>为了比较起见，初次接受试验的C57BL/6小鼠在异氟烷麻醉下接受50mg/kg的REGN475、RN624或IgGl对照mAb(AVASTIN)皮下注射，在治疗后第1、7和14天利用夹心ELISA分析了血清中NT-3的水平。检测极限(40pg/ml)被定义为背景之上两倍标准偏差(2σ),并用至少5个NT-3标准定义对浓度曲线的响应。上述手术后切口疼痛模型观察表明，与REGN475(ND，η=6)或IgG对照(ND，η=6)相比，RN624治疗的小鼠的ΝΤ-3水平(表19)升高了(131-199pg/ml，η=6)。表19<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>急性痛风关节痛模型。通过注射尿酸单钠(MSU)晶体到踝部而造成关节疼痛的小鼠模型被用来研究本发明抗体治疗痛风关节炎关节痛的疗效。将无内毒素的MSU晶体(0.5mg/20μ1)注射到C57BL/6小鼠的踝关节内，然后在注射MSU晶体后用Hargreaves试验测试小鼠的脚后跟热痛达三天。Hargreaves试验的适应参数和装置设定如上所述。在MSU晶体注射到踝关节之前1小时，皮下注射测试mAb7E05-F6(REGN268；η=7)、6E07-D10(REGN263；η=7)，或对照的人源化mAb(RN624；η=7)，或载体(η=7)，剂量为10mg/kgo如表20和表21所示，与仅接受载体的对照小鼠相比，测试抗体显著地降低了关节疼痛(P<0.001-0.05)。表20<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表21<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>通过对小鼠注射一种IL-I拮抗剂(IL-Itrap(利洛西普)，Economidesetal.(2003)Nature9:47-52)或秋水仙素进行了抗NGF抗体在急性痛风模型中减轻形成的疼痛的能力的进一步研究。注射MSU晶体到踝关节一天后，对小鼠注射mIL-ltrap(35mg/kg；η=7)、秋水仙素(lmg/kg；η=7)、对照mAbRN624(10mg/kg；η=7)，或载体(η=7)，并如上所述测试热痛觉过敏。另外，另一批小鼠(η=3)接受了mIL-ltrap和对照RN624的联合治疗。在治疗后第2天，与仅用载体治疗(ρ<0.001-0.05)，或单独使用抗抗体治疗(P<0.001)，或单独使用IL-I拮抗剂治疗相比(ρ<0.001)，抗NGF抗体和IL-I拮抗剂的联合治疗显著地减轻了形成的热痛觉过敏(表22)。表22<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>神经性疼痛。对C57BL／6雄性小鼠采用神经性疼痛的部分坐骨神经结扎模型(SeltZer模型)(Malmbergeta1．(1998)Pain76215—222)，其中通过用7一。丝质缝合线在每只小鼠一条大腿的坐骨神经大约l／3到l／2直径处打一个很紧的结产生部分神经损伤。手术后，让小鼠恢复至少两天，然后利用HargreaVeS测试在术后数周内研究小鼠的热疼痛过敏。对照小鼠进行了假手术，该手术中，暴露了坐骨神经并提起，但未结扎。术后，在术后第4天和第7天对小鼠进行试验，以便确认已经产生了热痛觉过敏。手术后第7天，对小鼠皮下注射mAbREGN268(100mg/kg)、IgGl对照(AVASTIN100mg/kg)以及载体。在这一神经损伤模型中，REGN268显著地减轻了形成的热痛觉过敏(表23;p<0.05)。在假手术小鼠中未观察到这种疼痛减轻。结果表达为相对于Hargreaves基线的平均百分变化士SEM(假手术载体，η=3；假手术-100mg/kgIgGl对照(AVASTIN),η=4；假手术-100mg/kgREGN268,η=5；Seltzer-载体，η=5；Seltzer-100mg/kgIgGl对照(AVASTIN),η=5；Seltzer-100mg/kgREGN268,η=8)。表23<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>100mg/kgREGN268,n=7)。表24<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>第三个试验中，用Seltzer模型对另一个抗NGF抗体REGN475的能力进行了测试。Seltzer手术后，在术后第5天和第7天对小鼠进行试验，以便确认已经产生了热痛觉过敏。