专利名称：一种红光检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种红光检测缺血修饰白蛋白(IMA)的试剂盒及其检测方法。 这种试剂盒及其检测方法主要是将病人的生物样品和第一试剂己知过量的二价金 属离子溶液混合，混合液中含有与白蛋白结合的和未与白蛋白结合的金属离子， 然后加入第二试剂pH8-10的金属离子显色剂溶液显色或用IMA测试纸条显色， 在红光640-700nm波长检测金属离子显色剂和未与白蛋白结合的钴、锌、铜离子 生成的蓝色配合物或和镍离子生成的绿色配合物的吸光度或反射光率，其测定值 可诊断病人是否中风状。
背景技术：
缺血通常是由于局部血管狭窄或阻塞导致组织器官的供氧能力下降，临床上 常见的缺血性疾病有脑中风(Stroke)、急性冠状动脉综合症(Acute Coronary Syndrome，ACS)、下肢缺血性血管病变和肺栓塞等。
脑中风是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是严重危害人类健康和生 命安全。我国每年发生中风病人达200多万，发病率高达120/10万，致残率高达 75%，死亡约120万人。脑中风的早期发现对预后极其重要，当前脑中风的主要 诊断手段是CT和核磁共振，但出现影像学的变化至少需要六至八小时，而抢救 的黄金时间是在六小时内，因此迫切需要一种早期预警指标，IMA是目前最有潜 力的脑中风的早期检测指标之一，可用于中风的早期诊断，降低致残率和死亡率。
冠心病是中国人死亡的第二位原因。ACS是以冠状动脉粥样硬化斑块破裂或 糜烂，继发完全或不完全闭塞性血栓形成为病理基础的一组临床综合征；其症状 包括胸痛、上腹部和臂部不适、喘气、恶心和呕吐等；常规心电图检测仅能发现 约50%的患者，容易漏诊；临床目前常用的肌钙蛋白I对于ACS有较高的特异性， 但灵敏度较低，不利于ACS的早期筛査，IMA是目前国际上公认的心肌缺血的早 期检测指标，可用于心肌缺血的诊断，提高对ACS的早期诊断及用于ACS危险 性分级，以降低对非缺血病人的收治率和心血管高危个体的漏诊率，节省医疗资下肢缺血性血管病变主要分为下肢动脉硬化闭塞症和深静脉血栓，目前我国 60岁以上血管病变的发病率高达79.9%，而70岁以上的发病率几乎接近100%。 下肢动脉硬化闭塞症的主要原因为下肢中小动脉狭窄或闭塞引起的供血不足导 致的坏死，主要表现为患者肢端因缺血坏死而发生坏疽，严重者须截肢。下肢深 静脉血栓是由于血凝块堵塞深静脉，导致静脉回流严重受阻，从而使受堵塞的肢 体其远端的肿胀疼痛，是肺栓塞的主要危险因素。据统计，美国每年肺栓塞发病 率约60万，三分之一死亡，占死因第三位。约20 30%患者未及时或未能获诊 断和治疗而死亡，若能及时诊断和给予抗凝治疗，病死率可望降低。因此对下肢 缺血和肺栓塞的早期诊断是十分必要的，但目前除超声、CT等影像学外急需一 种生化检测手段协助临床医师诊断，研究表明IMA对两者有重要的辅助诊断价值。
综上所述，在脑中风、急性冠状动脉综合征、下肢缺血性血管病变和肺栓塞 等缺血性疾病早期诊断方面，IMA是理想的辅助诊断指标。IMA在缺血数分钟内就 可升高，可衡量与缺血组织接触的白蛋白改变程度，IMA在心肌缺血时就升高， 能在缺血缓解后高水平维持数小时，不象其它心肌标志物在坏死时才出现。已知 报道有美国Bar-Or D等(US7， 070， 937, 2006年)发明的IMA检测试剂盒， 其基本原理为正常对照组的样品中白蛋白以活性形式存在，加入过度已知量的 钴离子溶液后，钴离子即可与白蛋白结合，溶液中未结合的钴离子浓度较低；而 缺血病人的样品中含有较多缺血修饰白蛋白，由于IMA与钴离子结合的能力弱， 溶液中就存在较高浓度的未结合的钴离子，采用二硫苏糖醇(DTT)显色剂显色, 检测未与白蛋白结合的钴离子，在450-500nm波长检测样品的吸光度，所得数据 与己知标准IMA曲线进行对照，即可得出IMA值。但是美国Bar-Or D方法在 450-500nm波长检测IMA不能避免蛋白质特别是白蛋白、脂血、血红蛋白和胆红 素等物质的严重干扰，影响灵敏度和特异性，限止了推广使用，因此开发一种新 的IMA检测试剂盒及其检测方法，是临床上迫切需要的。
