专利名称：L－谷氨酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种通过发酵制备L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被广泛用作调味品等的原料。
而且，已经公开了多种用于提高L-谷氨酸制备能力的技术，这是通过采用重组DNA技术，以增强L-谷氨酸生物合成酶活蛛实现的。例如，据报导通过将源自大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的柠檬酸合酶的基因编码引入，则能有效地增强棒状杆菌属或短杆菌属中L-谷氨酸的产生能力(日本专利公布(公告)No.7-121228)。另外，日本专利申请未审公开No.61-268185公开了一种带有含谷氨酸脱氢酶基因的重组DNA的细胞，所述的基因源自棒状杆菌属细菌。而且，日本专利申请未审公开No.63-214189公开了一种提高L-谷氨酸生产能力的技术，它是通过扩增谷氨酸脱氢酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、乌头酸水合酶基因和柠檬酸合酶基因而实现的。
虽然，通过前述的微生物培育或制备方法的改进，L-谷氨酸的制备能力得到了显著地提高，但是需要对以更低的成本来更有效地制备L-谷氨酸的方法进行开发，以满足将来不断增长的需要。
在公知的方法中，发酵以培养物中积聚的L-氨基酸被结晶的形式进行(日本专利申请未审公开No.62-288)。在该方法中，通过将培养物中积聚的L-氨基酸沉淀，使培养物中的L-氨基酸浓度被保持在低于某一确定的水平。具体地说，通过调节培养物的温度和pH或向培养基中添加表面活性剂使发酵期间的L-色氨酸、L-酪氨酸或L-亮氨酸沉淀。
虽然伴随着L-氨基酸沉淀的发酵方法如上所述是公知的，但适合于该方法的氨基酸是显示出较低水溶性的那些氨基酸，且没有将该方法应用到高水溶性氨基酸例如L-谷氨酸的实例。另外，培养基必须是低pH的，以沉淀L-谷氨酸。然而，制备L-谷氨酸的细菌例如上述那些细菌不能在酸性条件下生长，因此在中性条件下进行L-谷氨酸发酵。(US3220929和US3032474；K.C.Chao & J.W.Foster，J.Bacteriol.，77，715-725页(1959))。因此，通过伴随着沉淀的发酵制备L-谷氨酸还没有听说。而且，最嗜酸的细菌的生长公知通过有机酸例如乙酸、乳酸和琥珀酸抑制。(Yasuro Oshima Ed.，“极端环境微生物手册”(“Extreme Environment Microoranism Handbook”)，第231页，科学论坛；R.M.Borichewski，J.Bacteriol.，93，第597-599页(1967)等)。由此，人们认为许多微生物在酸性条件下对同样是有机酸的L-谷氨酸敏感，迄今还没有试图对在酸性条件下显示出制备L-谷氨酸能力的微生物研究的报导。
本发明的发明人发现，在通过发酵制备L-谷氨酸的方法中，包括培养具有L-谷氨酸制备能力的微生物，使得在培养基中有L-谷氨酸的产生和积聚，并伴随着L-谷氨酸的沉淀，在自然产生结晶之前，当出现人工晶体时，L-谷氨酸的产率大于通过微生物产生的L-谷氨酸自发结晶时的产率。由此，实现了本发明。
本发明提供了如下内容。(1)通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其中包括在液体培养基中培养具有L-谷氨酸制备能力的微生物，该培养基的pH被调节至使通过微生物产生的L-谷氨酸沉淀的条件，以便使L-谷氨酸产生和积聚并伴随着L-谷氨酸的沉淀，其中当培养基中的L-谷氨酸浓度低于发生自发结晶的浓度时，进行使培养基中出现L-谷氨酸晶体的操作。(2)根据(1)的方法，其中使培养基中出现L-谷氨酸晶体的操作是添加L-谷氨酸晶体。(3)根据(2)的方法，其中晶体是α-晶体。(4)根据(3)的方法，其中添加到培养基中晶体的量是0.2g/L或更多。(5)根据(1)至(4)任一项的方法，其中微生物属于肠杆菌(Enterobacter)属。(6)根据(5)的方法，其中微生物是成团肠杆菌。(7)根据(1)至(6)任一项的方法，其中微生物可以代谢含饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中的碳源，且该培养基处于特定的pH下，且该微生物具有积聚L-谷氨酸的量超过该pH下液体培养基中L-谷氨酸饱和浓度的能力。(8)根据(7)的方法，其中特定的pH是5.0或更低。
根据本发明方法可以有效地产生L-谷氨酸。另外，在优选的实施方案中，可以产生优选作为产品的α-晶体。
图2显示的是由源自成团肠杆菌和大肠杆菌的sucA基因的核苷酸序列，推导的氨基酸序列之间的比较(上面成团肠杆菌，列大肠杆菌，该形式同样适用于下文)。
图3显示的是由源自成团肠杆菌和大肠杆菌的sucB基因的核苷酸序列，推导的氨基酸序列之间的比较。
图4显示的是由源自成团肠杆菌和大肠杆菌的sucC基因的核苷酸序列，推导的氨基酸序列之间的比较。
图5显示的是由源自成团肠杆菌和大肠杆菌的sdhB基因的核苷酸序列，推导的氨基酸序列之间的比较。
图6显示的是含gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒pMWCPG的构建图。
图7显示的是含宽宿主范围质粒RSF1010的复制起点和抗四环素基因的质粒RSF-Tet的构建图。
图8显示的是含宽宿主范围质粒RSF1010的复制起点、四环素抗性基因、g1tA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建图。
图9显示的是含gltA基因的质粒pSTVCB的构建图。
在此之后，本发明将进行详细地说明。
本发明的制备方法是通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其中包括在液体培养基中培养具有L-谷氨酸制备能力的微生物，该培养基的pH被调节至使通过微生物产生的L-谷氨酸沉淀的条件，以便使L-谷氨酸产生和积聚并伴随着L-谷氨酸的沉淀，其中当培养基中的L-谷氨酸浓度低于发生自发结晶的浓度时，进行使培养基中出现L-谷氨酸晶体的操作。
本文所使用的术语“自发结晶”意思是由于具有L-谷氨酸制备能力的微生物而使L-谷氨酸积聚，在培养基中L-谷氨酸的浓度超过饱和浓度，且L-谷氨酸在培养基中自然沉淀。
使培养基中出现L-谷氨酸晶体的操作，意思是用人工方法使晶体出现的操作。操作的实施例包括向培养基中添加晶体，通过在培养期间降低培养基的pH而强制沉淀，其中在培养的起始阶段就有了一定量的L-谷氨酸溶解。
在培养基中存在的晶体的量通常是0.01至10g/L。出现晶体的时间优选是在培养基中的L-谷氨酸的积聚量提高到饱和浓度附近时(例如在pH4.5，25g/L或更多)。在培养基中出现晶体的量和L-谷氨酸的浓度通过本领域技术人员公知的方法确定。通过将培养基静置，并通过倾泻将晶体从培养基分离来确定存在的L-谷氨酸晶体的量。在培养基中L-谷氨酸的浓度指的是溶解的L-谷氨酸的浓度。当在培养基中发生晶体沉淀时，该浓度是通过离心(或过滤)将固体分离而获得的澄清溶液的浓度来进行确定。
造成出现L-谷氨酸晶体的操作优选是添加L-谷氨酸晶体。
作为L-谷氨酸晶体，有α-结构晶体和β-结构晶体(H.Takahashi，T.Takenishi，N.Nagashima，Bull.Chem.Soc.Japan，35，923(1962)；J.D.Bemal，Z.Krist.，78，363(1931)；S.Hirokawa，Acta Cryst.，8，637(1955))。当想要得到α-结构晶体时，优选添加α-结构晶体。