然后，在手术后第7天，对小鼠皮下或腹膜内注射REGN475(50mg/kg)、对照mAbRN624(50mg/kg)或IgGl对照(AVASTIN)(50mg/kg)。两批小鼠中，无论是皮下注射(表25)还是腹膜内注射(表26)抗NGF抗体，都观察到了显著的疼痛减轻，而对照IgGl未显示任何疼痛减轻效应(P<0.001-0.05)(相对于Hargreaves基线的平均百分变化士SEM；50mg/kgIgGl对照，n=7；50mg/kgRN624,n=7；50mg/kgREGN475,n=7)。表25<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表26<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>为了确定抗体在体内中和人NGF活性的能力，准备了内源小鼠NGF基因座被人NGF基因置换的转基因小鼠。这些小鼠被用于Seltzer神经性疼痛模型来测试REGN268和对照mAb。Seltzer术后，在术后第4天和第8天对小鼠进行试验，以便确认已经产生了热痛觉过敏。然后，在手术后第8天，对小鼠皮下注射50mg/kgmAbREGN268(n=7)、50mg/kg对照RN624(n=8)，或50mg/kgIgGl对照(AVASTIN)(n=6)。结果(表27)表明，REGN268在减轻人源化NGF小鼠的神经性疼痛方面与人源化抗NGF抗体同样有效，而IgGl对照却没有任何减轻疼痛的效应(P<0.05)。表27<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>实施例11.抗NGF对动物运动机能的影响为了研究抗NGF治疗是否能够改变运动机能，评估了初次受试C57BL/6雄性小鼠在旋转测试中的运动协调能力。首先训练动物待在转棒仪上(ColumbusInstruments,3.5cm直径，9cm宽)，旋转速度逐渐加快(最大转速lOrpm)。训练中，小鼠保持在lOrpm的转棒仪上，直到它们能够连续行走60秒，或直到它们连续3天每天在lOrpm的转棒仪上走动了2分钟。训练之后，将每只动物连续3次放在转速为lOrpm的转棒仪上(每次测试之间有一简短间隔)，并记录摔下的潜伏时间。1分钟后，移开动物，如果它们没有摔下来，则记60秒的分数。每只小鼠三次测试的中值分数用于分析。在转棒仪上获得基线读数后，皮下注射50mg/kg或100mg/kg的mAbsREGN475、RN624,或IgG阴性对照。抗体注射后，对小鼠进行长达20天的测试。结果(表28，表达为摔下潜伏时间，单位为秒)(平均值士sem)表明，用RN624而不是用REGN475治疗的小鼠具有显著的运动协调能力损害(p<0.001-0.05)。很有趣的是，据报道，NT-3和TrkC敲除小鼠显示异常运动和姿势，并失去了本体感受(Ernforsetal.(1994)Cell77:503_512；和Kleinetal.(1994)Nature368=249-251)。除了转棒仪外，还对注射抗NGF抗体的首次受试小鼠进行了Hargreaves和vonFrey试验。在施用抗体后20天所进行的Hargreaves和vonFrey试验中，在任何实验组的小鼠中(每组n=6)，均未见任何显著差别。表28<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>实施例12.疱疹后神经痛患者的治疗一位在带状疱疹部位形成了慢性疼痛的患者被诊断为患有疱疹后神经痛。对该患者施用了治疗有效量的包含本发明抗NGFmAb的药学上可接受的组合物进行治疗。药物施用可通过皮下注射或静脉注射，抗NGF抗体的浓度最好在0.1到10mg/kg体重之间。治疗频度可为每1-12周治疗一次，或视需要决定。施用抗NGF抗体组合物后几天内，患者的疼痛达到了实质性减轻。重复施用抗NGFmAb组合物维持了这种疼痛减轻状态。实施例13.骨关节炎疼痛患者的治疗一位因骨关节炎在任何关节造成中度到严重疼痛的患者接受了治疗有效量的包含本发明抗NGFmAb的药学上可接受的组合物的治疗。该组合物可以静脉注射，抗NGF抗体浓度可为10Ug/kg体重到10mg/kg体重之间。治疗频度可为每1-12周治疗一次，或视需要决定。施用抗NGF抗体组合物后几天内，患者的疼痛达到了实质性减轻，受影响的关节重新获得了活动能力。该治疗可视需要重复进行。权利要求一种特异性地结合人神经生长因子(NGF)的人抗体或抗体的抗原结合片段，其KD经表面等离子体共振测量为5pM或更低，其中该抗体或其片段与人NGF结合的KD值比与大鼠和小鼠NGF结合的KD值高大约2倍到大约10倍。