专利名称：全血中c反应蛋白含量测定试剂盒及其测定方法
技术领域：
本发明涉及一种测定血液中反应蛋白含量的试剂盒及测定方法，尤其涉及测定全 血中C反应蛋白含量的试剂盒及其测定方法
背景技术：
C反应蛋白在1930年由Tillet和Francis发现。最初他们观察到一些急性病人 的血清可与肺炎链球菌的荚膜C多糖发生反应，随后证实能与C多糖反应的物质是一种蛋 白质，因而将这种蛋白质命名为C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)。现已证实，CRP是 机体非特异性免疫机制的一部分，它结合C多糖，在Ca2+存在时可结合细胞膜上磷酸胆碱， 激活补体的经典途径，增强白细胞的吞噬作用，调节淋巴细胞或单核/巨噬系统功能，促进 巨噬细胞组织因子的生成。CRP为五聚体蛋白，由五个相同亚单位非共价联接，每个亚单位含206氨基酸，计 算的分子量为23017kDa;因此整个CRP的分子量约118000kDa，蛋白的排列类似另一个急性 期蛋白，淀粉样蛋白P。CRP结构中含结晶样的钙结合环，一亚单位与另一亚单位的钙部位 相连成五聚体结构。此种结构可与磷酸胆碱配体结合，并提供钙结合的构型变化的信息。CRP在体内的功能尚未完全搞清。其基本功能为非特异性防御。在炎症和组织损 伤反应下，CRP在细胞因子IL-6，IL-I β , TNF α的刺激下由肝细胞合成。在钙离子存在下 CRP与许多细菌，真菌或寄生虫的多糖结合，还可以与磷酸酰胆碱，磷脂酸胆碱或核酸结合， 还可与阴离子性鱼精蛋白，肝素发生非钙离子依赖性的结合。最近发现CRP可与各种脂结 构结合，如脂质体，脂蛋白。与脂蛋白结合后通过聚集而进入LDL，VLDL。一旦结合，CRP就 成为补体经典途径的强激活剂，可促进调理作用和对异物的吞噬作用。它是初始免疫反应 最迅速，上升最快的急性期蛋白(半衰期19小时)。组织损伤24-48小时CRP可增高1000 倍以上。现在认为CRP是最有价值的急性时相蛋白，它在健康人血清中浓度很低，当细菌 感染或组织损伤时，其浓度显著升高。其临床应用如下1. CRP作为急性时相蛋白在各种急性炎症、组织损伤、心肌梗塞、手术创伤、放射性 损伤等疾病发作后数小时迅速升高，并有成倍增长之势。病变好转时，又迅速降至正常，其 升高幅度与感染的程度呈正相关。2. CRP与其它炎症因子的相关性CRP与其它炎症因子如白细胞总数、红细胞沉降 率和多形核白细胞等具有密切相关性。3. CRP可用于细菌和病毒感染的鉴别诊断一旦发生炎症，CRP水平即升高，而病 毒性感染CRP大都正常。4.恶性肿瘤患者CRP大都升高。如CRP与AFP的联合检测，可用于肝癌与肝脏良 性疾病的鉴别诊断。CRP测定用于肿瘤的治疗和预后有积极意义。手术前CRP上升，手术后 则下降，且其反应不受放疗、化疗和皮质激素治疗的影响，有助于临床估价肿瘤的进程。5. CRP用于评估急性胰腺炎的严重程度。
6. CRP的含量可以用来预测心血管疾病，作为冠心病等心血管疾病危险性的检测 指标。CRP检测方法主要有免疫比浊法、化学发光等定量检测检测方法和胶体金层析和 胶乳凝集等定性检测方法，这些方法的基本原理是人血清CRP与相应的CRP抗体结合，生成 抗原抗体复合物，并产生浊度，将此浊度与标准曲线对照即可计算出CRP含量。这些方法均 以血清和血浆为检测样品，需采集静脉血，不适于儿童和新生儿以及大面积烧伤的病人等 静脉采血比较困难的病人使用。
发明内容