发明内容
本发明提供一种红光检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法。这种试剂 盒及其检测方法主要是将病人的生物样品和第一试剂己知过量的二价金属离子 钴、锌、铜或镍溶液混合，混合液中含有与白蛋白结合的和未与白蛋白结合的金 属离子，然后加入第二试剂pH8-10的金属离子显色剂溶液显色或用IMA测试纸 条显色，在红光640-700nm波长检测金属离子显色剂和未与白蛋白结合的钴、锌、铜离子形成的蓝色配合物或和镍离子形成的绿色配合物的吸光度或反射光率，其测定值可诊断病人是否有缺血症状。并由于本检测方法能避免样品中千扰物的影响，使测定值更接近真值。
本发明红光检测缺血修饰白蛋白试剂盒是由第一试剂二价金属离子钴、锌、铜或镍溶液(10.00-60.00mg/100ml)和第二试剂由pH8-10氨水-氯化铵缓冲液配制的0.10-3.00 mg/ml金属离子显色剂溶液或用第二试剂显色的IMA测试纸条组成。IMA测试纸条1 (参见图1)的结构包括显色纸块2和作为底层的条状硬质塑料衬垫3，将纸块通过pH8-10氨水-氯化铵缓冲液配制的0.10-3.00 mg/ml金属离子显色剂溶液浸润干燥后制成显色纸块2，然后将显色纸块2粘贴在条状硬质塑料衬垫3上，即成IMA测试纸条1。检测的基本原理为将病人生物样品如全血、血清、血浆、体液或组织液和第一试剂已知过量的二价金属离子溶液混合形成混合液，然后加入第二试剂由氨水-氯化铵缓冲液配制的pH8-10的金属离子显色剂溶液显色，或将所述混合液滴加在IMA测试纸条上显色。正常对照组样品中的白蛋白以活性形式存在，在和第一试剂已知过量的二价金属离子溶液混合后，混合液中未与白蛋白结合的金属离子的数量较少，而心肌缺血病人含有较多的缺血修饰白蛋白，由于IMA与金属离子结合的能力弱，混合液中存在较多数量的未与白蛋白结合的金属离子。第二试剂pH8-10的金属离子显色剂溶液或IMA测试纸条上显色纸块中的金属离子显色剂能和未与白蛋白结合的钴、锌、铜离子形成的蓝色配合物或和镍离子形成的绿色配合物，在红光640-700nm处采用分光光度比色仪检测样品的吸光度或采用反射光率检测仪检测反射光率，所得数值与一已知标准IMA曲线进行对照，即可得到IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。在红光波长检测时，样品中的蛋白质特别是白蛋白、血红蛋白、脂血和胆红素等几乎没有吸收，在此条件下的检测结果是更接近真值。
本发明红光检测缺血修饰白蛋白试剂盒的检测方法，检测IMA方法的步骤如下(参见图2): (1)将病人的生物样品如全血、血清、血浆、体液或组织液和第一试剂已知过量的二价金属离子钴、锌、铜或镍溶液(10.00-60.00mg/100ml)混合，混合液中含有与白蛋白结合的和未与白蛋白结合的金属离子，18-37 °C孵育5分钟；(2)然后加入第二试剂由pH8-10氨水-氯化铵缓冲液配制的0.10-3.00mg/ml金属离子显色剂溶液显色或将混合液滴加在IMA测试纸条上显色，金属离子显色剂和未与白蛋白结合的钴、锌、铜离子生成蓝色配合物或和镍离子生成绿色配合物，18-37 °C孵育5-10分钟；(3)在红光640-700nm波长测定生成的有色配合物的吸光度或反射光率；(4)所得数据与标准曲线相对照，即可得到IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示，以诊断病人是否有缺血症状。
第(1)步中所述二价金属离子是指钴、锌、铜或镍的金属盐离子；所述混合液中除了含有与白蛋白结合的和未与白蛋白结合的金属离子外，还有所有的以自然形式出现的白蛋白、缺血修饰白蛋白、脂血、血红蛋白和胆红素等对本发明IMA
