刺参体腔细胞内钙离子浓度的检测方法与流程

本发明属于海洋动物细胞成分定量检测技术领域，特别涉及一种刺参体腔细胞内钙离子浓度的荧光检测方法。

背景技术：

钙离子作为一个主要的细胞内信使，参与并调控许多细胞和组织的生理活动，包括新陈代谢、肌肉收缩、分泌以及细胞分裂。在细胞凋亡的分子机制中，钙信号在许多细胞凋亡的分子机制中对生理和细胞活动都起到了重要作用，许多研究证据都表明钙信号参与细胞凋亡的调控。细胞经过严格的控制系统维持钙离子的平衡，一是依赖于细胞质膜的钙泵及钙通道，二是胞内钙库，如线粒体、内质网等，能使细胞内钙例子维持精确与稳定。胞内钙离子稳态在细胞生理过程中占有极其重要的地位，许多细胞是以钙离子作为第二信使传递胞内信息，诱发一系列的细胞形态、生理和分子生物学事件的发生。与细胞的其他生物学现象(如增殖、分化)一样，激发自主死亡程序是通过诱导凋亡的细胞外信号经过细胞内信号的传导。

钙离子作为胞内信号传导重要因子，其稳态失调是细胞凋亡中的一个普遍现象，在细胞凋亡的研究中，kaiser和edelman较早发现，当糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡时，会有钙离子内流增强的现象。lennon等观察到在凋亡晚期时细胞内钙离子浓度的会升高。此外，胞外钙离子螯合剂及细胞内钙离子缓冲剂能抑制许多因素诱发的凋亡，间接证明了钙离子稳态失调在启动细胞凋亡中具有重要作用。

然而，在动物或植物细胞中，钙离子以三种形式存在：1.与细胞结构成分或大分子结合，即结合钙；2.贮存于内质网、液泡、线粒体等胞内钙库中，即贮存钙；3.以离子形式存在于细胞中，即游离钙。细胞中的贮存钙和游离钙是可以相互转换的。在静止状态下，细胞中游离钙的钙离子以一个非常低的浓度存在，大约维持在10^-8～10^-7mol/l。当受到外界刺激时，细胞质中的游离钙会迅速发生变化，使细胞中钙离子的浓度达到10^-5mol/l，这个变化通常发生在毫秒甚至亚毫秒级水平。

刺参体腔内充满了体腔细胞，这些体腔细胞发挥气体交换，营养物质运输及贮存，排泄和免疫防御等作用。研究表明，海洋无脊椎动物体腔细胞作为一种环境胁迫的细胞生物传感器，可以用来评估水生生态系统健康，也可以用来评价水产动物的鲜活程度。文献报道，作为重要的第二信使，刺参体腔细胞内ca²⁺浓度变化参与调控刺参细胞的增殖、分化、矿化、自噬和凋亡等过程，从而影响刺参的生理免疫状况。迄今为止，对刺参体腔细胞内钙离子进行标记的有效方法和技术还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于激光扫描共聚焦显微镜的测定刺参体腔细胞内钙离子浓度的方法。

为达到上述目的，本发明提供了一种刺参体腔细胞内钙离子浓度的检测方法，包括以下步骤：

(1)同时提取随机分组的刺参体腔液，每组刺参数量大于等于5只，所述体腔液中含有体腔细胞；

优选方式下，步骤(1)所述提取刺参体腔液的方法为：剖开刺参腹部，提取出体腔液，采用300目滤布过滤除杂，经过过滤后的刺参体腔液分装于10mlep管中；

(2)将步骤(1)提取出的同一组的刺参体腔液等体积混合，吸取1000μl混合后的刺参体腔液于1.5mlep管中，轻轻吹打混匀使体腔细胞均匀悬浮在体腔液中，吸取10μl刺参体腔液注入到25格x16格的血球计数板中，通过光学显微镜镜下计数，得到刺参体腔细胞起始浓度；依据获得的浓度对刺参体腔液进行稀释制得细胞悬液，使其工作浓度约为10⁶～10⁷cells/ml，将所述细胞悬液置于18℃恒温生长培养箱中待用；

