专利名称：血氨含量测定方法及血氨诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％--13％；离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％--4.8％，回收率高。结合我国的具体实际，应以酶法测定为实用。
检索中国专利，仅查出87105593.7号专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的血氨含量的测定方法，同时给出用以实现本发明方法的血氨诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行血氨含量测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定血氨含量的步骤如下1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400-600nm吸光度上升的速度，测算出血氨的含量。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长400-600nm吸光度上升的速度，测算出血氨的含量。
以上样品与试剂的混合比例为按体积1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
本发明应用谷氨酰胺合成酶偶联丙酮酸氧化酶、过氧化物酶等酶偶联反应以及还原型Chromogen组合系统，将无色的还原型Chromogen组合氧化成有颜色的Quioneimine(or Indamine)染料，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映氨含量的大小。这个酶偶联反应系统的优点有它利用将无色的还原型Chromogen组合氧化成有颜色的Quioneimine(or Indamine)染料来反映氨含量，具有灵敏度高、精确度好的优点。
此酶偶联反应系统的需要先将体(血)液中原来含有的磷酸根消灭掉，否则结果会受体(血)液中不等含量的磷酸根的影响。这种消灭内源磷酸根的步骤可以通过调配双、三试剂，让血样先和试剂中第二、第三反应先作用后，再加入谷氨酰胺合成酶启动氨的作用。
用于实现本发明方法的血氨诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--30mmol/l丙酮酸 1--30mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--50000U/l丙酮酸氧化酶1000--50000U/l过氧化氢酶 1000--50000U/l还原型色原体组合0.1--20mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)以上还原型色原体组合可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙(3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrszone简称MBTH)或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒(4-aminoantipyrine)与0.1--20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸(phenol)N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺(N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-m-anisidine简称ESPAS)N，N-双乙基-m-甲苯胺(N，N-Diethyl-m-toluidine)2，4-双氯石碳酸(2，4-Dichloriphenol)2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸(2，4，6-Tribromo-3-hydroxy-
benzenesulfonic acid简称TBHB)3，5-双氯石碳酸磺酸(3，5-Dichlorophenolsulfonic acid)3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸(3，5-Dichloro-2-hydroxy-benzenesulfonicacid简称DHBS)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium简称TOOS)仨溴羟基苯甲酸(Tribromohydroxybenzoic acid)双甲基苯胺(Dimethylaniline简称DMA)N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine简称EHSPT)2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)(2，2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)简称ABTS4-羟基-3-甲氧基苯甲酸(Vanillic acid(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)简称HMB)3-甲基-乙基-羟基苯胺(3-methyl-ethyl-hydroxyaniline简称MEHA)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源磷酸根的污染试剂I缓冲液 40--200mmol/l谷氨酸 1--30mmol/l丙酮酸 1--30mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--50000U/l丙酮酸氧化酶1000--50000U/l过氧化氢酶 1000--50000U/l
还原型色原体组合(一)0.1--20mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
试剂II缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 l--20mmol/l稳定剂 10--50mmol/l还原型色原体组合(二)0.1--20mmol/l还原型色原体组合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四种成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
双剂的配方不仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)及(二)可以互换位置。其中的试剂I的成分，谷氨酸可以放在试剂II，试剂II的成分，腺苷三磷酸可以放在试剂I，腺苷三磷酸及谷氨酸可以都放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源磷酸根污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40--200mmol/l谷氨酸 1--30mmol/l
丙酮酸 1--30mmol/l还原型色原体组合(一)0.1--20mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)还原型色原体组合(一)可以是0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙或0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒二者中之一。
试剂II缓冲液 40--200mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--50000U/l丙酮酸氧化酶1000--50000U/l过氧化氢酶 1000--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l稳定剂 10--50mmol/l还原型色原体组合(二)0.1--20mmol/l还原型色原体组合(二)可以是0.1--20mmol/l以下十四种成分之一石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
三剂的配方不仅限于上述配方，还原型色原体组合(一)及(二)可以分开放在试剂I、II或III的任何位置。其中的试剂I的成分，谷氨酸可以放在试剂II或III，试剂III的成分，腺苷三磷酸可以放在试剂I或II，腺苷三磷酸及谷氨酸可以都放在试剂I或II，试剂II的成分，谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶等也可以放在试剂I中，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是7.0-11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10-80％或者10-50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺、盐或腺苷二磷酸等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明血氨诊断试剂盒较为理想缓冲液 80--120mmol/l腺苷三磷酸 1--5mmol/l谷氨酸 2--10mmol/l丙酮酸 2--10mmol/l谷氨酰胺合成酶 5000--12000U/l丙酮酸氧化酶5000--12000U/l过氧化氢酶 10000--20000U/l还原型色原体组合0.1--6mmol/l