根据诸如晶体的晶体结构等条件的不同，优选晶体的量是不同的。如果晶体是α-结构的，通常是0.2g/L或更多。如果超过该浓度，可以获得具有良好再现性的α-结构晶体。由于其形状，α-结构晶体比β-结构晶体更易于处理。
具有L-谷氨酸制备能力的微生物用于本发明的第一种制备方法，而本发明第二种制备方法所采用的微生物当其在培养基中培养时，在培养基中积聚了大量的L-谷氨酸。其实例包括属于肠杆菌属的微生物。优选，成团肠杆菌。
而且，用于本发明制备方法的具有L-谷氨酸制备能力的微生物优选是可以代谢含饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中的碳源，且该液体培养基处于特定的pH下，且该微生物具有积聚L-谷氨酸的量超过该前述pH下液体培养基中L-谷氨酸饱和浓度的能力(自此以后，也称为“积聚L-谷氨酸微生物”)。该前述特定的pH优选是使L-谷氨酸在培养基中沉淀的pH，且这样的pH通常是5.0或更低。
“饱和浓度”指的是当液体培养基被L-谷氨酸饱和时溶于液体培养基的L-谷氨酸的浓度。
当使用积聚L-谷氨酸微生物时，适合于L-谷氨酸制备的pH，优选是使L-谷氨酸在培养基中沉淀的pH。通过在该pH下进行培养，在培养基中产生并积聚L-谷氨酸，并伴随着其沉淀。
可以以如下方式获得积聚L-谷氨酸微生物。将含微生物的样品接种进含饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，该液体培养基处于特定的pH下，并对代谢碳源的菌株进行选择。虽然对该特定的pH没有特别的限制，但通常是约5.0或更少，优选约4.5或更少，进一步优选是约4.3或更少。将积聚L-谷氨酸微生物用于通过发酵而进行的L-谷氨酸的制备，且同时伴随着L-谷氨酸的沉淀。如果该pH太高，就难以使微生物产生足够量造成沉淀的L-谷氨酸。因此，优选pH在前述范围内。
如果降低含L-谷氨酸的水溶液的pH，L-谷氨酸的溶解度明显γ-羧基的pKa(4.25，25℃)周围降低。在等电点(pH3.2)溶解度变得最低，且超过饱和浓度量的L-谷氨酸被沉淀。同时根据培养基组分，在约30℃下，在pH3.2时L-谷氨酸的溶解量是10-20g/L，在pH4.0时L-谷氨酸的溶解量是30-40g/L而在pH4.7时L-谷氨酸的溶解量是50-60g/L。通常不需要使pH为3.0或更低，这是因为当pH低于某一特定值时，L-谷氨酸的沉淀会达到其上限。然而，pH可以是3.0或更低。
另外，所表述的微生物“可以代谢碳源”指的是微生物可以增殖或在其不能增殖的情况下也可以消耗碳源，即表明微生物对碳源例如糖或有机酸发生分解代谢。具体地说，例如，如果当将微生物在合适的温度下，2-4天时间里，在pH为5.0至4.0，含饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中进行培养而微生物增殖的话，则该微生物可以代谢培养基中的碳源，该pH优选是4.5至4.0，更优选4.3至4.0，特别优选是4.0，所述的合适的温度例如是28℃、37℃或50℃。而且，例如如果当将微生物在合适的温度下，2-4天时间里，在pH为5.0至4.0，含饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中进行培养，而微生物消耗了碳源，尽管微生物没有增殖的话，则该微生物是可以代谢培养基中的碳源的微生物，该pH优选是4.5至4.0，更优选4.3至4.0，特别优选是4.0，所述的合适的温度例如是28℃、37℃或50℃。
可以代谢碳源的微生物包括可以在前述液体培养基中生长的微生物。
而且，所表述的微生物“可以生长”指的是微生物可以增殖或在其不能增殖的情况下也可以产生L-谷氨酸。具体地说，例如，如果当将微生物在合适的温度下，2-4天时间里，在pH为5.0至4.0，含饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中进行培养而微生物增殖的话，则该微生物可以在培养基中的生长，该pH优选是4.5至4.0，更优选4.3至4.0，特别优选是4.0，所述的合适的温度例如是28℃、37℃或50℃。而且，例如如果当将微生物在合适的温度下，2-4天时间里，在pH为5.0至4.0，含饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中进行培养，而微生物提高了合成液体培养基中L-谷氨酸的量，尽管微生物没有增殖的话，则该微生物是可以在培养基中的生长的微生物，该pH优选是4.5至4.0，更优选4.3至4.0，特别优选是4.0，所述的合适的温度例如是28℃、37℃或50℃。
在同样的条件下，或改变pH或L-谷氨酸浓度的情况下，则上述的选择可以重复两次或更多次。对于早期阶段的选择可以在含浓度低于饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行，且之后接着在含饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行选择。而且，具有良好性质，例如优异增殖速率的菌株可以被选择出来。
积聚L-谷氨酸微生物除了上述性质以外，是具有在液体培养基中以超过L-谷氨酸饱和浓度的量积聚L-谷氨酸能力的微生物。前述液体培养基的pH优选与用于筛选具有前述性质的微生物的培养基的pH相同或接近。通常，在高浓度，而pH变得较低的情况下，微生物对L-谷氨酸敏感。因此，鉴于抗L-谷氨酸性，优选pH不能太低，但鉴于伴随着L-谷氨酸沉淀的L-谷氨酸的制备，低pH是优选的。为了满足这些条件，pH可以是3至5的范围，优选4至5，更优选4至4.7，进一步优选4至4.5，特别优选4.0至4.3。
对于积聚L-谷氨酸微生物或培养物料，可以被提及，例如属于肠杆菌属、克雷白氏杆菌属、沙雷氏菌属、泛菌属、欧文氏菌属、埃希氏杆菌属、棒状杆菌属、脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属或酵母属(Saccharomyces)等的微生物。其中属于肠杆菌属的微生物是优选的。之后，本发明的微生物将主要针对肠杆菌属的微生物进行解释。然而，该微生物不限于属于肠杆菌属的微生物，也可以是类似使用的其它属的微生物。
属于肠杆菌属的微生物，具体是已涉及的成团肠杆菌，优选成团肠杆菌AJ13355菌株。该菌株从Iwata-shi，shizuoka，日本的土壤中分离出来作为菌株，是可以在低pH下，在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株。
AJ13355的生理性质如下所示(1)革兰氏染色阴性(2)抗氧性兼性厌氧菌(3)过氧化氢酶阳性(4)氧化酶阴性(5)硝酸还原能力阴性(6)伏-普二氏反应试验阳性(7)甲基红试验阴性(8)脲酶阴性(9)吲哚产生阳性(10)游动性游动的
(11)在TSI培养基中H2S的产生弱活性(12)β-半乳糖苷酶阳性(13)糖同化性阿拉伯糖阳性蔗糖阳性乳糖阳性木糖阳性山梨糖醇阳性肌醇阳性海藻糖阳性麦芽糖阳性葡萄糖阳性福寿糖醇阴性棉子糖阳性水杨苷阴性蜜二糖阳性(14)甘油糖同化性阳性(15)有机酸同化性柠檬酸阳性酒石酸阴性葡萄糖酸阳性乙酸阳性丙二酸阴性(16)精氨酸脱水酶阴性(17)鸟氨酸脱羧酶阴性(18)赖氨酸脱羧酶阴性(19)苯丙氨酸脱氨基酶阴性(20)颜料形成黄色(21)明胶液化能力阳性(22)生长pH在pH4能生长，在pH4.5至7能生长良好
(23)生长温度在25℃生长良好，在30℃生长良好，在37℃生长良好，在42℃能生长，在45℃不能生长。
基于这些细菌学的性质，AJ13355被确定为成团肠杆菌。