所述稀释采用经高温高压(121℃，30min)杀菌后放置于4℃保存的、不含体腔细胞的刺参体腔液；

本发明使用的是25格x16格的血球计数板，计数公式为：体腔细胞个数/1ml＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数，上述公式根据参考周柬明发表的文章《血球计数板的使用及相关计算》。

本发明对提取的体腔液进行两次分装，充分消除刺参个体差异；体腔液中含有体腔细胞，若体腔液放置一段时间，体腔细胞会发生沉降现象，本发明检测过程中轻轻吹打混匀可以使体腔细胞均匀悬浮在体腔液中。

(3)将已知浓度的细胞悬液与胞内钙离子荧光探针fluo-3am进行荧光探针装载、低温孵育，得到染色体腔细胞液；

优选方式下，向步骤(2)制得的细胞悬液中，加入钙离子荧光探针fluo-3am(上海碧云天生物技术有限公司，s1056)，18～25℃避光暗反应30min～60min，得到染色体腔细胞液；

每500μl所述细胞悬液加入0.5～1.5μl所述钙离子荧光探针，至细胞悬液中钙离子荧光探针的终浓度为0.5～5μm；

本发明所述加入钙离子荧光探针fluo-3am的工作浓度为0.5～5μm，采用的钙离子荧光探针fluo-3am进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成fluo-3，被滞留在细胞内，fluo-3可以和钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光，对钙离子浓度变化的检测更加准确和灵敏。

(4)用激光共聚焦扫描显微镜测定步骤(4)得到的所述孵育后的体腔细胞内钙离子浓度。

优选方式下，步骤(4)中，向步骤(3)制得的染色体腔细胞液中再加入钙离子探针助染剂pluronicf-127(sigma，p2443)，混合均匀，18～25℃避光暗反应15min～30min，激光共聚焦扫描显微镜测定刺参体腔细胞中钙离子浓度；

每500μl所述染色体腔细胞液加入0.5～1.5μl所述钙离子探针助染剂，所述钙离子探针助染剂pluronicf-127的终浓度为0.05～0.15％(g/ml)。

优选方式下，步骤(4)所述激光共聚焦扫描显微镜的参数设置为：物镜objective为40或者63倍油镜，激光管为氩离子激光器，激发波长为488nm，发射波长范围为525nm～530nm，光电倍增管增益gain为500～600，激光扫描强度scanstr为2％～5％，采用xyt扫描程序对细胞进行无损伤连续扫描拍照，在室温、暗黑条件下扫描30min，时间间隔为20s。

步骤(4)中，本发明所述加入的钙离子探针助染剂pluronicf-127先用dmso配制成50％(g/ml)的溶液，使用时加入到上述染色体腔细胞液中至达到工作浓度为0.05～0.15％(g/ml)，采用的钙离子探针助染剂pluronicf-127对细胞相对无毒性，不会改变细胞膜特性，常与染料am酯一起使用，增强染料的水溶性，提高其细胞渗透性。

相比于现有技术，本发明的优势在于：

1、本发明采用激光光源，提高信号的稳定性和特异性；

2、结合共聚焦探测系统，通过步骤(4)专门的光路设计使照明针孔与探测针孔在光路上相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像；与普通显微镜相比，克服了成像模糊的问题；同时，也有效的防止了免疫荧光伪彩的出现，保证了实验结果的可靠性；提高了纵向分辨率，使得“光学切片”成为可能。

3、本发明充分计算机图像分析系统，将信号数字化，便于信号的处理与分析。

综上，本发明方法探索了用18℃低温孵育装载的方法将荧光探针fluo-3am导入刺参体腔细胞中，保证了有足够数量的fluo-3am进入细胞内，以便更准确地反映刺参体腔细胞内钙离子的变化。