稳定剂 10--50％(总体积)或10--50mmol/l由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源磷酸根的污染，消除内、外源磷酸根的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源磷酸根已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试血氨含量所需要的磷酸根都是产生于血氨的作用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的血氨诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l腺苷三磷酸 1mmol/l谷氨酸 2mmol/l丙酮酸 2mmol/l谷氨酰胺合成酶 5000U/l丙酮酸氧化酶5000U/l过氧化氢酶 10000U/l稳定剂 50％(总体积)4-氨基抗砒 2mmol/l石碳酸 6mmol/l
在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长495-505nm，测试副波长600nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应，检测时间5分钟。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长495-505nm吸光度上升的程度，从而测算出血氨的含量大小。
本实施例应用血氨偶联谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶等酶偶联反应以及还原型色原体组合系统，将无色的还原型色原体组合氧化成有颜色的醌亚胺色原或者吲嗒胺色原，因此测量染料含量的高低(不同染料吸收波长不同，介于400--600nm之间)可以直接反映血氨含量的大小。
实施例二(双剂)本实施例的血氨诊断试剂有缓冲液 100mmol/l谷氨酸 6mmol/l丙酮酸 6mmol/l谷氨酰胺合成酶 10000U/l丙酮酸氧化酶10000U/l过氧化氢酶 15000U/l
稳定剂 50％(总体积)4-氨基抗砒 1mmol/l试剂II缓冲液 100mmol/l腺苷三磷酸 3mmol/l稳定剂 30mmol/l2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 1mmol/l测定血氨含量时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长546nm，测试副波长630nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出血氨的含量大小。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的血氨诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液 120mmol/l谷氨酸 10mmol/l
丙酮酸 10mmol/l稳定剂 50mmol/l3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2mmol/l试剂II缓冲液 120mmol/l谷氨酰胺合成酶 12000U/l丙酮酸氧化酶12000U/l过氧化氢酶 20000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 120mmol/l腺苷三磷酸 5mmol/l双甲基苯胺 2mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长578nm，测试副波长700nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
具体测定步骤为氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长578nm吸光度上升的程度，从而测算出血氨的含量大小。
实施例四本实施例的血氨诊断试剂有试剂I缓冲液 120mmol/l谷氨酸 10mmol/l丙酮酸 10mmol/l谷氨酰胺合成酶 12000U/l丙酮酸氧化酶12000U/l过氧化氢酶 16000U/l稳定剂 50％(总体积)4-氨基抗砒 1mmol/l试剂II缓冲液 120mmol/l腺苷三磷酸 5mmol/l稳定剂 20mmol/l双甲基苯胺 2mmol/l测定5′-核苷酸酶活性时，温度控制在30℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长700nm以上，被测血氨样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长578nm吸光度上升的程度，从而测算出血氨的含量大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种测定血氨含量的方法，步骤如下1)、将样品与主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶、还原型色原体组合组成的试剂混合，使之发生如下反应氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水2)、检测最终反应物在主波长400-600nm吸光度上升的速度，测算出血氨的含量。
2.根据权利要求1所述测定血氨含量的方法，其特征在于所述步骤2)为将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主波长400-600nm吸光度上升的速度，测算出血氨的含量大小。
3.根据权利要求1或2所述测定血氨含量的方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述测定血氨含量的方法，其特征在于被测血氨样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。
5.一种血氨诊断试剂盒，由如下成分组成缓冲液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--30mmol/l丙酮酸 1--30mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--50000U/l丙酮酸氧化酶 1000--50000U/l过氧化氢酶 1000--50000U/l还原型色原体组合 0.1--20mmol/l稳定剂 10--80％(总体积)
6.根据权利要求5所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵、盐或腺苷二磷酸中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围为7.0-11.0，所述缓冲剂为三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂，其特征在于所述还原型色原体为0.1-20mmol/l的3-甲基-2-苯噻唑酮腙与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
10.根据权利要求5或6所述血氨诊断试剂，其特征在于所述还原型色原体组合为由0.1-20mmol/l的4-氨基抗砒与0.1-20mmol/l以下十四种成分之一组合而成石碳酸、N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺、N，N-双乙基-m-甲苯胺、2，4-双氯石碳酸、2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸、3，5-双氯石碳酸磺酸、3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐、仨溴羟基苯甲酸、双甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-硫丙基)-m-甲苯胺、2，2′-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)、4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、3-甲基-乙基-羟基苯胺。
全文摘要
本发明涉及一种测定血氨含量的方法，同时本发明还涉及血氨诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、过氧化氢酶、还原型色原体组合、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况，从而测算出血氨的含量大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号G01N21/31GK1749755SQ20041004196
公开日2006年3月22日 申请日期2004年9月14日 优先权日2004年9月14日
发明者王尔中 申请人:王尔中