为了解决现有技术中CRP含量测定以血清和血浆为检测样品，不适合儿童患者尤 其是新生儿以及大面积烧伤病人等静脉采血比较困难的受试者，本发明提供一种全血中C 反应蛋白含量测定试剂盒及其测定方法，该试剂盒和测定方法使用的检测样品可以为末梢 血等全血。本发明的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒包括试剂1和试剂2，试剂1包括表面 活性剂和适量的缓冲液，表面活性剂的含量为0. l-3g/L ；试剂2包括吸附有CRP抗体的聚 苯乙烯胶乳和适量的缓冲液，吸附有CRP抗体的聚苯乙烯胶乳的含量为0. 5-3g/L。所述试剂1中还可加入稳定剂和防腐剂；试剂2中还可以加入稳定剂和防腐剂。所述试剂1中加入的稳定剂含量为0. 5_5g/L，防腐剂含量为0. 05-0. 5g/L ；试剂2 中加入的稳定剂含量为0. 5-5g/L，防腐剂含量为0. 05-0. 5g/L。所述的表面活性剂为曲拉通、吐温，皂素，十六烷基-3-甲基氯化铵，十六烷基氨 基溴化铵，溶血磷脂中的一种或几种的混合物。所述的稳定剂为牛血清白蛋白，鸡蛋清蛋白，多聚氨基酸，脱脂奶粉中的一种或几 种的混合物。本发明还提供一种使用上述试剂盒测定全血中C反应蛋白含量的测定方法，包括 以下步骤A、采集受试者全血样品； B、将全血样品与试剂1混勻，溶解样品中的红细胞；C、将试剂2加入B步骤的溶液中混勻，样品中的C反应蛋白与试剂2中的C反应 蛋白抗体发生抗原/抗体反应，反应体系出现浊度变化；D、测定反应体系在625-800nm的吸光度和散射光强，对照标准曲线计算出C反应
蛋白在全血中的含量。所述试剂1中还可加入稳定剂和防腐剂；试剂2中还可以加入稳定剂和防腐剂。所述试剂1中加入的稳定剂含量为0. 5_5g/L，防腐剂含量为0. 05-0. 5g/L ；试剂2 中加入的稳定剂含量为0. 5-5g/L，防腐剂含量为0. 05-0. 5g/L。所述的表面活性剂为曲拉通、吐温，皂素，十六烷基-3-甲基氯化铵，十六烷基氨 基溴化铵，溶血磷脂中的一种或几种的混合物。所述的稳定剂为牛血清白蛋白，鸡蛋清蛋白，多聚氨基酸，脱脂奶粉中的一种或几 种的混合物。所述的D步骤中测定吸光度和散射光强，是在加入试剂2后20秒和60秒分别测定。本发明的试剂盒和测定方法，可以使用受试者的全血作为测定样品，操作简单，结 果准确。减少了受试者的痛苦，尤其是儿童和新生儿受试者以及大面积烧伤的病人等静脉 采血比较困难的受试者。
图1是采用本发明的试剂盒和测定方法测定全血样品与血清样品的结果比较图
具体实施例方式实施例1 本发明的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1中包括 表面活性剂曲拉通0. lg/L、稳定剂牛血清白蛋白0. 5g/L、防腐剂0. 05g/L和HEPES缓冲液 (100mmol/L,PH7. 4)；试剂2中包括有0. 5g/L吸附有CRP抗体的聚苯乙烯胶乳，稳定剂鸡蛋 清蛋白 0. 5g/L，防腐剂 0. 05g/L 和 PH7. 4 的 HEPES 缓冲液 IOOmmol/L0本发明的全血中C反应蛋白含量测定方法，包括以下步骤A、采集受试者末梢血，为全血样品；B、将全血样品5ul与200ul孵育到37°C的上述试剂1混勻30秒，溶解样品中的红 细胞；C、将200ul平衡至室温的试剂2加入到B步骤中的溶液中混勻，使样品中的C反 应蛋白与试剂2中的C反应蛋白抗体发生抗原/抗体反应，反应体系出现浊度变化；D、在加入试剂2后的20秒和60秒分别测定反应体系在800nm的吸光度和散射光 强，对照标准曲线计算出C反应蛋白在全血中的含量。实施例2 本发明的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1中包括 表面活性剂皂素3g/L、稳定剂多聚氨基酸5g/L、防腐剂0. 5g/L和HEPES缓冲液(IOOmmol/ L，PH7. 4)；试剂2中包括有3g/L吸附有CRP抗体的聚苯乙烯胶乳，稳定剂脱脂奶粉5g/L， 防腐剂 0. 5g/L 和 HEPES 缓冲液(100mmol/L，PH7. 4)。本发明的全血中C反应蛋白含量测定方法，包括以下步骤A、采集受试者的末梢血，为全血样品；B、将全血样品5ul与200ul孵育到37°C的上述试剂1混勻30秒，溶解样品中的红 细胞；C、将200ul平衡至室温的试剂2加入到B步骤中的溶液中混勻，使样品中的C反 应蛋白与试剂2中的C反应蛋白抗体发生抗原/抗体反应，反应体系出现浊度变化；D、在加入试剂2后的20秒和60秒分别测定反应体系在625nm的吸光度和散射光 强，对照标准曲线计算出C反应蛋白在全血中的含量。