该成团肠杆菌AJ13355于1998年2月19日被保藏在国立生命科学和人类技术研究所，工业科学和技术机构，国际贸易和工业部(现为国际专利生物保藏单位，国立高级工业科学和技术研究所)且收到的保藏号是FERM P-16644。接着根据布达佩斯条约的有关条款，在1999年1月11日被转为国际保藏，且收到的保藏号是FERM BP-6614。
该积聚L-谷氨酸微生物可以是最初就具有L-谷氨酸制备能力的微生物或通过使用诱变处理、重组DNA技术等经培养而被赋予或加强的具有L-谷氨酸制备能力的微生物。
该L-谷氨酸制备能力可以通过例如，提高催化L-谷氨酸生物合成反应的酶活性而得到赋予或增强。该L-谷氨酸制备能力也可以通过降低或消除催化从L-谷氨酸生物合成途径中分叉的反应的酶活性而得到加强，所述的反应产生一种非L-谷氨酸的化合物。
催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的例子，可以是已经提及的谷氨酸脱氢酶(以后，也称为“GDH”)、谷氨酰氨合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(以后，也称为“CS”)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶(以后，也称为“PEPC”)，丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶和葡糖磷酸异构酶等。在这些酶当中，CS、PEPC和GDH中的一种、两种或三种是优选的。而且，优选在积聚L-谷氨酸微生物中的CS、PEPC和GDH中的所有三种酶的活性被加强。特别的是，谷氨酸棒状杆菌的CS是优选的，因为它不会受到α-氧代戊二酸、L-谷氨酸和NADH的抑制。
为了增强CS、PEPC或GDH的活性，例如编码CS、PEPC或GDH的基因被克隆到适当的质粒上，而且宿主微生物靠获得的质粒被转化。编码CS、PEPC或GDH(以后，分别缩写为“gltA基因”、“ppc基因”和“gdhA基因”)的基因的拷贝数量在转化的菌株细胞中得到增长，导致CS、PEPC或GDH活性的提高。
克隆的gltA、ppc和gdhA基因被单独地或以它们中的两种或三种的任意组合的形式引入前述的起始亲株。当将这些基因的两种或三种引入时，这两种或三种基因被克隆到一种质粒上，并被引入宿主，或分别克隆到两种或三种共存的质粒上，并被引入宿主。
编码同一种酶但源自不同的微生物的两种或更多种基因，可以被引入同一宿主。
对上述质粒没有特别的限制，只要它们在微生物细胞中自发地复制就行，所述的微生物属于例如，肠杆菌属等。然而，它们可以是提及的例如，pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC177、pACYC184等等。除了这些，噬菌体DNA载体也可以被使用。
通过例如，D.M.Morrison的方法(酶学中的方法(Methods in Enzymology)，68，326(1979))进行转化，其中DNA的受体细菌细胞的渗透率通过用氯化钙处理细胞而得到提高的方法(Mandel M.和Higa A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))、电穿孔(Miller J.H.，“细菌遗传学短训课程”(“A Short Coursein Bacterial Genetics”)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，美国，1992)等来进行转化。
通过使gltA基因、ppc基因或gdhA基因多重拷贝出现在前述起始亲株的染色体DNA上，而使该亲株成为宿主，这样也可以使CS、PEPC或GDH的活性得到提高。为了将gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多重拷贝引入在微生物的染色体DNA上，所述的微生物属于肠杆菌属等，染色体DNA上多重拷贝的序列例如重复的DNA和出现在转座因子末端的反向重复的序列也可以使用。或者，可以将基因的多重拷贝通过采用含gltA基因、ppc基因或gdhA基因的转座子的转移可以引入到染色体DNA上。结果，在转化的菌株细胞中的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的拷贝数量得到提高，由此，CS、PEPC或GDH的活性得到提高。
作为其拷贝数量得到提高的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的来源的生物，可以采用任何生物，只要它具有CS、PEPC或GDH活性。尤其是原核生物的细菌，例如属于肠杆菌属、克雷白氏杆菌属、欧文氏菌属、泛菌属、沙雷氏菌属、埃希氏杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属或芽孢杆菌属的那些是优选的。作为具体的实例，可以是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等。gltA基因、ppc基因或gdhA基因可以由上述微生物染色体DNA获得。
通过使用CS、PEPC或GDH活性缺陷的突变株，以便从前述微生物的染色体DNA分离DNA片段，从而获得gltA基因、ppc基因或gdhA基因，所述的DNA片段补充其营养缺陷体。而且，既然埃希氏杆菌属和棒状杆菌属细菌的这些基因的核苷酸序列已经被阐明(生物化学(Biochemistry)，22，第5243-5249页(1983)；“生物化学(J.Biochem.)”杂志，95，第909-916页(1984)；基因(Gene)，27，第193-199页(1984)；微生物学(Microbiology)，140，第1817-1828页(1994)；Mol.Gen.Genet.，218，第330-339页(1989)；分子微生物学(Molecular Microbiology)，6，第317-326，(1992))，则它们也可以通过使用基于各核苷酸序列合成的引物和作为模板的染色体DNA的PCR而获得。
除了前述的基因加强作用以外，CS、PEPC或GDH的活性也可以通过增强gltA基因、ppc基因或gdhA基因的表达来得到提高。例如，通过用另外更强的启动子来代替gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子，以增强该表达。例如，λ噬菌体的lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、PR启动子和PL启动子等是公知的强启动子。其启动子被代替的gltA基因、ppc基因或gdhA基因被克隆到质粒上，并引入到宿主微生物，或通过使用重复DNA、反向重复或转座子等引入到宿主微生物的染色体DNA上。
也可以通过用另外更强的启动子来代替染色体上gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子(参见WO87/03006和日本专利申请未审公开No.61-268183)，或在各基因的编码序列的上游中插入强启动子(参见“基因”29，第231-241页(1984))，使CS、PEPC或GDH的活性增强。具体地说，在其启动子被更强的启动子代替的gltA基因、ppc基因或gdhA基因或含其一部分的DNA和染色体上相应的基因之间进行同源重组。