2.如权利要求1所述的人抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗体片段包含一个重链互补决定区3(HCDR3)和一个轻链⑶R3(IXDR3)，其中所述HCDR3和IXDR3包含的氨基酸序列分别与SEQIDNO:90和98所列的氨基酸序列至少具有90%的序列同一性。3.如权利要求2所述的人抗体或抗原结合片段，其进一步包含一个HCDR1、HCDR2、LCDRl和LCDR2，其中HCDRl为SEQIDNO:86，HCDR2为SEQIDNO88,LCDRl为SEQIDNO94，且LCDR2为SEQIDNO:96。4.一种特异性结合人神经生长因子(NGF)的人抗体或抗体的抗原结合片段，其Kd为5PM或更低，其中该抗体或其抗原结合片段包含一个重链可变区(HCVR)和一个轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR禾口LCVR为与SEQIDNO108和110或SEQIDNO100禾口102中所列的氨基酸序列至少具有90%序列同一性的氨基酸序列。5.一种以5pM的KD特异性结合人NGF且包含HCDR3和IXDR3的人抗体或抗体的抗原结合片段，其中HCDR3包含结构式为Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-Xii-Xi2-X13-X14-X15-X16-X17-X18的氨基酸序列(SEQID而537)，其中父1为六1￡1或5吐，铲为1111~或1^8，父3为6111或116，X4为Phe或Gly,X5为Val或Gly,X6为Val或Trp,X7为Val或Phe,X8为Thr或Gly,X9为Asn或Lys，X10为Phe或Leu，X11为Asp或Phe，X12为Asn或Ser，X13为Ser或缺失，X14为Tyr或缺失，X15为Gly或缺失，X16为Met或缺失，X17为Asp或缺失，以及X18为Val或缺失；且LCDR3包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQIDN0:540)，其中X1为Gin,X2为Gin,X3为Tyr,X4为Asn,X5为Arg或Asn,X6为Tyr或Trp,X7为Pro,X8为Tyr或Trp，且X9为Thr。6.如权利要求5所述的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段进一步包含HCDRl、HCDR2、LCDRl和LCDR2，其中HCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDN0:535)，其中X1为Gly,X2为Phe,X3为Thr或Asn,X4为Phe或Leu,X5为Thr或Asp,X6为Asp或Glu,X7为Tyr或Leu，且X8为Ser或Ala；HCDR2包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8的氨基酸序列(SEQIDN0:536)，其中X1为Ile或Phe,X2为Asp或Ser,X3为Pro或Trp,X4为Glu或Asn,X5为Asp或Ser,X6为Gly,X7为Thr、Glu或Ser,X8为Thr或Ile；LCDRl包含结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6的氨基酸序列(SEQIDNO:538)，其中X1为Gln或Arg,X2为Ala、Ser或Thr，X3为Val或Ile，X4为Arg或Thr，X5为AsruPhe或Tyr，且X6为Asp或Asn；以及LCDR2包含结构式为X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQIDNO539)，其中X1是Gly或Ala；X2是Ala，且X3是Ser或Phe。7.编码如权利要求1到6中任何一项所述的人抗体或抗原结合片段的核酸分子。8.一种包含如权利要求7所述的核酸分子的表达载体。9.一种产生抗人NGF抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其步骤包括将权利要求8所述的表达载体引入一个分离的宿主细胞，在允许该抗体或抗体片段产生的条件下培养该细胞，和收集所产生的抗体或抗体片段。10.如权利要求8所述的方法，其中宿主细胞为大肠杆菌细胞、CHO细胞或COS细胞。11.