检测RRM1mRNA相对表达量的方法、试剂盒及引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量的方法：采用实时荧光定量PCR技术，能够对样品中的RRM1mRNA相对表达量进行定量检测；定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量时所使用的引物和探针，其中所述引物和探针包括检测用上下游引物RRM1-F/RRM1-R和探针RRM1-Probe以及看家基因actin上下游引物Actin-F/Actin-R和探针Actin-Probe。本发明还提供一种用于定量检测样品中RRM1mRNA相对表达量的试剂盒。通过计算出该方法所获得的样品RRM1表达量与经过统计学获得的健康人正常基数的比值，获得RRM1mRNA相对表达量，可有效地节约检测时间，提高检测精度。
【专利说明】检测RRMImRNA相对表达量的方法、试剂盒及引物和探针
【技术领域】
[0001]本发明属生命科学和生物【技术领域】，涉及一种定量检测样品中RRMlmRNA相对表达量的方法和试剂盒及其所使用的引物和探针，通过采用实时荧光定量PCR技术，能够对样品中的RRMlmRNA相对表达量进行定量检测。
【背景技术】
[0002]如今，肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。根据病理学分类，确诊的肺癌中约80%_85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。由于缺乏有效的早期诊断手段，初诊时约75%的患者已错过了最佳的手术时机，目前，预测NSCLC患者化疗反应的主要指标还不甚明确，也是目前肺癌研究领域的热点之一。有观点认为，应当引入个体化的分子标志物指标，以实现对NSCLC进行个体化治疗和预测。
[0003]核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase, RR)是DNA合成通路中的限速酶,它能让二磷酸核苷酸转化为二磷酸脱氧核苷酸，而后者是DNA合成和修复所必不可少的原料。因此，RR是细胞存活的关键酶。RR包括2个亚单位:RRMl (ribonucleotide reductaseMl)和RRM2 (ribonucleotide reductase M2)。RRM2含有I个金属结合位点，携带接触抑制区，具有控制底物转化的功能；RRM1含有核苷酸结合位点，控制底物的特异性和整个酶的活性，同时也是核苷类似物的化疗药物的结合位点。作为NSCLC的重要化疗药物，吉西他滨(gemcitabine)隶属于喃唳类抗代谢药物,其作用祀点即为核苷酸还原酶(RR)。吉西他滨通过干扰核苷酸还原酶的功能而减少脱氧核苷酸的产生，最终影响DNA的合成。因此可推测RRMl的表达量可能与吉西他滨耐药性有关。临床结果显示，在身体状况、体质等基本临床因素相似的情况下，个体差异对吉西他滨的化疗疗效仍有着显著影响。近来一些研究表明:当吉西他滨作用于肿瘤细胞时，RRMl的表达量增高会使肿瘤细胞对吉西他滨的耐药性增加。
[0004]在实际应用中，用于检测RRMl表`达的方法主要为免疫组化法，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，判读结果存在较大的主观性，一定程度上限制了该法的应用。正是因为免疫组化法存在这些问题，才促使本发明探索新的方法来检测RRMl表达量。
[0005]实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时在线检测，反应RRMl在组织中的初始含量，从而节约了大量的检测时间，还避免了残留污染的发生。常见的实时荧光定量PCR法有SYBR Green I染料法，双探针杂交法以及Taqman探针法等。其中SYBR Green I由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman探针法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。
[0006]此外，利用结合Taqman探针法的实时荧光PCR技术定量检测待测样品中的RRMl基因表达量，仅仅通过设置看家基因actin作为内参，来计算出待测样品目的基因RRMl表达量与待测样品看家基因actin表达量的比值仍然不足以判断该表达量是否正常。
【发明内容】
[0007]鉴于现有技术中检测RRMl的不足，因此本发明采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于RRMl基因相对表达量(即RRMlmRNA相对表达量)的定量检测。本发明设计了检测看家基因/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测RRMl基因。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发出用于定量检测样品中RRMlmRNA的引物和探针，一种用于检测样品中RRMlmRNA相对表达量的核酸检测试剂盒，一种定量检测中RRMlmRNA相对表达量的方法。
[0008]本发明提供定量检测样品中RRMlmRNA相对表达量的引物和探针,所述引物和探针包括检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRMl-R和探针RRMl-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe ；其中所述引物序列为
[0009]RRMl-F:GATTTCTCTTACAATTACTTC
[0010]RRMl-R:GCCACTTTTCCATTGATCT
[0011 ] RRMl-Probe:FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
[0012]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0013]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0014]Actin-Probe :FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0015]进一步地，所述检测用上下游引物和探针的比例优选为:RRM1-F:RRM1-R:RRMl-Probe的摩尔比为2:2:1。
[0016]进一步地,所述看家基因actin上下游弓丨物和探针的比例优选为:Actin~F:Actin~R:Actin~Probe的摩尔比为2:2:1。
[0017]进一步地，利用所述检测用上下游引物和探针以及所述看家基因actin上下游引物和探针，进行实时PCR扩增，然后计算样品中的RRMlmRNA表达量和actin表达量的比值Fs0
[0018]进一步地，根据所述Fs值计算Fs与Fr的比值F，其中Fr为正常基数。
[0019]进一步地，所述Fr值为0.83。
[0020]本发明还提供一种定量检测样品中RRMlmRNA相对表达量的方法，其特征在于:[0021 ] (I)提取样品中的RNA ；
[0022](2)将(I)提取出的RNA逆转录为cDNA ；