检测方法能避免受其影响的干扰物质。第(2)步中所述金属离子显色剂是
(a) 能和二价钴离子反应生成蓝色配合物的苦胺酸偶氮变色酸(3- (2-羟基-3， 5-二硝基苯)偶氮-4， 5二羟基-2， 7-萘二磺酸，Picramine CA,潘教麦等，《新显色剂及其在光度分析中的应用》，化学工业出版社，2003年，P73)，或吡啶偶氮变色酸(2-(2'-(5-硝基-吡啶)-偶氮)-4， 5 二羟基-2， 7-萘二磺酸，5-N02-PACA，石雪萍等，西北大学学报(自然科学版)2007，Vol.37，No.5，P763-766);
(b) 能和二价铜离子反应生成蓝色配合物的间氯偶氮氨替比林(MCAA，康新平等，新疆医科大学学报2003， Dec., 26(6)， PP552-553 );
(c) 能和二价锌和铜离子反应生成蓝色配合物的1,5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基
甲^(锌离子潘教麦等，《新显色剂及其在光度分析中的应用》，化学工业出版社，2003年，P232;铜离子吴鹏等，理化检验-化学分析分册2004， Vol.40 ， No.9， PP541-545);
(d) 能和二价镍离子反应生成绿色配合物的对硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉(NQAQ，潘教麦等，《新显色剂及其在光度分析中的应用》，化学工业出版社，
2003年，P177)。
第(3)步中采用红光640-700nm波长测定由氨水-氯化铵缓冲液配制的pH8-10的金属离子显色剂或IMA测试纸条上显色纸块2中的金属离子显色剂能和未与白蛋白结合的钴、锌、铜离子生成的蓝色配合物或和镍离子生成的绿色配合物的吸光度或反射光率，样品中未和白蛋白结合的金属离子的量和吸光度值成正比，但和反射光率成反比。在这样的测定条件下能避免样品中白蛋白、缺血修饰白蛋白、脂血、血红蛋白和胆红素等物质对IMA检测的干扰。
现有生化试剂所用显色剂，大都发明于上世纪二三十年代，比色波长集中在340-600nm范围。1993年美国印地安那大学MR Glick和KW Ryde己发表文章呼吁要重视来自溶血、黄疸和脂血标本引起的生化检测结果不正确(KW Ryder andMRGlick， Clin.Chem.， Jan 1993; 39: 175 — 176)。正如美国Bar-Or D等的IMA
检测试剂盒采用二硫苏糖醇为显色剂，以青蓝光450-500nm波长检测未与白蛋白结合的钴离子，显色产物为棕色，不能避免常见的生化检测的干扰物质如脂血、血红蛋白、胆红素引起的背景干扰(参见图3)。除此以外各种形式的白蛋白，包含所有的以自然形式出现的白蛋白，白蛋白-金属复合物和缺血修饰白蛋白也会对IMA检测形成干扰，降低IMA检测的灵敏度和特异性(中国专利CN101013137A )。美国希曼国际公司(Synermed International Inc.)在其网页上(http:〃www.svnermedinc.com/revolution.php)介绍当样品在640-800nm波长比色时，样品中的蛋白质特别是白蛋白、血红蛋白、胆红素等几乎没有被吸收，脂质颗粒和潜伏性混浊(如甘油三脂等)不会导致入射光的散射和折射，在此条件下的比色结果理论上更接近真值。在红光或近红外光640-800nm波长检测其显色产物须呈蓝色或绿色，但现有技术中采用的DTT显色产物为棕色，不具备在640-800nm波长比色的条件。本发明采用的金属离子显色剂在碱性特别是在氨性的条件下在红光640-700nm波长有最大吸收峰或互补的最小反射光率，检测该金属离子显色剂和未与白蛋白结合的钴、锌、铜离子生成的蓝色配合物或和镍离子生成的绿色配合物的吸光度或反射光率，颜色强度可反映未与白蛋白结合的金属离子的数量。本发明由于选择在红光640-700nm波长检测(参见图3和美国希曼国际公司的网页)，避免了样品中如脂血、白蛋白、血红蛋白、胆红素等干扰物的影响，使比色结果更接近真值。