催化从L-谷氨酸生物合成途径中分叉并产生非L-谷氨酸的化合物的反应的酶的实例包括α-氧代戊二酸脱氢酶(以下，也称为“αKGDH”)、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、醋酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶和1-吡咯啉脱氢酶等。在这些酶中，αKGDH是优选的。
为了降低或消除微生物中前述酶的活性，所述的微生物属于肠杆菌属等，可以通过常规的诱变处理方法或基因工程方法将用于降低或消除酶细胞内活性的突变引入前述酶的基因。
诱变处理方法的实例包括，例如X-射线或紫外线照射方法，使用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等的处理方法。诱变引入基因的位点可以是编码酶蛋白的编码区域或用于调节表达例如启动子的区域。
基因工程的实例包括，例如使用基因重组、转导和细胞融合等方法。例如，药物抗性基因被插入克隆的靶基因，用以制备丧失其功能的基因(有缺陷基因)。随后，该有缺陷基因被引入宿主微生物细胞，且用前述有缺陷的基因通过同源重组(基因破坏)代替染色体上的靶基因。
靶酶的细胞内活性的降低或缺乏和活性的降低程度通过对从候选菌株获得的细胞抽提物或其纯化部分的酶活性进行测量并且将其与野生株的活性进行比较而得到确定。例如，αKGDH活性可以通过Reed等人的方法测定。(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，“酶学方法”，13，第55-61页(1969))。
根据靶酶，靶突变菌株可以基于突变菌株的表现型进行选择。例如，αKGDH活性被消除或降低的突变菌株不能增殖或在需氧培养条件下含作为唯一碳源的葡萄糖或乙酸或L-谷氨酸的基本培养基中，突变菌株增殖速率明显地减少。然而，即使在同样条件下，通过向含葡萄糖的基本培养基中添加琥珀酸或赖氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸，是可以得到正常增殖的。通过利用这些现象作为指示，可以选择具有减少的αKGDH活性或缺乏活性的菌株。
通过使用同源重组的制备谷氨酸棒杆菌αKGDH基因-缺陷菌株的方法被详细描述于WO95/34672。类似的方法也适用于其它微生物。
而且，例如基因克隆和DNA的消化和连接、转化等技术被详细描述于“分子克隆”(Molecular Cloning)，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)等。
上述获得的αKGDH活性缺陷或αKGDH活性降低的突变株的具体实例，可以是成团肠杆菌AJ13356。成团肠杆菌AJ13356于1998年2月19日被保藏在国立生命科学和人类技术研究所，工业科学和技术机构，国际贸易和工业部(现在，国际专利生物保藏单位，国立高级工业科学和技术研究所)且收到的保藏号是FERM P-16645。接着根据布达佩斯条约的有关条款，在1999年1月11日被转为国际保藏，且收到的保藏号是FERM BP-6615。作为αKGDH-E1亚单位基因(sucA)破坏的结果，成团肠杆菌AJ13356在αKGDH活性中有缺陷。
当成团肠杆菌作为用于本发明的微生物的一个例子时，其被培养在含糖的培养基中，进行细胞外分泌粘液，偶而导致操作低效率。因此，当使用具有这样的分泌粘液性质的成团肠杆菌时，优选使用与野生株相比，粘液分泌较少的突变株。诱变处理的实例包括，例如使用X-射线或紫外线照射的方法，使用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等的处理方法。通过将诱变细菌细胞接种于含糖的培养基中，可以选择分泌粘液降低的突变株，例如所述的培养基是含5g/L葡萄糖的LB培养基平板，培养时将板倾斜约45度，并选择没有粘液流出的菌落。
在本发明中，L-谷氨酸-制备能力的赋予和增强和赋予其它良好性质例如，上述较少粘液分泌的突变可以以任意的顺序进行。
通过在液体培养基中培养具有L-谷氨酸制备能力的微生物，并调节液体培养基的pH，使L-谷氨酸沉淀，则可以产生和积聚L-谷氨酸并伴随着培养基中L-谷氨酸的沉淀。
优选，通过在液体培养基中培养积聚L-谷氨酸微生物，并调节液体培养基的pH条件，使L-谷氨酸沉淀，则可以产生和积聚L-谷氨酸并伴随着培养基中L-谷氨酸的沉淀。而且，在中性pH下开始培养，且pH变成使L-谷氨酸在培养完成时沉淀的条件是可能的。
“使L-谷氨酸沉淀的条件”在本文指的是当上述微生物产生和积聚L-谷氨酸时，使L-谷氨酸沉淀的条件。例如，当微生物是成团肠杆菌时，通常是3至5。
在开始时微生物可以在适于其生长的pH下培养，接着在使L-谷氨酸沉淀的条件下培养。例如，当培养基含微生物不能吸收的糖源，在使L-谷氨酸沉淀的条件下，或当培养基含抑制微生物生长的有机酸，在使L-谷氨酸沉淀的条件下时，该微生物在微生物可以吸收糖源或微生物的生长并没有受到有机酸抑制的条件下培养，使该微生物消耗糖源或有机酸，接着在使L-谷氨酸沉淀的条件下培养。
用于培养的培养基，可以使用通常的含所需碳源、氮源、无机盐和有机痕量营养素例如，氨基酸和维生素的营养素培养基，只要调节pH满足预定条件即可。可以使用合成的或天然的培养基。用于培养基的碳源和氮源可以是任意的，只要它们为需培养的菌株所用即可。
作为碳源，使用糖例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。另外，有机酸例如乙酸和柠檬酸可以分别单独使用或与另外的碳源结合使用。
作为氮源，使用氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵和硝酸铵等。
作为有机痕量营养素使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、含例如胨、酪蛋氨基酸、酵母浸出物和大豆蛋白分解产物的那些物质。当使用代谢或生长需要氨基酸等的营养缺陷的突变株时，必须补充所需的营养素。
作为无机盐，使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐等。
在pH3至5，培养温度是20至42℃的条件下，伴随着搅拌进行通常的培养，所述的pH优选是4至5，更优选4至4.7，特别优选4至4.5。在培养了约10小时至约4天之后，通常积聚了大量的L-谷氨酸。超过饱和浓度的一部分积聚的L-谷氨酸在培养基中沉淀。
在完成培养之后，在培养基中沉淀的L-谷氨酸通过离心或过滤等方式收集。溶于培养基中的L-谷氨酸也可以通过公知的方法收集。例如，通过将培养液浓缩使其结晶来分离L-谷氨酸，或通过离子交换色谱法等来分离。也可以使溶于培养基中的L-谷氨酸结晶，并接着收集沉淀在培养液中的L-谷氨酸和结晶的L-谷氨酸。
当超过饱和浓度的L-谷氨酸沉淀时，溶于培养基的L-谷氨酸的浓度恒定。因此，高浓度的L-谷氨酸对微生物的影响降低。因此，同样可以培养具有更加提高的L-谷氨酸制备能力的微生物。而且，由于L-谷氨酸以晶体的形式沉淀，则通过积聚L-谷氨酸的培养液的酸化被抑制，且由此用于保持培养基pH的碱量被明显降低。假如本发明并不想被任何理论所束缚，则L-谷氨酸的产率得到提高的原因被认为是如下所述的内容，所述的产率提高是通过在培养基中L-谷氨酸的浓度低于发生自发结晶的浓度时，进行使培养基中出现L-谷氨酸晶体的操作而实现的，在这种情况下，L-谷氨酸出现如上所述的沉淀。
在伴随着沉淀的L-谷氨酸发酵中，L-谷氨酸的产生趋向于达到发生自发结晶时的限度。据推测这是因为当发生自发结晶时，L-谷氨酸的浓度在细胞的表面是最高的，因而在该表面发生沉淀，从而阻碍细胞膜周围物质的移动，降低了细菌的活性。如果在自发结晶产生之前，用人工方法产生晶体，则该晶体作为晶种在晶体表面产生沉淀，从而防止了细菌活性的降低。
