一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及缺血修饰白蛋白含量检测【技术领域】，特别涉及一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，试剂1中含有缓冲液，氯化钴，稳定剂，防腐剂；试剂2中含有缓冲液，二硫苏糖醇，稳定剂，还原保护剂，防腐剂。可以加速钴离子与正常白蛋白结合的效率，在一定时间内，完全与正常白蛋白结合，保证了试剂检测样本结果的准确性；保护了二硫苏糖醇在溶液中的稳定性，而且不影响二硫苏糖醇与钴离子的结合，从而保证试剂室温开瓶避光保存稳定30天，2-8℃闭瓶保存稳定12个月，完全满足临床检验的需要；促进了二硫苏糖醇与钴离子的结合的结合速度，使试剂尽快达到反应重点，保证了试剂的高效检测效果，显著提高了试剂检测的准确度。
【专利说明】一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒
[0001]【技术领域】
本发明涉及缺血修饰白蛋白(IMA)含量检测【技术领域】，特别涉及一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒。
[0002]【背景技术】
IMA是心肌早期缺血的敏感指标，结合其他血生化指标可提高敏感性及特异性，主要用于ACS患者的早期诊断，还用于PC1、起搏器和除颤器植入术后、扩张性心肌病心功能、急性心肌缺血患者的预后评价。
[0003]完整的白蛋白在肝脏中合成，由585个氨基酸残基组成，相对分子量为66.5 KD,在血液中的浓度为0.63 mmol/L，半衰期为19-20 d。其氨基末端为人类特有的一段序列，正常生理情况下，能够与过渡金属如钴、铜、镍等结合。
[0004]在缺血缺氧时人体组织进行无氧代谢，消耗ATP ;同时酸性代谢产物，局部微环境PH值下降，致使循环蛋白上的金属结合位点释放，在还原剂如维生素C等存在时，Cu2+被转化为Cu2+，后者可与氧反应生成超氧自由基，在超氧化物歧化酶的作用下将其歧化为过氧化氢(H2O2)和氧。正常情况下，H2O2是无害的，由过氧化物酶降解成水和氧气，而当有金属离子存在时，H2O2可通过Fenton反应形成烃自由基，后者具有高度活性，导致蛋白、核酸损伤和脂质过氧化。患者血清白蛋白易受:自由基损害，，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氣基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属如钴、铜及镍等结合能力改变的白蛋白则称为缺血修饰白蛋白(Ischemia modified albumin, IMA)。
[0005]近年来，IMA作为早期诊断急性心肌缺血的标记物在国内外受到广泛关注，美国食品与药物管理局(FDA)于2003年批准其用于急性冠状动脉综合征(ACS)的排除诊断，以降低对非心肌缺血性患者的收治率和心血管病高危个体的漏诊率，节省医疗资源。
[0006]对于IMA检测的临床意义有:
(I)IMA是检测早期心肌缺血的敏感指标，故能更早发现急性心肌缺血，更早预测心脏事件的相对危险。
[0007](2)IMA是急性冠脉综合征(ACS)诊断的生物标志。ACS具有发病急、变化快、临床表现与危险性不均一等特征，早期诊断困难。传统的生物标志物如肌钙蛋白(cTn)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)只有在心肌发生坏死时才升高，但这时已给患者带来了不可逆的病理损害。因此，急需一种可以反映心肌缺血的早期敏感的生化指标用于早期诊断，而IMA是近年来的研究热点，为ACS早期诊断的研究开辟了新的道路。IMA对ACS患者心肌缺血检出的灵敏度是ECG的2倍、cTn的4倍。
[0008]测定IMA方法很多，包括比色测定法、液相色谱法、质谱测定法以及核磁共振等，目前得到FDA认可批准的检测方法是根据白蛋白-钴结合试验(The albumin cobaltbinding test, ACB)原理,用比色法测定IMA。其基本原理是:在非缺血个体血衆中的白蛋白多以活性形式存在，当加人氯化钴(COCl2)溶液时，CO2+与结合能力正常的白蛋白结合，血浆中游离的CO2+浓度就会降低，而缺血个体血浆中的白蛋白多处于修饰状态，当加人相同浓度的COCl2溶液时，由于IMA与CO2+结合的能力减弱，使溶液中存在较高浓度的游离CO2+，加人二巯苏糖醇，溶液可与游离CO2+发生颜色反应，显色越强，表明未结合CO2+越多，而Alb-CO2+结合的越少，即Alb-CO2+结合力与反应显色强度呈负相关。换言之，IMA与反应显色强度呈正相关。
[0009]目前，根据最初FDA认可批准的白蛋白-钴结合试验方法配制的IMA检测试剂，在临床检测应用中存在一些技术问题，这些问题，限制了该试剂其在临床检测应用过程中的应用。主要的技术问题有:
(I)反应原理中钴离子先结合正常白蛋白，剩余游离的钴离子再与二硫苏糖醇反应显色，如果钴离子没有与正常白蛋白反应完全将影响测定的准确度。
[0010](2)由于IMA测定采用二硫苏糖醇为显色剂，其水溶液冷藏或冷冻保存稳定时间相对较短，影响试剂的稳定性。
[0011](3)钴结合二硫苏糖醇的反应，在正常情况反应速度较慢，在某些规定时间的检测过程(如全自动生化分析仪检测中)，检测高值时有可能无法达到反应终点，而影响检测的效率。
[0012]
【发明内容】
为了解决现有技术中存在的IMA检测准确度低、稳定性差、检测效率低的问题，本发明提供了一种检测准确度高、稳定性好、检测效率高的缺血修饰白蛋白检测试剂盒。
[0013]本发明的通过以下措施实现的:
一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，包括试剂I和试剂2，其中，
试剂I中含有以下组分:
pH 为 7.5-8.5 的缓冲液 0.05~0.5mol/L,
氯化钴10~40mmol/L,
稳定剂0.1^5g/L,
防腐剂0.rig/L ；
试剂2中含有以下组分:
pH 为 7.0-8.0 的缓冲液 0.5~5mol/L，
二硫苏糖醇20~40mmol/L,
稳定剂0.1^5g/L,
还原保护剂I~10 mmol/L,
防腐剂0.f lg/L。
[0014]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂I中的稳定剂为三乙醇胺。