第(4)步中所述标准曲线是以缺血和对照组样品建立的动力学曲线为依据。使用本发明红光检测缺血修饰白蛋白的试剂盒检测IMA时，应使用试剂盒附件提供的校准品和质控品建立标准曲线和用于日常的质量控制。本发明使用性能稳定的化学试剂金属离子螯合剂EDTA钠(乙二胺四乙酸钠)替代样品血清或白蛋白作量值转移建立校准品和质控品。将不同浓度的EDTA钠和第一试剂已知过量的二价金属离子溶液混合，后续的检测与样品血清的测试完全一样，但在红光640-700nm波长检测的是金属离子显色剂和未与EDTA钠结合的钴、锌、铜离子生成的蓝色配合物或和镍离子生成的绿色配合物。用户可在各种类型的分光光度比色仪、大中小型全自动生化分析仪或反射光率检测仪上将本发明IMA检测试剂盒所测得的校准品数据和标示的IMA单位，绘制标准曲线，用于病人样品的IMA结果的计算；IMA质控品分为低、中和高值三种，其标示的IMA数值是一个范 围，如应用本发明试剂盒所测得数值在该质控品所标示的范围内，就说明整个检 测系统操作正常。
本发明IMA试剂盒在碱性特别是在氨性条件下采用红光波长检测未和白蛋白 结合的钴、锌、铜离子生成的蓝色配合物或和镍离子生成的绿色配合物的吸光度 或反射光率，所得数值大小可诊断病人是否有缺血症状。脑中风的早期诊断对于 治疗方案的制定和愈后是极其重要的，而CT和核磁共振需要六至八小时后才能 出现影像学的变化，临床也可用腰椎穿刺来作鉴别诊断，但需要一定的技术条件， 目前还没有适合脑中风早期诊断的试剂，而IMA在中风发作后5—10分钟血中浓 度即可升高，可结合临床症状做出早期诊断。早期胸痛病人半数以上的患者无明 显症状和体征，心肌损伤标志物多为阴性，ECG无显著变化，处于ACS诊断的 "灰带"，而IMA与传统的心肌坏死指标不同，在缺血发作后5—10分钟血中浓 度即可升高，IMA的测定有利于ACS早期诊断，还可结合心肌钙蛋白指标用于 ACS的筛查和危险性分级；作出是否留院的决定。磁共振血管造影(MRA)是下 肢缺血性血管病变理想的检查手段，但不能作为一个普查手段，而IMA在下肢缺 血的早期浓度即可升高，可用作严重缺血性血管病变的早期筛查，因而有利于早 期诊治。核素肺通气/灌注扫描和肺动脉造影是诊断肺栓塞的灵敏或特异的检查手 段，但这些技术需要一定的设备条件，IMA测定可用于肺栓塞的早期诊断。 本发明红光检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法的优点
(1) 开发了一种适合床边诊断的快速检测IMA方法
脑中风、ACS、下肢缺血性血管病变和肺栓塞等疾病病情险恶，需要快速作出 诊断以利于赢得宝贵的时间及时治疗。本发明可方便地使用全血检测，步骤简单， 试剂盒是由第一试剂二价金属离子溶液，和将互相不会发生化学反应的碱性特别 是氨性缓冲液和显色剂溶液合二为一的第二试剂或用第二试剂显色的IMA测试 纸条组成，反应时间短，仅需要15分钟左右的时间。利用一般医院的常规设备， 在全自动生化分析仪、小型的分光光度比色仪或反射光率检测仪上都可完成测试， 为临床开发了一种快速检测IMA的方法。
(2) 避免样品中干扰物的影响，为临床诊断提供有力的依据 本发明是一种检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法，选择在碱性特别