用上述样品涂布的培养基在28℃、37℃或50℃培养2至4天，并获得378个形成菌落的菌株。
接着将上述得到的各菌株在16.5cm长和14mm直径的含3mL液体培养基(用HCl调节pH为4.0)的试管中接种，所述的液体培养基含饱和浓度的L-谷氨酸，并在摇动的情况下在28℃、37℃或50℃培养24小时至3天。接着选择生长的菌株。前述培养基的组成如下40g/L葡萄糖、20g/L的硫酸铵、0.5g/L的七水硫酸镁、2g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的氯化钠、0.25g/L的二水氯化钙、0.02g的七水硫酸亚铁、0.02g/L的四水硫酸锰、0.72mg/L的二水硫酸锌、0.64mg/L的五水硫酸铜、0.72mg/L的六水氯化钴、0.4mg/L的硼酸、1.2mg/L的二水钼酸钠和2g/L的酵母浸出物。
由此成功地获得78个在酸性环境中显示L-谷氨酸抗性的微生物菌株。<2>从酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物中选择显示出出色生长速率的菌株将多种如上所述获得的在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物分别在16.5cm长和14mm直径的含3mL培养基(用HCl调节pH为4.0)的试管中接种，所述的培养基通过向M9培养基(Sambrook，J.，Fritsh、E.F.和Maniatis，T.，“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，美国，1989)中添加20g/L谷氨酸和2g/L的葡萄糖而获得，测定在一个时间段内的培养基的浊度，以选择显示良好生长速率的菌株。结果，作为显示良好生长的菌株，则是从Iwata-shi，shizuoka，日本的土壤中得到的AJ13355菌株。基于上述的其细菌学性质，确定为成团肠杆菌。<3>从成团肠杆菌AJ13355菌株得到具有较少粘液分泌的菌株由于在含糖的培养基中培养时，成团肠杆菌AJ13355菌株进行细胞外粘液分泌，使操作效率不太好。因此，通过紫外线照射方法得到具有较少粘液分泌的菌株((Miller J.H.等人，“细菌遗传学短训课程；实验手册”，第150页，1992，Cold Spring Harbor Laboratory Press，美国)。
将成团肠杆菌AJ13355菌株用紫外线在离60W紫外灯60cm远的位置进行照射，并在LB培养基中培养过夜，以固定突变。稀释该诱变菌株并在含5g/L的葡萄糖和20g/L的琼脂的LB培养基中接种，这样每板就会出现约100个菌落，并在倾斜约45度的板上在30℃下培养过夜，并接着选择没有粘液流出的20个菌落。
菌株满足的条件是即使在含5g/L的葡萄糖和20g/L的琼脂的LB培养基中经5次再培养后仍然没有回复子出现，且应能观察到其生长与在LB培养基中的亲株等同，用20g/L的L-谷氨酸和2g/L的葡萄糖对含5g/L的葡萄糖的LB培养基和M9培养基(Sambrook.J等人的“分子克隆”，第2版，Cold Spring HarborPress，美国，1989)进行补充，并用HCl调节pH为4.5，从上述选择的菌株中选择SC17菌株。<4>由成团肠杆菌SC17菌株构建谷氨酸制备细菌(1)由成团肠杆菌SC17菌株制αKGDH缺陷菌株由成团肠杆菌SC17菌株制备αKGDH缺陷菌株和增强的L-谷氨酸生物合成系统。(i)成团肠杆菌AJ13355菌株的αKGDH基因的克隆(以后，称为“sucAB”)成团肠杆菌AJ13355菌株的sucAB基因通过从成团肠杆菌AJ13355菌株的染色体DNA对大肠杆菌的αKGDH-E1亚单位基因(以后，称为“sucA”)的缺陷菌株的乙酸-未同化性质补充的DNA片段进行选择而被克隆。
成团肠杆菌AJ13355菌株的染色体DNA通过常规使用的用于从大肠杆菌提取染色体DNA的方法分离(“生物工程实验课本”(Text for BioengineeringExperiments)，由Society for Bioscience and Bioengineering编辑，日本，第97-98页，Baifukan，1992)。pTWV228(耐氨苄青霉素)用作载体，这是TakaraShuzo Co.，Ltd的市售产品。
用EcoT221消化的AJ13355菌株的染色体DNA和用PstI消化的pTWV228通过用T4连接酶连接，并用于转化sucA缺陷大肠杆菌JRG465菌株(Herbert，J.等人，Mol.Gen.Genetics.，105，182(1969))。在乙酸基本培养基中生长的菌株从上述获得的转化菌株中选择，且质粒从其中提取，并被指定为pTWVEK101。带有pTWVEK101的大肠杆菌JRG465菌株除了乙酸-未同化性质以外，恢复了琥珀酸或L-赖氨酸和L-蛋氨酸营养缺陷。这表明pTWVEK101含有成团肠杆菌的基因。
附
图1显示了源自pTWVEK101中的成团肠杆菌的DNA片段的限制酶图。在附图1的阴影线部分的核苷酸序列中，发现被认为是两个全长的ORF的核苷酸序列，和两个被认为是ORF的部分序列的核苷酸序列。对于这些序列同源性研究的结果，显示出其核苷酸序列的部分被确定含琥珀酸脱氢酶铁-硫蛋白质基因(sdhB)、全长sucA和αKGDH-E2亚单位基因(SucB基因)的3’端部分序列和琥珀酰CoA合成酶β亚单位基因(sucC基因)的5’端部分序列。从这些核苷酸序列推断出的的氨基酸序列与源自大肠杆菌的那些序列(Eur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Eur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；Biochemistry，24，第6245-6252页(1985))相比较的结果示于图2至5。因此该氨基酸序列彼此之间显示出非常高的同源性。另外，发现sdhB-sucA-sucB-sucC簇与大肠杆菌中的一样，构建在成团肠杆菌的染色体上(Eur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Eur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；Biochemistry，24，第6245-6252页(1985))。(ii)从成团肠杆菌SC17菌株得到αKGDH缺陷菌株通过使用如上所述得到的成团大肠杆菌的sucAB基因进行同源重组，以获得成团肠杆菌的αKGDH缺陷菌株。
在用SphI消化pTWVEK101以切除含sucA的片段之后，该片段用Klenow片段(Takara Shuzo Co.，Ltd)平端化，并通过使用T4 DNA连接酶(TakaraShuzo Co.，Ltd)用EcoRI消化的和用Klenow片段平端化的pBR322连接。通过使用限制酶BglII将得到的质粒在该酶的识别位点被消化，所述的识别位点约位于sucA的中心，用Klenow片段平端化，且接着通过使用T4 DNA连接酶再次连接。可以认为sucA基因变成无功能的，这是因为移码突变被引入通过上述步骤新近构建的质粒的sucA。
如上所述构建的质粒用限制酶ApaLI消化，且经琼脂糖胶电泳将含引入移码突变的sucA的DNA片段和源自pBR322的抗四环素基因回收。回收的DNA片段使用T4 DNA连接酶再次连接以构建用于破坏αKGDH基因的质粒。