附图说明

图1为实施例未经紫外线照射的刺参体腔细胞钙离子荧光成像图。

图2为实施例未经紫外线照射的刺参体腔细胞钙离子荧光强度变化图。

图3为实施例经紫外线(15w/m²)照射20min的刺参体腔细胞钙离子荧光成像图。

图4为实施例经紫外线(15w/m²)照射20min的刺参体腔细胞钙离子荧光强度变化图。

图5为实施例经紫外线(15w/m²)照射30min的刺参体腔细胞钙离子荧光成像图。

图6为实施例经紫外线(15w/m²)照射30min的刺参体腔细胞钙离子荧光强度变化图。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

fluo-3am的化学式为：c51h50cl2n2o23。

结构式为如下式ⅰ所示：

化学名称为：

1-[2-amino-5-(2,7-dichloro-6-hydroxy-3-oxo-9-xanthenyl)phenoxy]-2-(2-amino-5-methylphenoxy)ethane-n,n,n’,n’-tetraaceticacid,pentaacetoxymethylester。

实施例

(1)刺参体腔细胞的提取：

用剪刀沿刺参腹部剪开(断尾)，提取出体腔液，经300目滤布过滤用玻璃棒引流至100ml烧杯中，将体腔液分装于10mlep管中；

(2)制备细胞浓度约为10⁶～10⁷cells/ml的细胞悬液：

提取出的刺参体腔液吸取1000μl于1.5mlep管中，轻轻吹打混匀使体腔细胞均匀悬浮在体腔液中，吸取10μl刺参体腔液注入到25格x16格的血球计数板中，使用光学显微镜进行镜下计数，根据公式：体腔细胞个数/1ml＝80个小方格细胞总数/80×400×10000×稀释倍数，计算体腔细胞起始浓度，用刺参体腔液进行稀释，使其工作浓度约为10⁶～10⁷cells/ml，置于18℃恒温生长培养箱中待用；所述用于稀释的刺参体腔液为经高温高压(121℃，30min)杀菌的放置4℃保存的刺参体腔液；

(3)吸取500μl刺参体腔细胞悬液于1.5mlep管中，先加入0.5～1.5μl的钙离子荧光探针fluo-3am，使其加入钙离子荧光探针fluo-3am的工作浓度为0.5～5μm，室温(18℃～25℃)避光暗反应30min～60min；再加入0.5～1.5μl的钙离子探针助染剂pluronicf-127(sigma，p2443)，使其加入钙离子探针助染剂pluronicf-127的工作浓度为0.05～0.15％(g/ml)，混合均匀，室温(18℃～25℃)避光暗反应15min～30min，激光共聚焦扫描显微镜测定刺参体腔细胞中钙离子浓度；

(4)激光共聚焦扫描显微镜的参数设置为：在低倍镜下找到细胞，转至40或者63倍油镜(objective)下观察，微调至视野内成像清晰。根据所用染料fluo-3am，选择氩离子激光器激发荧光信号，设置激发波长为488nm，发射波长范围为525nm～530nm。先进行粗略扫描，依据扫描成像效果中荧光信号强弱，可调整光电倍增管增益(gain：500～600)、激光扫描强度(scanstr：2％～5％)。再采用xyt扫描程序对细胞进行无损伤连续扫描拍照，在室温、暗黑条件下扫描30min(时间间隔为20s)，采集钙离子荧光成像图；利用相应的软件对钙离子荧光强度进行定量分析。钙离子荧光强度的动态变化，即反应体腔细胞内钙离子浓度的变化。

(5)结果与意义

通过激光扫描共聚焦显微镜检测在不同的紫外线诱导条件下刺参体腔细胞内钙离子浓度的变化为：

(1)未经紫外线照射的刺参体腔细胞内钙离子浓度没有明显的变化(图1和图2)，测得其钙离子荧光值为385.77，如表1所示；

表1

(2)与未经紫外线照射的刺参相比较，其体腔细胞质内钙离子浓度呈现升高的趋势。当照射时间为20min时，其钙离子荧光强度的动态变化呈现出一系列的波动，表明刺参体腔细胞发生了钙离子“瞬时超载”的现象(图3和图4)，测得其钙离子荧光值大约是未经紫外线照射组的1.3倍以上，结果如表2所示；

表2

(3)与未经紫外线照射的刺参相比较，当照射时间为30min时，其钙离子荧光强度显著持续升高，表明刺参体腔细胞发生钙离子“稳态失调”的现象(图5和图6)，测得其钙离子荧光值大约是未经紫外线照射组的1.3倍以上，结果如表3所示；

表3

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。