是氨性条件下采用红光640-700nm波长检测金属离子显色剂和钴、锌、铜离子生成的蓝色配合物或和镍离子生成的绿色配合物的吸光度，被测样品中的蛋白质特 别是白蛋白、血红蛋白、胆红素等几乎没有干扰，脂质颗粒和潜伏性混浊(如甘 油三脂等)基本上也不会导致入射光的散射和折射，在此条件下避免了样品中干 扰物的影响，使测定结果更接近真值，为临床诊断提供有力的依据。 (3)能明显提高IMA检测试剂盒和检测方法的灵敏度和特异性 由于本发明选用的金属离子显色剂具有灵敏度高和选择性强的特点，因此 能明显提高IMA检测试剂盒和检测方法的灵敏度和特异性。因为缺血和正常人样 品中未和白蛋白结合的金属离子数量变化差别不是很大，所以显色剂必须要求灵 敏度高。同时由于样品中含有的各种微量元素较多，因此显色剂也必须要有较强 的选择性，特别是不受样品中含量较高的钾、钠、钙和铁等元素的干扰。 (4)为IMA检测开发了一种性能稳定的IMA检测试剂盒 本发明采用的金属离子显色剂是一种性能优良的色原体，以苦胺酸偶氮变色 酸结构(参见图4)为例其中的偶氮基为有颜色的"生色基团"4，偶氮基的 两端与芳烃碳原子相连；芳烃环邻位的羟基为能参与形成金属配位物的"官能团" 5;芳烃环其他位置引入的取代基为能改变试剂本身颜色和影响试剂分析性能的 "助色基团"6，这些基团使得金属离子显色剂具有性能稳定，反应迅速，灵敏 度高和选择性强等特点，并且可以常温保存，有利于IMA试剂的运输和保存，是 一种性能稳定的IMA检测试剂盒，又IMA检测试剂盒成本低廉，是一个很有开 发前景的产品。
图1本发明IMA测试纸条的结构示意图。
图2本发明使用红光检测缺血修饰白蛋白试剂盒检测IMA方法的示意图。
图3脂血、血红蛋白、胆红素样品在300-800nm波长范围内非特异性吸收的 的吸光度变化(弓l自美国希曼国际公司(Synermed International Inc.)网页 http:〃www.synermedinc.com/revolution.php )。
图4金属离子显色剂苦胺酸偶氮变色酸的结构作为色原体中的"生色基团"， "官能团"和"助色基团"的示意图。
图5吡啶偶氮变色酸-钴离子IMA检测试剂盒建立的IMA标准动力学曲线图。
具体实施例方式
实施例1 吡啶偶氮变色酸-钴离子IMA检测试剂盒在Laola FAITH-1020全 自动生化分析仪上建立IMA标准曲线、校准品、质控品和检测IMA
吡啶偶氮变色酸-钴离子IMA试剂盒由第一试剂钴离子溶液(CoCl2 6H20， 23.5mg/100ml)和第二试剂由pHIO氨水-氯化铵缓冲溶液(25pl/ml氨水，1.2mg/ml 氯化铵)配制的吡啶偶氮变色酸(0.12mg/ml)溶液组成。
选取40例心肌缺血样品选自cTn I阳性或ECG ST波段波动的急性胸痛急诊 病人，IOO例对照组样品选自35岁以上，无糖尿病，高血压，高血脂，高胆固醇 病史。血液被抽入促凝管中，十分钟后，将凝集的血液离心分离血清。然后将样 品血清加入样品杯中放入样品盘中指定的样品测试位并编号，同时将标准品和质 控品放入样品盘指定的位置，将第一试剂和第二试剂分别放入相对应的试剂槽中， 指令机器不做试剂空白，所谓试剂空白就是以水代替样品血清所做的测试，但依 据本发明反应原理，第一试剂中所有的钴离子都将参于和第二试剂显色剂的反应， 因而所得吸光度是最高值，这样标准品和样品血清的吸光度将低于试剂空白，这 样所得标准曲线是倒置的，吸光度高，IMA反而低，因此本试剂盒不适合做试剂 空白。本测试采用终点法选取两点测吸光度，测试程序是先吸样品血清(或标准 品、质控品)25W和第一试剂25pl加入比色杯中混匀，37r孵育五分钟，然后 加入第二试剂25(HU混匀后在15点读取(主波长660nm，副波长800nm)第一个 OD值作为试剂本底，37'C孵育十分钟后在41点读取测第二个OD值，第二个 OD值扣去试剂本底OD值后即为样品的吸光度。
100例正常人对照组平均OD值为0.654±0.047， 40例心肌缺血对照组平均 OD值为0.938±0.151, IMA在正常人群中呈正态分布，范围(42-78 U/ml)，第 95百分位数定为75 U/ml。所得数据作回归分析绘制标准动力学曲线(见图3)， 并得到回归方程Y=99.548x+1.2538。
