检测idh1、idh2基因多态突变位点的引物、方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测IDH1、IDH2基因多态突变热点的引物、方法和试剂盒，其中所用引物包括：(ⅰ)扩增IDH1基因包含第132位氨基酸序列的引物；(ⅱ)扩增IDH2基因包含第140、172位氨基酸序列的引物；采用普通PCR技术，可用于快速检测急性粒细胞白血病（AML）患者体内IDH1、IDH2基因多态热点的突变情况。本发明有效地提高自动化程度，省去了以往对于IDH1和IDH2进行全外显子测序的繁琐流程和大量检测费用，有助于快速、准确地诊断患者预后，且费用低。
【专利说明】检测IDH1、IDH2基因多态突变位点的引物、方法和试剂盒
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属生命科学和生物【技术领域】，特别涉及检测IDH1、IDH2基因多态突变热点的引物，采用普通PCR技术，可用于快速检测急性粒细胞白血病(AML)患者体内IDH1、IDH2基因多态位点的突变情况。
[0003]【背景技术】
[0004]造血组细胞的获得性遗传和表观遗传学的改变是急性髓系白血病(AML)的发病因素之一，这些变化改变了造血组细胞的生长、增殖和分化的正常机制。AML发病时骨髓原始细胞隐藏着一种或以上的染色体变异，这些变异不仅是AML的诊断标志，更是评价完全缓解率(CR )，复发风险(RR))及总生存(OS)的指标。然而，国外资料表明，AML的染色体核型异常检出率为60-80%。因此，仍有一大部分AML患者没有发现染色体变异，这组患者所患的疾病为核型正常的AML (CN-AML)，是AML中占比例最多的亚型，按细胞遗传学分析，它们归为预后中等组。
[0005]异柠檬酸脱氢酶(IDH)家族包括以NAD或NADP为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱酸反应生成α-酮戊二酸的酶类，同时分别生成NADH或NADPH。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式:依赖NAD的线粒体IDH，依赖NADP的线粒体IDH，依赖NADP的胞质IDH0编码依赖NADP的人IDH I酶的IDH I基因位于染色体2q33.3，并且定位于细胞质和过氧化物酶体中；编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26.1。尽管IDHl和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制，但IDHl在脂质的代谢机制中起了重要作用。
[0006]近年来，更多的研究发现，IDHl和IDH2突变存在于急性髓系白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、骨髓增殖性疾病(MPD)中，在慢性粒细胞白血病(CML)中尚未检测到突变。文献报道IDH I和IDH2热点突变在CN-AML患者中的发生率分别为5.5-9.6%和
3-11%，并认为具有IDH I和IDH2热点突变的AML患者具有较低的CR，较高的RR和较短的
OS。目前对于IDHl和IDH2的检测主要采用全外显子测序的方法，该方法流程繁琐和检测费用高。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种检测IDH1、IDH2基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测急性粒细胞白血病(AML)患者体内IDH1、IDH2基因多态位点的突变情况。所述检测IDH1、IDH2基因多态热点突变情况的引物，其特征在于，包括:
(i )扩增IDHl基因的引物,其喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA (SEQ N01)IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT (SEQ N02)
(? )扩增IDH2基因的引物，其碱基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT (SEQ N03)
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG (SEQ N04)。
[0008]进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为:
(i )检测IDHl基因的测序引物喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA (SEQ N01)
IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT (SEQ N02)
(ii )检测IDH2基因的测序序列的引物喊基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT (SEQ N03)
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG (SEQ N04)。
[0009]进一步地，引物序列IDH1-132-F和IDH1-132-R是扩增IDHl基因包含第132位氨基酸序列的引物。
[0010]进一步地，引物序列IDH2-140/172-F和IDH2-140/172-R是扩增扩增IDH2基因包含第140、第172位氨基酸序列的引物。
[0011]本发明还提供了检测IDH1、IDH2基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤:
1.抽提血液中的组织DNA;
2.用PCR扩增步骤I中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定IDHl、IDH2基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为:
(i )扩增IDHl基因的引物,其喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGAIDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT(? )扩增IDH2基因的引物，其碱基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTTIDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
[0012]进一步地，测序引物喊基序列为:
(i )检测IDHl基因的测序引物喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGAIDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT(ii )检测IDH2基因的测序序列的引物喊基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTTIDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
[0013]本发明还提供了一种检测IDH1、IDH2基因多态突变位点的试剂盒，包括(i)组织DNA抽提试剂；
(?)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品；其中PCR扩增反应液引物为:
(i )扩增IDHl基因的引物,其喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA
IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT
(? )扩增IDH2基因的引物，其碱基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
[0014]进一步地，测序引物喊基序列为:
(i )检测IDHl基因的测序引物喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA
IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT
(ii )检测IDH2基因的测序序列的引物喊基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
[0015]进一步地，阳性对照品:分别为含有IDHl第132位氨基酸序列和IDH2第140位、172位氨基酸序列的溶液；阴性对照品:无IDHl第132位氨基酸序列和IDH2第140位、172位氨基酸序列的溶液。
[0016]有益效果:本发明设计了扩增IDHl第132位，IDH2第140位、172位氨基酸序列的引物。采用普通PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用PCR技术检测患者IDHl和IDH2突变热点的方法，可有效地提高自动化程度，省去了以往对于IDHl和IDH2进行全外显子测序的繁琐流程和大量检测费用，有助于快速、准确的诊断患者预后，对于临床上急性粒细胞白血病(AML)患者的治疗和用药有极大的指导意义。
[0017]
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1样本I IDHl Rl32测序图谱。
[0019]图2样本2 IDHl R132测序图谱。
[0020]图3样本3 IDHl R132测序图谱。
[0021]图4样本5 IDH2 R140测序图谱。
[0022]图5样本5 IDH2 Rl72测序图谱。
[0023]图6样本6 IDH2 R140测序图谱。
[0024]图7样本6 IDH2 Rl72测序图谱。
[0025]图8样本8 IDH2 R140测序图谱。
[0026]图9样本8 IDH2 Rl72测序图谱。
[0027]
【具体实施方式】
[0028]实施例1下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0029]