[0023](3)加入⑵中所述的cDNA到反应管中，利用检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRMl-R和探针RRMl-Probe定量检测样品中的RRMl表达量；利用看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe定量检测样品中的actin表达量，其中
[0024]RRMl-F:GATTTCTCTTACAATTACTTC
[0025]RRMl-R:GCCACTTTTCCATTGATCT
[0026]RRMl-Probe:FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
[0027]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0028]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0029]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ；[0030](4)计算Fs值，即所述样品中的RRMl表达量与所述样品中的样品actin表达量的比值；
[0031](5)计算 F 值，F=Fs/Fr，其中 Fr=0.83。
[0032]进一步地，当F>10，判断为相对表达量偏高；F〈3，判断为相对表达量偏低；3 ^ F ^ 10，判断为正常。
[0033]本发明还提供一种定量检测样品中RRMlmRNA相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样品RNA提取液；红细胞裂解液；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix、检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRMl-R和探针RRMl-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe,其中，
[0034]RMl-F:GATTTCTCTTACAATTACTTC
[0035]RRMl-R:GCCACTTTTCCATTGATCT
[0036]RRMl-Probe:FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
[0037]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0038]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0039]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
[0040]利用本发明的引物和探针，将实时荧光PCR技术与Taqman探针结合使用，可以对RRMlmRNA相对表达量进行定量`检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。
[0041]鉴于仅仅通过设置看家基因actin作为内参，来计算出待测样品目的基因RRMl表达量与待测样品看家基因actin表达量的比值Fs仍然不足以判断该表达量是否正常，为此本发明根据临床上作为对照组的健康人样品的大量临床检测结果，利用统计学方法创造性地计算出健康人的正常基数Fr，其中Fr是通过计算1000例作为对照组的健康人样品中的RRMl基因表达量与作为对照组的健康人样品中的看家基因actin表达量的比值然后求这些比值的平均数而计算出来的，其值为0.83，即Fr=0.83，然后计算F值(F=Fs/Fr)。根据对大量RRMl相对表达量偏高的临床样品进行分析，所测得的F值均大于10，因此设定当F>10时，RRMl相对表达量偏高；根据对大量RRMl相对表达量正常的临床样品进行分析，所测得的F值均不小于3且不大于10，因此设定当3 < F < 10时，RRMl相对表达量正常；根据对大量RRMl相对表达量偏低的临床样品进行分析，所测得的F值均小于3，因此设定当F〈3时，RRMl相对表达量偏低。再者，除了根据实时荧光PCR中的Ct值来判断样品是否对药物吉西他滨产生耐药性之外，利用F值也可有助判断这种药物耐药性是否产生。
[0042]此外，正是因为引入了健康人数值作为对照，通过计算出待测样品目的基因RRMl表达量与待测样品看家基因actin表达量的比值Fs与健康人正常基数Fr的比值F (F=Fs/Fr)，这样就可将F值作为一种衡量指标来判定待测者的RRMl相对表达量是否正常，从而能够对待测者的RRMl相对表达量进行全面的评价，并指导后期治疗与用药。这是因为仅仅根据Fs值只能评估待测者体内的RRMl表达量在一段时间内的波动，但是这种表达量本身是否处于正常范围之内，人们无法评判，而且实际中还存在Fs值下降但是待测者体内的RRMl表达量仍然偏高的情形，这时如果根据Fs下降就以为待测者健康状况好转从而停止治疗或者不更换药物而继续使用原有药物，那么就会错过最好的治疗时机，甚至导致病情恶化。但是如果依据F值，就可很好地克服这种Fs值下降但F值仍然偏高的情形。总之，该方法不但能够对待测者体内RRMl基因相对表达量进行检测，同时还能够指导后期治疗方案的确定和药物选择，还可用于辅助临床上NSCLC的早期诊断、早期预防及高危人群的筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1是样品I的阳性检测结果示意图；
[0044]图2是样品2的阴性检测结果示意图；
[0045]图3是样品3的阴性检测结果示意图；
[0046]图4是样品3对应患者服用吉西他滨三个月后的阳性检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0047]实施例1
[0048]用于定量检测样品中RRMlmRNA相对表达量的核酸检测试剂盒，包括:
[0049]红细胞裂解液(TIANGEN)
[0050]样品RNA 提取液:QIAGEN RNeasy FFPE Kit ；
[0051 ]检测体系 PCR 反应液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2 X )、RRMl 上游引物(RRM1-F)、下游引物(RRMl-R)各 0.8 μ Μ、探针(RRMl-probe) 0.4 μ M ;看家基因 actin 上游引物(Actin-F)、下游引物(Actin-R)各 0.8 μ Μ、探针(Actin-probe) 0.4 μ M ;其中，
[0052]RRMl-F:GATTTCTCTTACAATTACTTC
[0053]RRMl-R:GCCACTTTTCCATTGATCT
[0054]RRMl-Probe:FAM-CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT-TAMRA
[0055]Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
[0056]Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
[0057]Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ；
[0058]阳性对照品:含RRMl基因的溶液；
[0059]阴性对照品:不含RRMl基因的溶液；