校准品和质控品是以已知的动力学曲线为依据,使用EDTA钠(乙二胺四乙 酸钠)替代血清或白蛋白而建立，校准品和质控品化学性能稳定，可用于日常质量 管理。在校准品和质控品检测体系里面，EDTA钠浓度越低，未结合的金属离子 就越多，吸光度就越高，相反，EDTA钠浓度越高，吸光度也就越低，因此EDTA 钠的浓度和吸光度成反比关系，EDTA钠配置浓度见下表1:表l
标准/质控品EDTA浓度(mol/L)OD值IMA单位(u/ml)
标10扁930.37640
标20扁800.59660
标30扁630.86085
标40扁501.138115
标50.001801.387140
质控l0細850.45150
质控20細550.923100
质控30.002101.254130
闩常先运行标准品建立标准曲线并进行储存，如果所测质控品的数值在质控
品所标示的范围内，质控通过，然后就可运行病人样品，所得OD值与标准曲线 进行对照，即可测得IMA值并打印结果，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。 如病人的IMA值高于临界值就为IMA阳性，测得的IMA值可为临床医生诊断心 肌缺血的症状。
实施例2对硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉-镍离子IMA试剂盒应用于ACS 的诊断及ACS危险性分级
对硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉-镍离子IMA试剂盒由单人份包装的含80pl 第一试剂的二价镍离子溶液(NiCl2'6H20， 55.0 mg/100ml)的带盖小试管(兼 比色管)和含l，OOOpl第二试剂由pH9.0氨水-氯化铵缓冲溶液(20pl/ml氨水， 7.0mg/ml氯化铵)配制的对硝基重氮氨基喹啉偶氮喹啉(O.lOmg/ml)溶液的带盖 小试管组成，用于全血检测。
将病人血液被抽入含肝素钠的抗凝试管中，打开第一试剂的封盖，将8(Hil 被测全血加入第一试剂管中混匀，室温孵育五分钟，然后打开第二试剂的封盖将 其全部倒入第一试剂管中混匀，放入比色仪的比色孔中，室温孵育十分钟后以空气 调零测定样品的OD值(光径lcm，波长670nm)。所得OD值与标准曲线进行对 照，即可测得IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。如病人的IMA值 高于临界值就为IMA阳性，测得的IMA值可为临床医生诊断心肌缺血级。如采用己有技术检测IMA，则有21名患者IMA阳性被升级，而采用本发明对硝基重 氮氨基喹啉基偶氮喹啉-镍离子IMA检测试剂盒，则有26名患者IMA阳性被升 级，其中18例和现有技术结果相符，8例为新发现，现有技术有3例降为阴性， 而所有排除为IMA阴性患者均未发生ACS，显示本发明试剂盒相对于已有技术 提高了灵敏度和特异性，可以更加有效地将患者分成高风险组和低风险组。
实施例3 1,5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基甲澄-锌离子IMA试剂盒联合和肌钙 蛋白I用于高危胸痛病人的ACS筛査
1，5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基甲潜-锌离子IMA试剂盒由第一试剂锌离子溶液 (ZnS04 '7H2O，24.8mg/100ml)和第二试剂由pH9.2氨水-氯化铵缓冲溶液((21nl/ml 氨水，6.5mg/ml氯化铵)配制的1,5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基甲'暨(0.125 mg/ml) 溶液组成。
高危胸痛病人血液被抽入促凝试管中，十分钟后将凝集的血液离心分离血 清。将100pl被测血清加入微量比色杯中，然后加入lOOpl第一试剂混匀，室温 孵育五分钟，然后加入第二试剂l,OOOW混匀，室温孵育十分钟后采用比色仪， 以空气调零测定样品的OD值(光径lcm，波长660nm)。所得OD值与标准曲线 进行对照，即可测得IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。