实施例3 本发明的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1中包括 表面活性剂十六烷基氨基溴化铵lg/L、稳定剂牛血清白蛋白lg/L，稳定剂鸡蛋清蛋白Ig/ L、防腐剂0. lg/L和HEPES缓冲液(lOOmmol/L，PH7. 4)；试剂2中包括有2g/L吸附有CRP抗体的聚苯乙烯胶乳，稳定剂牛血清白蛋白lg/L，防腐剂0. lg/L和HEPES缓冲液(IOOmmol/ L, PH7. 4)。本发明的全血中C反应蛋白含量测定方法，包括以下步骤A、采集受试者的末梢血，为全血样品；B、将全血样品5ul与200ul孵育到37°C的上述试剂1混勻30秒，溶解样品中的红 细胞；C、将200ul平衡至室温的试剂2加入到B步骤中的溶液中混勻，使样品中的C反 应蛋白与试剂2中的C反应蛋白抗体发生抗原/抗体反应，反应体系出现浊度变化；D、在加入试剂2后的20秒和60秒分别测定反应体系在700nm的吸光度和散射光 强，对照标准曲线计算出C反应蛋白在全血中的含量。实施例4本发明的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1中包括 表面活性剂曲拉通lg/L、吐温lg/L、稳定剂多聚氨酸2g/L、防腐剂0. 08g/L和HEPES缓冲 液(lOOmmol/L，PH7. 4)；试剂2中包括有lg/L吸附有CRP抗体的聚苯乙烯胶乳，稳定剂牛 血清白蛋白3g/L,防腐剂0. 08g/L和HEPES缓冲液(100mmol/L, PH7. 4)。本发明的全血中C反应蛋白含量测定方法，包括以下步骤A、采集受试者的末梢血，为全血样品；B、将全血样品5ul与200ul孵育到37°C的上述试剂1混勻30秒，溶解样品中的红 细胞；C、将200ul平衡至室温的试剂2加入到B步骤中的溶液中混勻，使样品中的C反 应蛋白与试剂2中的C反应蛋白抗体发生抗原/抗体反应，反应体系出现浊度变化；D、在加入试剂2后的20秒和60秒分别测定反应体系在650nm的吸光度和散射光 强，对照标准曲线计算出C反应蛋白在全血中的含量。实施例5本发明的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1中 包括表面活性剂溶血磷脂2g/L、稳定剂脱脂奶粉lg/L、防腐剂0. 2g/L和HEPES缓冲液 (lOOmmol/L，PH7. 4)；试剂2中包括有lg/L吸附有CRP抗体的聚苯乙烯胶乳，稳定剂鸡蛋清 蛋白 lg/L,防腐剂 0. 2g/L 和 HEPES 缓冲液(100mmol/L, PH7. 4)。本发明的全血中C反应蛋白含量测定方法，包括以下步骤A、采集受试者的末梢血，为全血样品；B、将全血样品5ul与200ul孵育到37°C的上述试剂1混勻30秒，溶解样品中的红 细胞；C、将200ul平衡至室温的试剂2加入到B步骤中的溶液中混勻，使样品中的C反 应蛋白与试剂2中的C反应蛋白抗体发生抗原/抗体反应，反应体系出现浊度变化；D、在加入试剂2后的20秒和60秒分别测定反应体系在750nm的吸光度和散射光 强，对照标准曲线计算出C反应蛋白在全血中的含量。实施例6使用本发明的试剂盒和测定方法测定的全血中CRP含量与血清中CRP含 量结果比较(血清测定CRP含量使用的也是本发明的试剂盒和方法吗？能确定使用的不 是常规方法吗？按理说，以常规方法做对照给出结果表明本发明的方法的准确性是有保证的。) 见图1，图中横坐标表示血清样品测定结果，纵坐标表示全血样品测定结果，血清 结果由直线表示，全血结果由散点表示。两者测出的CRP含量比较一致，说明本发明的试剂 盒和方法测出的CRP含量值较为准确。
权利要求
一种全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，其特征在于试剂1包括表面活性剂和适量的缓冲液，表面活性剂的含量为0.1 3g/L；试剂2包括吸附有C反应蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳和适量的缓冲液，吸附有C反应蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳的含量为0.5 3g/L。