一种检测IDH1、IDH2基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对IDHl和IDH2突变热点所设计的特异性扩增引物，包括:
(i )扩增IDHl基因包含第132位氨基酸序列的引物，其碱基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGAIDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT(? )扩增IDH2基因包含第140、第172位氨基酸序列的引物，其碱基序列为:IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTTIDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG一种检测IDHl、IDH2基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i)组织DNA抽提试剂；
(?)检测体系PCR反应液；。
[0030](iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
[0031]其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
[0032]检测体系PCR 扩增反应液包括:10 X PCR Buffer ；2mM dNTPs ；K0D FX DNAPolymerase (IU/μ I);检测IDHl基因第132位氨基酸序列的上、下游引物IDH1-132-F(10 μ m)、IDH1-132-R (IOym);检测IDH2基因第140、172位氨基酸序列的上、下游引物IDH2-140/172-F (10 μ m)、IDH2-140/172-R (10 μ m)。
[0033]测序体系试剂包括:测序纯化液(Exo1:0.6U, CIP: 1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75%乙醇、HIDI (高度去离子甲酰胺)、测序引物:检测IDHl基因第132位氨基酸序列的上、下游引物分别为IDH1-132-F (3.2μπι)、IDH1-132-R (3.2 μ m);检测IDH2基因第140、172位氨基酸序列的上、下游引物分别为IDH2-140/172-F (3.2 μ m)、IDH2-140/172-R(3.2μπι)。
[0034]阳性对照品:分别为含有IDHl第132位氨基酸序列和IDH2第140位、172位氨基酸序列的溶液。
[0035]阴性对照品--无IDHl第132位氨基酸序列和IDH2第140位、172位氨基酸序列的溶液。
[0036]实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程:
(I)抽提血液中的组织DNA: I)抽取500uL血液加入IOOOuL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20 μ I蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200 μ I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200 μ I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000 rpm (13，400 X g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500 μ I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙11),12,000 rpm (13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000 rpm(13，400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500 μ I漂洗液PW，12，000 rpm (13，400X g)离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000 rpm(13,400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000 rpm(13，400Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
[0037](2)试剂配置:按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X μ 1，每人份18 μ I分装:
χ=18 μ I反应液X (η份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照) η为检测标本数。
[0038](3)加样:加入检测体系PCR反应液中2 μ I DNA ;阳性对照和阴性对照直接加2 μ I阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μ I生理盐水或不加任何物质。
[0039](4)扩增:检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti (美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下:
【权利要求】
1.检测IDH1、IDH2基因多态热点突变情况的引物，其特征在于，包括: (i )扩增IDHl基因的引物,其喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA
IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT
(? )扩增IDH2基因的引物，其碱基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为: (i )检测IDHl基因的测序引物喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA
IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT
(ii )检测IDH2基因的测序序列的引物喊基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列IDH1-132-F和IDH1-132-R是扩增IDHl基因包含第132位氨基酸序列的引物。
4.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列IDH2-140/172-F和IDH2-140/172-R是扩增扩增IDH2基因包含第140、第172位氨基酸序列的引物。
5.检测IDHl、IDH2基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤: 抽提血液中的组织DNA ； 用PCR扩增步骤I中提取的DNA ； 对步骤2中的扩增产物进行测序； 对测序结果进行判断，确定IDHl、IDH2基因是否发生突变； 其中PCR扩增引物为: (i )扩增IDHl基因的引物,其喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA
IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT
(? )扩增IDH2基因的引物，其碱基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为: (i )检测IDHl基因的测序引物喊基序列为:
IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGA
IDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT
(ii )检测IDH2基因的测序序列的引物喊基序列为:
IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT
IDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
7.一种检测IDHl、IDH2基因多态突变位点的试剂盒，包括 (i)组织DNA抽提试剂；(ii)检测体系PCR扩增反应液；(iii)测序体系试剂；(iv)阳性对照品和阴性对照品；其中PCR扩增反应液引物为:(i )扩增IDHl基因的引物,其喊基序列为:IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGAIDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT(? )扩增IDH2基因的引物，其碱基序列为:IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTTIDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，测序引物碱基序列为:(i )检测IDHl基因的测序引物喊基序列为:IDH1-132-F: GATGAGAAGAGGGTTGAGGAIDH1-132-R: GTTGGAAATTTCTGGGCCAT`(ii )检测IDH2基因的测序序列的引物喊基序列为:IDH2-140/172-F: CTGTGTTGTTGCTTGGGGTTIDH2-140/172-R: CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照品:分别为含有IDHl第132位氨基酸序列和IDH2第140位、172位氨基酸序列的溶液；阴性对照品--无IDHl第132位氨基酸序列和IDH2第140位、172位氨基酸序列的溶液。
【文档编号】C12N15/11GK103451314SQ201310459219
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】周晓犊, 王淑一 申请人:南京艾迪康医学检验所有限公司