肌钙蛋白I是重要的心肌标志物，对ACS的特异性高达99%以上，但其对 ACS的灵敏度不到50%，采用1,5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基甲澄-锌离子IMA试剂 盒联合肌钙蛋白I用于高危胸痛病人的ACS筛查，测一百三十例急诊胸痛病人, 如单独采用肌钙蛋白I检测，灵敏度仅为49%，如联合IMA使用，灵敏度则可高 达91%，所以IMA联合肌钙蛋白I将是高危胸痛诊断流程对于ACS的重要诊断 工具。
实施例4间氯偶氮氨替比林-铜离子IMA试剂盒用于脑中风的早期诊断 间氯偶氮氨替比林-铜离子IMA试剂盒由第一试剂铜离子溶液(CuS04 6H20， 24.8mg/100ml)和第二试剂由pH9.4氨水-氯化铵缓冲溶液((22pl/ml氨水， 5.4mg/ml氯化铵)配制的间氯偶氮氨替比林(0.135 mg/ml)溶液组成。
106例脑中风(含脑缺血和脑出血)病人和43例正常人对照组血液被抽入促 凝试管中，十分钟后将凝集的血液离心分离血清。将ioow被测血清加入微量比 色杯中，然后加入100nl第一试剂混匀，室温孵育五分钟，然后加入第二试剂 l,OOOW混匀，室温孵育十分钟后采用比色仪，以空气调零测定样品的OD值(光径lcm，波长660nm)。所得OD值与标准曲线进行对照，即可测得IMA值，其 测定值用每毫升单位(U/ml)表示。
结果显示106例脑中风病人中，52例脑缺血病人的IMA平均值为102.5 U/ml， 54例脑出血病人(含蛛网膜下腔出血和颅内出血)的IMA平均值为101.6 U/ml， 均高于正常人对照组(IMA平均值为45.6 U/ml)，但脑缺血和脑出血病人的IMA 值没有显著差异(P>0.05)。
实施例5 1,5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基甲暨-铜离子IMA测试纸条试剂盒用于 下肢动脉硬化闭塞症的筛査
1，5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基甲整-铜离子IMA测试条试剂盒由100pl装于带盖 小试管中的第一试剂铜离子溶液(CuS04 *5H20, 24.8mg/100ml，和用第二试剂由 pH9.6氨水-氯化铵缓冲溶液((23pl/ml氨水，4.3 mg/ml氯化铵)配制的1,5-(2-羟 基-5-溴基)-3-氰基甲澄(0.125 mg/ml)显色剂溶液为显色剂的IMA测试纸条(参 见图1)组成。
选取200例年龄在55-70岁之间，病程在轻微主诉期和间歇性跛行期的病人， 病人血液被抽入促凝试管中，十分钟后将凝集的血液离心分离血清。将lOOpl被 测血清加入第一试剂小试管中混匀，室温孵育五分钟，然后取混合液滴入到 IMA测试纸条1 (参见图l)中的显色纸块2上，室温孵育十分钟后，采用反射 光率检测仪以空气调零测定样品的反射光率(波长660nm)，阳性标本颜色深， 反射光率低，阴性标本颜色浅，反射光率高，所得反射光率与标准曲线进行对照， 即可测得IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。
结果显示灵敏度高达100 %， IMA平均值为110.6 U/ml与磁共振血管造影 (MRA)检査结果的符合率达到96%。
实施例6苦胺酸偶氮变色酸-钴离子IMA试剂盒用于肺栓塞的早期诊断 苦胺酸偶氮变色酸-钴离子IMA试剂盒由第一试剂钴离子溶液(CoCl2 6H20， 24mg/100ml)和第二试剂由pH9.8氨水-氯化铵缓冲溶液((24jil/ml氨水，3.2 mg/ml 氯化铵)配制的苦胺酸偶氮变色酸(0.12mg/ml)溶液组成。