一种包含如权利要求1至6中任何一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段以及一种药学上可接受载体的药物组合物。12.如权利要求11所述的药物组合物，其进一步包含选自白介素-I(IL-I)抑制剂、抗癫痫药、细胞因子拮抗剂和另外一种神经营养素的治疗剂。13.如权利要求1至6中任何一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，用于减轻或抑制人的NGF介导的疾病或病症。14.如权利要求11所述的抗体或抗体的抗原结合片段，供与另一种选自白介素-I(IL-I)抑制剂、抗癫痫药、细胞因子拮抗剂和另外一种神经营养素的治疗剂联合使用。15.如权利要求13或14所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述NGF介导的病症或疾病被抑制，而没有显著地损害运动协调。16.如权利要求12到15中任何一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述NGF介导的病症或疾病选自炎症性疼痛、手术后刀口疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、痛风关节痛、疱疹后神经痛、烧伤疼痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿关节炎疼痛、坐骨神经痛、与镰刀细胞危象有关的疼痛，或疱疹后神经痛。17.如权利要求1至6中任何一项所述的抗体或抗体的抗原结合片段在制备用于减轻或抑制NGF介导的人疾病或病症的药物中的用途。18.如权利要求17所述的用途，其中所述NGF介导的病症或疾病被抑制而没有显著损害运动协调。19.如权利要求17所述的用途，其中所述NGF介导的病症或疾病选自炎症性疼痛、手术后刀口疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、痛风关节痛、疱疹后神经痛、烧伤疼痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿关节炎疼痛、坐骨神经痛、与镰刀细胞危象有关的疼痛，或疱疹后神经痛。20.如权利要求17到19中任何一项所述的用途，用于制备与选自白介素-1(IL-I)抑制剂、抗癫痫药、细胞因子拮抗剂和另外一种神经营养素的另一种治疗剂联合使用的药物。21.一种通过抑制NGF能得以抑制、改善或减轻的NGF相关病症或疾病的治疗方法，该方法包括对需要的人类受试者施用第一治疗剂和第二治疗剂，其中第一治疗剂为特异性结合人神经生长因子(NGF)的抗体或抗体的抗原结合片段，表面等离子体共振测得其Kd为5pM，其中该抗体或其片段与人NGF结合的Kd比该抗体或片段与大鼠和小鼠NGF结合的Kd高大约2倍到大约10倍。22.如权利要求21所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段为权利要求1到5中任何一项中的抗体或抗原结合片段。23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述第二治疗剂为一种白介素-I(IL-I)抑制剂、一种抗癫痫药、一种细胞因子拮抗剂或另外一种神经营养素。24.如权利要求21至23中任何一项所述的方法，其中所述NGF介导的病症或疾病被抑制而没有显著损害运动协调。25.如权利要求21到24中任何一项所述的方法，其中所述NGF介导的病症或疾病选自炎症性疼痛、手术后刀口疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、痛风关节痛、疱疹后神经痛、烧伤疼痛、癌症疼痛、骨关节炎或类风湿关节炎疼痛、坐骨神经痛、与镰刀细胞危象有关的疼痛，或疱疹后神经痛。全文摘要一种特异地结合人神经生长因子(NGF)的人抗体或抗原结合片段，其KD为5pM或更低，且不与神经营养素-3(NT-3)发生交叉反应，该抗体或片段与人NGF结合的KD值比与大鼠和小鼠NGF结合的KD值高大约2倍到大约10倍。该抗体在治疗疼痛方面很有用，包括炎症性疼痛、手术后刀口疼痛、神经性疼痛、骨折疼痛、骨质疏松骨折疼痛、疱疹后神经痛、骨关节炎、类风湿关节炎、癌症疼痛、烧伤疼痛、痛风关节痛、以及诸如肝细胞癌、乳腺癌和肝硬化等疾病。文档编号C07K16/22GK101827609SQ200880102743公开日2010年9月8日申请日期2008年8月8日优先权日2007年8月10日发明者J·C·赖恩哈特,J·H·玛丁,L·麦克唐纳德,M·R·摩拉,R·托雷斯申请人:里珍纳龙药品有限公司