2.根据权利要求1所述的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，其特征在于所述试剂1 中还可加入稳定剂和防腐剂；试剂2中还可以加入稳定剂和防腐剂。
3.根据权利要求2所述的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，其特征在于所述试剂1 中加入的稳定剂含量为0. 5-5g/L，防腐剂含量为0. 05-0. 5g/L ；试剂2中加入的稳定剂含量 为0. 5-5g/L，防腐剂含量为0. 05-0. 5g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，其特征在于所 述的表面活性剂为曲拉通、吐温，皂素，十六烷基-3-甲基氯化铵，十六烷基氨基溴化铵，溶 血磷脂中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1-3任一项所述的全血中C反应蛋白含量测定试剂盒，其特征在于 所述的稳定剂为牛血清白蛋白，鸡蛋清蛋白，多聚氨基酸，脱脂奶粉中的一种或几种的混合 物。
6.一种使用权利要求1的试剂盒测定全血中C反应蛋白含量的测定方法，包括以下步骤A、采集受试者全血样品；B、将全血样品与试剂1混勻，溶解样品中的红细胞；C、将试剂2加入B步骤的溶液混勻，样品中的C反应蛋白与试剂2中的C反应蛋白抗 体发生抗原/抗体反应，反应体系出现浊度变化；D、测定反应体系在625-800nm的吸光度和散射光强，对照标准曲线计算出C反应蛋白 在全血中的含量。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于所述试剂1中还可加入稳定 剂0. 5-5g/L和防腐剂0. 05-0. 5g/L ；试剂2中还可以加入稳定剂0. 5_5g/L和防腐剂 0.05-0. 5g/L。
8.根据权利要求6或7任一项所述的测定方法，其特征在于所述的表面活性剂为曲拉 通、吐温，皂素，十六烷基-3-甲基氯化铵，十六烷基氨基溴化铵，溶血磷脂中的一种或几种 的混合物。
9.根据权利要求6或7任一项所述的测定方法，其特征在于所述的稳定剂为牛血清白 蛋白，鸡蛋清蛋白，多聚氨基酸，脱脂奶粉中的一种或几种的混合物。
10.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于所述的D步骤中测定吸光度和散射光 强，是在加入试剂2后20秒和60秒时分别测定的。
全文摘要
本发明公开了一种全血中C反应蛋白含量测定试剂盒及其测定方法，试剂盒包括试剂1和试剂2，试剂1包括表面活性剂和适量的缓冲液，表面活性剂的含量为0.1-3g/L；试剂2包括吸附有C反应蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳和适量的缓冲液，吸附有C反应蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳的含量为0.5-3g/L。测定方法的步骤包括采集受试者全血样品，将试剂1与全血样品混匀后，加入试剂2混匀，检测反应体系在625-800nm的吸光度和散射光强，对照标准曲线计算出C反应蛋白在全血中的含量。本发明的试剂盒和测定方法可以使用受试者的全血作为测定样品，操作简单，结果准确。减少了受试者的痛苦，尤其是儿童和新生儿受试者以及大面积烧伤的病人等静脉采血比较困难的受试者。
文档编号G01N33/545GK101907628SQ200910062420
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者马全新 申请人:武汉中太生物技术有限公司