如上所述获得的用于破坏αKGDH基因的质粒，通过电穿孔被用来转化成团肠杆菌SC17菌株(Miller J.H.等人，“细菌遗传学短训课程；手册”(A short Coursein Bacterial Genetics；Handbook)，第279页，1992，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，美国)，且通过使用作为标记的四环素抗性获得一种菌株，在该菌株中染色体上的sucA经同源重组被质粒的一种突变体所代替。得到的菌株被指定为SC17 sucA菌株。
为了确定SC17 sucA菌株在αKGDH活性方面是有缺陷的，通过使用Reed等人的方法(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，“酶学方法”，13，第55-61页(1969))使用在LB培养基中培养至对数生长期的菌株细胞，来测定酶活性。结果，从SC17菌株检测的αKGDH活性是0.073(ΔABS/min/mg蛋白质)，而从SC17sucA菌株没有检测出αKGDH活性，由此确定sucA被如愿消除了。(2)成团肠杆菌SC17 sucA菌株的L-谷氨酸生物合成系统的增强随后，源自大肠杆菌的柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因和谷氨酸脱氢酶基因被引入SC17 sucA菌株。
(i)源自大肠杆菌的具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒的制备通过参照附图6和7对制备具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因质粒的步骤进行解释。
具有源自大肠杆菌的gdhA基因的质粒pBRGDH(日本专利申请未审公开No.7-203980)用HindIII和SphI消化，两端通过T4 DNA聚合酶处理被平端化，且接着具有gdhA基因的DNA片段被纯化和回收。再将源自大肠杆菌的具有gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP(WO97/08294)用XbaI消化，且接着使用T4 DNA聚合酶将两端平端化。将其与上述纯化的具有gdhA基因的DNA片段混合，并使用T4连接酶连接以获得质粒pMWCPG，与pMWCP相比其还含有gdhA基因(图6)。
同时，具有宽宿主范围的质粒RSF1010的复制起点的质粒pVIC40(日本专利未审公开No.8-047397)用NotI消化，用T4 DNA聚合酶处理和用PstI消化。pBR322用EcoT14I消化，用T4 DNA聚合酶处理和用PstI消化。将两产物混合，并通过使用T4连接酶连接，以获得具有RSF1010的复制起点和抗四环素基因的质粒RSF-Tet(图7)。
接着，将pMWCPG用EcoRI和PstI消化，且具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的DNA片段被纯化和回收。RSF-Tet被类似地用EcoRT和PstI消化，且具有RSF1010的复制起点的DNA片段被纯化和回收。将这两个产物混合，并使用T4连接酶连接以获得质粒RSFCPG，与RSF-Tet一样含有gltA基因、ppc基因和gdhA基因(图8)。可以确定得到的质粒RSFCPG基于对源自大肠杆菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因缺陷菌株的缺陷补充和测量各酶的活性，表达了gltA基因、ppc基因和gdhA基因。(ii)具有源自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒的制备具有源自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒如下构建。通过使用引物DNA和将谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板进行PCR，以获得约3kb的gltA基因片段，所述的引物DNA是基于谷氨酸棒杆菌gltA基因的核苷酸序列制备的(微生物学，140，第1817-1828页(1994))。该片段插入用SmaI消化的质粒pHSG399(购自Takara Shuzo Co.，Ltd)以获得质粒pHSGCB(图9)。接着，用HindIII消化pHSGCB，将切除的约3kb的gltA基因片段插入用HindIII消化的质粒pSTV29(购自Takara Shuzo Co.，Ltd)，以获得质粒pSTVCB(图9)。通过测量成团肠杆菌AJ13355菌株的酶活性可以确定获得的质粒pSTVCB表达了gltA基因。(iii)将RSFCPG和pSTVCB引入SC17 sucA菌株通过电穿孔将成团肠杆菌SC17 sucA菌株用RSFCPG转化以获得显示出四环素抗性的转化株SC17 sucA/RSFCPG菌株。而且，通过电穿孔将SC17 sucA/RSFCPG菌株用pSTVCB转化以获得显示出氯霉素抗性的转化株SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。<5>获得在低pH环境中改善了对L-谷氨酸抗性的菌株从成团肠杆菌SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株分离出在低pH环境中改善了对高浓度L-谷氨酸抗性的菌株(以后，也称为在低pH下具有高浓度Glu-抗性的菌株)。
将SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株在30℃在LBG培养基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母浸出物、10g/L的NaCl、5g/L葡萄糖)过夜培养，并将用盐水洗涤的细胞适当稀释，并接种于M9-E培养基平板(4g/L葡萄糖、17g/L的Na2HPO4·12H2O、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4Cl、10mM的MgSO4、10μM的CaCl2、50mg/L的L-赖氨酸、50mg/L的L-蛋氨酸、50mg/L的DL-二氨基庚二酸、25mg/L的四环素、25mg/L的氯霉素、30g/L的L-谷氨酸，用氨水调节pH为4.5)。在32℃培养2天之后得到产生的菌落，作为在低pH下具有高浓度Glu抗性的菌株。
对于获得的菌株，在M9-E液体培养基中测定其生长水平，而在含5ml的L-谷氨酸制备试验培养基的50ml大试管中测试L-谷氨酸的制备能力，所述的培养基含40g/L葡萄糖、20g/L的硫酸铵、0.5g/L的七水硫酸镁、2g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的氯化钠、0.25g/L的二水氯化钙、0.02g的七水硫酸亚铁、0.02g/L的四水硫酸锰、0.72mg/L的二水硫酸锌、0.64mg/L的五水硫酸铜、0.72mg/L的六水氯化钴、0.4mg/L的硼酸、1.2mg/L的二水钼酸钠、2g/L的酵母浸出物、200mg/L的L-盐酸赖氨酸、200mg/L的L-蛋氨酸、200mg/L的DL-α，ε二氨基庚二酸、25mg/L的盐酸四环素和25mg/L的氯霉素。展示出最佳生长水平和与其亲株具有同样的L-谷氨酸制备能力的菌株，即SC17/RSFCPG+pSTVCB菌株被指定为成团肠杆菌AJ13601。AJ13601菌株于1999年8月18日被保藏在国立生命科学和人类技术研究所，工业科学和技术机构，国际贸易和工业部(现为国际专利生物保藏单位，国立高级工业科学和技术研究所，Central 6，Higashil-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本)且收到的保藏号是FERM P-17516。接着根据布达佩斯条约的有关条款，在2000年7月6日被转为国际保藏，且收到的保藏号是FERM BP-7207。