选取120例有肺栓塞的临床表现的病人血液被抽入促凝试管中，十分钟后将 凝集的血液离心分离血清。将100^1被测血清加入微量比色杯中，然后加入lO(Hil 第一试剂混匀，室温孵育五分钟，然后加入第二试剂l，OOOpl混匀，室温孵育十 分钟后采用比色仪，以空气调零测定样品的OD值(光径lcm，波长650nm)。所得OD值与标准曲线进行对照，即可测得IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml) 表示。
结果显示灵敏度高达100%, IMA平均值为113.5 U/ml，与肺动脉造影检查 结果的符合率达到98%。
权利要求
1.一种红光检测缺血修饰白蛋白的试剂盒，其特征在于试剂盒是由第一试剂二价金属离子钴、锌、铜或镍溶液10.00-60.00mg/100ml和第二试剂由pH8-10氨水-氯化铵缓冲液配制的0.10-3.00mg/ml金属离子显色剂溶液，或用第二试剂显色的IMA测试纸条(1)组成。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的IMA测试纸条(1)的结 构包括将纸块通过pH8-10氨水-氯化铵缓冲液配制的0.10-3.00 mg/ml金属离子显 色剂溶液浸润干燥后制成的显色纸块(2)和条状硬质塑料衬垫(3)，显色纸块(2) 粘贴在条状硬质塑料衬垫(3)上。
3. 权利要求1和2所述试剂盒的检测方法，其特征在于检测方法的步骤是(1) 将病人的生物样品和第一试剂已知过量的二价金属离子钴、锌、铜或镍溶液混合成混合液，18-37 °C孵育5分钟；(2) 然后加入第二试剂由pH8-10氨水-氯化铵缓冲液配制的金属离子显色剂 溶液显色，或将所述混合液滴加在IMA测试纸条(1)上显色，金属离子显色剂 和未与白蛋白结合的钴、锌、铜离子形成蓝色配合物或和镍离子形成绿色配合物， 18-37 °C孵育5-10分钟；(3) 在红光640-700nm波长测定所述有色配合物的吸光度或反射光率；(4) 所得数据与标准曲线相对照，即可得到IMA值。
4. 如权利要求3所述试剂盒的检测方法，其特征在于在第(2)步中所述的金属离子显色剂.是(a) 能和二价钴离子反应生成蓝色配合物的苦胺酸偶氮变色酸或吡啶偶氮变色酸；(b) 能和二价铜离子反应生成蓝色配合物的间氯偶氮氨替比林；(c) 能和二价锌或铜离子反应生成蓝色配合物的1,5-(2-羟基-5-溴基)-3-氰基甲澄；(d) 能和二价镍离子反应生成绿色配合物的对硝基重氮氨基喹啉基偶氮喹啉。
5. 权利要求1和2所述试剂盒的应用，其特征在于所述试剂盒在脑中风的诊断、ACS的诊断及危险性分级、急性胸痛的ACS筛查、下肢缺血性血管病变的诊 断、肺栓塞的诊断中检测IMA的应用。
6.权利要求1和2所述试剂盒的应用，其特征在于所述试剂盒联合和肌钙蛋 白I测定在ACS的诊断及危险性分级、急性胸痛的ACS筛査中检测IMA的应用。
全文摘要
本发明是一种红光检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其检测方法。试剂盒是由第一试剂二价金属离子钴、锌、铜或镍溶液和第二试剂pH8-10的金属离子显色剂溶液或用第二试剂显色的IMA测试纸条组成。检测方法是将生物样品和第一试剂溶液混合成混合液，然后加入第二试剂显色，或将混合液滴加在IMA测试纸条上显色，形成蓝色或绿色配合物，在红光640-700nm波长测定其吸光度或反射光率，其测定值可诊断病人是否有缺血症状。本发明开发了一种适合床边诊断的快速检测IMA方法，步骤简单，仅15分钟左右就能完成，并避免了样品中干扰物的影响，使测定结果更接近真值。试剂盒成本低廉，灵敏度高，特异性强，性能稳定，便于运输和保存。
文档编号G01N33/68GK101655500SQ20091019536
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月8日 优先权日2009年9月8日
发明者佳 刘, 静 江, 潘曙明, 程振球, 贺坚慧 申请人:贺坚慧