[0060]空白对照品:生理盐水或不加任何物质。
[0061]实施例2
[0062]本发明试剂盒的使用方法:
[0063](I)抽提石蜡切片中的组织RNA:切去组织或者石蜡切片样品于1.5ml离心管中(刮拭);加入Iml组织透明液,振荡混匀后13000rpm离心Imin ;去除上清加入500ml组织透明液，振荡混匀后13000rpm离心Imin ;去除上清,加入Iml无水乙醇,振荡混匀后13000rpm离心Imin ;去除上清后至于37°C金属浴IOmin (开盖)，直至液体干燥；参考QIAGEN RNeasyFFPE Kit石蜡RNA抽提试剂盒说明书，提取样品RNA。
[0064](2)参考Τ0Υ0Β0公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将(I)中提取得到的样品RNA逆转录为cDNA。
[0065](3)试剂配置:按检 测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul分装:
[0066]X=23ul反应液X (8份看家基因(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+η份样品+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。[0067](4)加样:将2ul步骤(2)中获得的cDNA加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照和阴性对照实验而言，直接加2ul阳性对照品和阴性对照品；对空白对照实验而言，加2ul生理盐水或不加任何物质。
[0068](5)检测:检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，7500 (美国Applied Biosystems 公司)等。反应条件:95°C预变性 Imin ；95°C 15s, 58°C 35sec.40 个循环，突光信号于58°C 35sec.时米集。
[0069](6)结果判断:将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和Ct值自动计算出待测样品中目的基因RRMl的表达量(也被称作浓度，或者表达量)和看家基因actin的表达量(也被称作浓度)。按照以下公式进行计算:
[0070]
【权利要求】
1.定量检测样品中RRMlHiRNA相对表达量的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRMl-R和探针RRMl-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F和看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe ;其中所述引物和探针序列为
RRMl-F:GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRMl-R:GCCACTTTTCCATTGATCT
RRMl-Probe:FAM- CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT -TAMRA
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG_TAMRA。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，RRMl-F:RRMl-R:RRMl-Probe的摩尔比为2:2:1。
3.如权利要求1所述的引物和探针,其特征在于,Actin-F:Actin-R:Actin_Probe的摩尔比为2:2:1。
4.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，利用所述检测用上下游引物和探针以及所述看家基因actin上下游引物和探针，进行实时PCR扩增，然后计算样品中的RRMlmRNA表达量和actin表达量的比值Fs。
5.如权利要求4所述的引物和探针，其特征在于，根据所述Fs值计算Fs与Fr的比值F，其中Fr为正常基数。
6.如权利要求4所述的引物·和探针，其特征在于，所述Fr的值为0.83。
7.一种定量检测样品中RRMl mRNA相对表达量的方法，其特征在于: (1)提取样品中的RNA； (2)将⑴提取出的RNA逆转录为cDNA； (3)加入(2)中所述的cDNA到反应管中，利用检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRMl-R和探针RRMl-Probe定量检测样品中的RRMl表达量；利用看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe定量检测样品中的actin表达量，其中
RRMl-F:GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRMl-R:GCCACTTTTCCATTGATCT
RRMl-Probe:FAM- CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT -TAMRA
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin-Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA ； (4)计算Fs值，即所述样品中的RRMl表达量与所述样品中的样品actin表达量的比值； (5)计算F 值，F=Fs/Fr，其中 Fr=0.83。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，当F>10，判断为相对表达量偏高；F〈3，判断为相对表达量偏低；3 < F < 10，判断为正常。
9.一种定量检测样品中RRMl mRNA相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括样品RNA提取液；红细胞裂解液；检测体系PCR反应液；阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD Probe qPCR Mix、检测用上游引物RRM1-F、下游引物RRMl-R和探针RRMl-Probe以及看家基因actin上游引物Actin-F、看家基因actin下游引物Actin-R和看家基因actin探针Actin-Probe,其中，
RMl-F:GATTTCTCTTACAATTACTTC
RRMl-R:GCCACTTTTCCATTGATCT
RRMl-Probe:FAM- CTTTAAGACGCTAGAGCGGTCTTATTT -TAMRA
Actin-F:TGAGCGAGGCTACAGCTT
Actin-R:TCCTTGATGTCGCGCACGATTT
Actin -Probe:FAM-ACCACCACGGCCGAGCGG-TAMRA?
【文档编号】C12N15/11GK103589786SQ201310459342
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】周晓犊, 陈奕磊, 王淑一, 徐建成 申请人:吉林艾迪康医学检验所有限公司