如上所述培养的60ml培养液被接种进300mL含50g/L葡萄糖、5g/L的硫酸铵、0.4g/L的七水硫酸镁、5g/L的磷酸二氢钾、20mg/L的七水硫酸亚铁、20mg/L的五水硫酸锰、6g/L的酵母浸出物、800mg/L的L-盐酸赖氨酸、600mg/L的DL-蛋氨酸、600mg/L的DL-α，ε二氨基庚二酸、1.5g/L的氯化钠、0.75g/L的二水氯化钙、25mg/L的盐酸四环素和25mg/L的氯霉素的主要培养基，在1L发酵罐中在34℃，pH6.0下进行培养。当L-谷氨酸积聚时，发酵开始约1或2小时后，pH自发降低到pH4.5。之后通过添加氨气将培养物pH调节为4.5。在初始添加的葡萄糖被消耗之后，以6ml/hr的速率将700g/L的葡萄糖水溶液连续添加。
当如上所述继续产生L-谷氨酸发酵产物时，在培养开始之后约14小时，积聚在培养液中的L-谷氨酸浓度是约45至55g/L。
与此同时，将α-结构或β-结构的L-谷氨酸晶体以干晶体的形式从发酵罐的上部添加进培养液中，其量为0.008至1.0g(在培养开始，相对于培养基的量是0.022至2.778g/L)，且继续进行培养，在培养开始之后的36小时终止。在发酵罐中有大量的L-谷氨酸晶体沉淀。通过倾泻将晶体分离，并在室温下干燥过夜。得到的干晶体的晶体结构(晶格结构)通过X-射线粉末衍射法进行研究。结果示于表1。在培养期间没有晶体添加的对照试验的结果也示于表1。
从表1所示的结果发现当添加晶体时培养结束时的L-谷氨酸的积聚量与没有添加一点晶体时相比提高了。
另外，发现如果添加的是α-结构谷氨酸晶体，则α-结构的L-谷氨酸晶体沉淀的比例提高了。特别是发现如果添加的晶体的量是0.2g/L或更多，则在培养基中沉淀的α-结构的L-谷氨酸晶体具有良好的再现性。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>制备L-谷氨酸的方法<140>JP 2001-44136<141>2001-02-20<160>8<210>1<211>935<212>PRT<213>成团肠杆菌<400>1Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10 15Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr20 25 30Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu35 40 45Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu50 55 60Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val65 70 75 80Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile85 90 95Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu100 105 110Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His115 120 125Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe130 135 140Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu145 150 155 160Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn165 170 175Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala180 185 190Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu195 200 205Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro210 215 220Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met225 230 235 240Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val245 250 255Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val260 265 270Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His275 280 285Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser290 295 300Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe305 310 315 320Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val325 330 335Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu340 345 350Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val355 360 365Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly370 375 380Thr Val Arg Ile Val Ile ASn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn385 390 395 400Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met405 410 415Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val420 425 430Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg435 440 445Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu450 455 460Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys465 470 475 480Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu485 490 495Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg500 505 510Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met515 520 525Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp530 535 540Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala545 550 555 560Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val565 570 575Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala580 585 590Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp595 600 605Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr610 615 620Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr625 630 635 640Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val645 650 655Trp ASp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly660 665 670Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe675 680 685Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser690 695 700Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu705 710 715 720Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu725 730 735Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val
740 745 750Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu755 760 765Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu770 775 780Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser785 790 795 800Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val805 810 815Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu820 825 830Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu835 840 845Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala850 855 860Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn865 870 875 880Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro885 890 895Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro900 905 910Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val915 920 925Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn930 935<210>2<211>407<212>PRT<213>成团肠杆菌<400>2Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala1 5 10 15Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser20 25 30Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu35 40 45Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu50 55 60Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly65 70 75 80Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr85 90 95Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp100 105 110Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp115 120 125Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu130 135 140Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala145 150 155 160Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg165 170 175Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu
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1.一种通过发酵制备L-谷氨酸的方法，其中包括在液体培养基中培养具有L-谷氨酸制备能力的微生物，该培养基的pH被调节至使通过微生物产生的L-谷氨酸沉淀的条件，以便使L-谷氨酸产生和积聚并伴随着L-谷氨酸的沉淀，其中当培养基中的L-谷氨酸浓度低于发生自发结晶的浓度时，进行使培养基中出现L-谷氨酸晶体的操作。
2.根据权利要求1的方法，其中使培养基中出现L-谷氨酸晶体的操作是添加L-谷氨酸晶体。
3.根据权利要求2的方法，其中晶体是α-晶体。
4.根据权利要求3的方法，其中添加到培养基中晶体的量是0.2g/L或更多。
5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中微生物属于肠杆菌属。
6.根据权利要求5的方法，其中微生物是成团肠杆菌。
7.根据权利要求1至6任一项的方法，其中微生物可以代谢含饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中的碳源，且该培养基处于特定的pH下，且该微生物具有积聚L-谷氨酸的量超过该pH下液体培养基中L-谷氨酸饱和浓度的能力。
8.根据权利要求7的方法，其中特定的pH是5.0或更低。
全文摘要
一种通过发酵制备L－谷氨酸的方法，其中包括在液体培养基中培养具有L－谷氨酸制备能力的微生物，该培养基的pH被调节至使通过微生物产生的L－谷氨酸沉淀的条件，以便使L－谷氨酸产生和积聚并伴随着L－谷氨酸的沉淀，其中当培养基中的L－谷氨酸浓度低于发生自发结晶的浓度时，进行使培养基中出现L－谷氨酸晶体的操作。
文档编号C12R1/01GK1408878SQ0210803
公开日2003年4月9日 申请日期2002年2月20日 优先权日2001年2月20日
发明者上田洋, 香田隆之, 佐藤雅一 申请人:味之素株式会社