[0015]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂2中的稳定剂为烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、三乙醇胺、烷基糖苷、曲拉通或吐温。
[0016]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂2中的还原保护剂为谷胱甘肽、亚硫酸氢钠或巯基乙醇。
[0017]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂I中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液或4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。
[0018]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂I和试剂2中的防腐剂为叠氮化钠或PC300。
[0019]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂2中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、咪唑缓冲液或醋酸盐缓冲液。
[0020]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂I与试剂2的体积比为f 4:1。
[0021]所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，优选所述试剂I与试剂2的体积比为2:1。
[0022]本发明的有益效果:
(1)在试剂I中加入三乙醇胺作为稳定剂，可以加速钴离子与正常白蛋白结合的效率，在一定时间内，完全与正常白蛋白结合，保证了试剂检测样本结果的准确性；
(2)在试剂2中加入还原保护剂，选择应用巯基乙醇作为保护剂，有效地保护了二硫苏糖醇在溶液中的稳定性，而且不影响二硫苏糖醇与钴离子的结合，从而保证试剂室温开瓶避光保存稳定30天，2-8°C闭瓶保存稳定12个月，完全满足临床检验的需要；
(3)在试剂2中加入非离子表面活性剂作为稳定剂，有效促进了二硫苏糖醇与钴离子的结合的结合速度，使试剂尽快达到反应终点，保证了试剂的高效检测效果，显著提高了试剂检测的准确度。
[0023]【专利附图】
【附图说明】
图1为4-8°C稳定性实验检测结果图，
图2对比相关性检测曲线。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例只是用于解释本发明，而不是对本发明的技术方案的限制。
[0025]实施例1:
试剂I各组分及浓度为:
Tris 缓冲液(pH 7.6)0.lmol/L,
氯化钴20mmol/L,
PC-300lg/L,
试剂2各组分及浓度为:
咪唑缓冲液(pH 7.0)lmol/L,
二硫苏糖醇20mmol/L,
PC-300lg/Lο
[0026]实施例1中的配方为FDA认可的市场上常规应用的一种配方，用作理论对照。
[0027]试剂I和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂I和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。
[0028]本发明试剂盒测定样本中的IMA的测试条件如下:
温度:37 °C;比色杯光径为1.0 cm。检测波长510 nm。(现在临床全自动生化分析仪器都能够达到该要求)
应用本发明IMA测定试剂盒测定样本中IMA的方法如下:
样品(检测的样品包括蒸馏水、标准品和临床样本)加试剂I混匀，37°C孵育5 min后读取吸光度A0，立即加入试剂2混匀，37°C反应5 min后，读取吸光度Al，ΛΑ = Al-AO0其中样本用量30 μ 1，试剂I用量200 μ 1，试剂2用量100 μ I。
[0029]本发明试剂盒测定样本中IMA含量按以下公式进行计算:
【权利要求】
1.一种缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于包括试剂I和试剂2， 其中，试剂I中含有以下组分:PH为7.5-8.5的缓冲液0.05、.5mol/L,氯化钴10?40mmol/L,稳定剂0.1?5g/L,防腐剂0.1?lg/L ； 试剂2中含有以下组分:pH为7.0-8.0的缓冲液0.5飞mol/L，二硫苏糖醇20?40mmol/L,稳定剂0.1?5g/L,还原保护剂I?10 mmol/L,防腐剂0.1?lg/L。
2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂I中的稳定剂为二乙醇胺。
3.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂2中的稳定剂为烷基酚聚氧乙烯醚、高碳脂肪醇聚氧乙烯醚、三乙醇胺、烷基糖苷、曲拉通或吐温。
4.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂2中的还原保护剂为谷胱甘肽、亚硫酸氢钠或巯基乙醇。
5.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂I中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液或4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂I和试剂2中的防腐剂为叠氮化钠或PC300。
7.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂2中的缓冲液为甘氨酸缓冲液、咪唑缓冲液或醋酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂I与试剂2的体积比为广4:1。
9.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂盒，其特征在于所述试剂I与试剂2的体积比为2:1。
【文档编号】G01N33/68GK103760357SQ201310537257
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】谭柏清, 王进, 甘宜梧 申请人:山东博科生物产业有限公司