专利名称：产氢工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及产氢工程菌及其应用。
背景技术：
十八世纪世界工业革命以来建立的化石能源体系如今正面临着两大挑战1) 化石能源储量日益减小，面临着枯竭的危险；2)化石燃料的燃烧产生了大量污染 物质，特别是C02等温室气体的排放引起的温室效应，给人类赖以生存的环境带来巨 大的威胁。因此，开发可持续发展的可再生清洁能源，逐步替代化石能源是关系国 家能源安全、环境安全及社会稳定和平发展的重要战略课题。
氢能作为极具潜力的未来替代清洁能源之一，是高效的能源载体，具有能量密 度高、清洁、可再生、燃烧产物为水和无污染等特点，是十分理想的可再生能源。 目前，氢气主要来自化石燃料的重整转化(占氢气来源的96%)和电解水制氢(占4 %)，未能摆脱对原有的化石能源的依赖。因此，如何利用可再生资源持续地获取 氢气受到人们的广泛的关注。生物制氢是解决这一问题的重要途径之一。生物制氢 具有常温常压反应、条件温和、对环境友好、可利用废弃生物物质为底物等优点， 可以和环境污染治理、减少污染排放相联系，是十分理想的制氢方法。
现代生物制氢的研究始于20世纪70年代的能源危机，90年代以来，随着人们对 温室效应的进一步认识，生物制氢作为可持续发展的制氢方法更加引起了人们的广 泛重视。生物制氢技术包括光驱动过程和厌氧发酵两种路线。前者利用光合细菌或 藻类直接将太阳能转化为氢气，是一个非常理想的过程，但是由于光利用效率很低， 光反应器设计困难等因素，近期内很难推向应用。后者采用的是产氢菌厌氧发酵， 它的优点是产氢速度快、反应器设计简单、且能够和废弃生物的利用相结合，相对 于前者更容易在近期内实现工业应用。
发酵法制氢始于六十年代中期，九十年代受到重视，但进展并不大。九十年代 末到本世纪初，人们意识到发酵制氢更容易在近期内实现产业化，大大增加了暗发 酵制氢方面的科研投入，产生了一批有关培养工艺的基础性研究结果。近年来与废 弃生物质处理相结合的制氢过程的研究大为增加，其中一些达到了中试水平，但主 要集中在反应器类型设计、工艺研究上，且混合培养产氢效率低于纯培养，总的转 化率都不高，这也正是发酵制氢的瓶颈所在。解决发酵制氢瓶颈的关键，是实现技术突破，提高氢气得率。研究表明，仅从工艺的角度，无法从根本上突破产氢效率 低的问题，必须注重高效产氢菌种的研究与开发。
多年以来，暗发酵制氢中应用的产氢菌种主要包括肠杆菌属G^"ro/^"er)、 梭菌属(C7as^^Vi咖)、埃希氏菌属(^^e/^c力j's)和芽孢杆菌属(Saci""s)，其中 尤以肠杆菌属和梭菌属的相关研究最多。梭菌属产氢率最高可达到2. 36mol/raol葡 萄糖，产气肠杆菌属产氢率最高可达3mol/mol葡萄糖(即6 mol/mol蔗糖)[K咖ar， N, and Das， D. Bioprocess Engineering 23, 205-208 (2000)]， [K咖ar， N. and Das， D. Process Biochemistry 35， 589—593 (2000)]。以梭菌(67asz^ric^"/z7印) 为代表的专性厌氧菌发酵产氢的机理为葡萄糖酵解后生成丙酮酸，在形成醋酸过 程中， 一部分电子通过铁氧还蛋白在氢酶作用下形成氢气。 一摩尔的葡萄糖可形成 4摩尔氢气和2分子醋酸。因此，专性厌氧菌发酵产氢的同时，必然伴随醋酸等有机 酸的形成。兼性厌氧产氢菌A ae/Y^6v e5dl过糖解途径和三羧酸循环(TCA)途径产 生NADH和ATP，氢酶通过NADH将质子转换为氢气，产氢理论转换率为l摩尔葡萄糖形 成12mol氢气，远远大于专性厌氧菌的氢得率。因此，￡ 3eroge"es是开发高效发酵 制氢工艺的重要菌种。
随着生物技术的飞速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足提高 产氢效率的需求。发酵制氢的研究需要进入细胞内部，通过对氢酶及其代谢网络的 改造来强化产氢过程。目前在基因库上已经可以获得超过100种的氢酶基因序列 [Paulette M. Vignais, Bernard Billoud， Jacques Meyer. FEMS Microbiology Reviews 25， 455-501(2001)]，但仍有大量已知产氢菌株的氢酶基因尚未被克隆， 寻找更多的氢酶基因是生物制氢研究的重要方向[Kalia， V.C.， Lai, S. ， Ghai， R.， Mandal， M. and Chauhan， A. Trends in Biotechnology 21， 152-156 (2003)]。 不同的氢酶具有不同的功能，和其它酶系相比，人们对氢酶的认识还十分有限。
目前，研究的比较清楚的是大肠杆菌的氢酶I、 II、 III和IV的基因，它们都 属于Ni-Fe氢酶，其中氢酶III和IV和产氢有关[Andrews, S. C. ， Berks, B.C., Mcclay， J". ， Ambler, A. ， Quail, M. A. ， Golby， P. and Guest, J. R. Microbiology 143， 3633-3647 (1997)]，而I、 II和吸氢过程相关。梭菌属的氢酶都属于铁氢酶， 三梭菌的铁氢酶已有测序结果，但是关于其附属基因、调控机制还不清楚。己经克 隆到梭菌的铁氢酶基因，并在光合细菌内获得了异源表达，强化了光合菌的产氢过 程。梭菌的铁氢酶基因在大肠杆菌中的表达却没有成功，可能是由于梭菌和大肠杆
5菌对于铁氢酶表达的附属基因系统不相同造成的[Yasuo Asada， Yoji Koike, Jorg Schnackenberg, Masato Miyake， Ieaki Uemura, Jun Miyake. Biochimica et Biophysica Acta 1490， 269-278 (2000)]。最近，Mishra J.等通过铁氢酶保守序 列设计的方法从E c7朋cae IIT-BT08中克隆出450bp左右的铁氢酶，并在不产氢的 大肠杆菌中异源表达，验证了其功能，结果显示这个氢酶位于细胞质内[Mishra, J., K咖ar， N. , Ghosh， A. K. and Das, D. International Journal of Hydrogen Energy 27,1475-1479 (2002) ]， [Mishra, J. ， Khurana, S. ， Kumar， N., Ghosh， A. K. and Das， D. Biochemical and Biophysical Research Communications 324， 679-685 (2004)]。产气肠杆菌Aserog朋es的前期研究表明，在其细胞膜上，氢酶与细胞内 产生的NADH作用生成氢气[Nakashimada， Y. ， Rachman， M. A. ， Kakizono， T. and Nishio， N. International Journal of Hydrogen Energy 27, 1399-1405 (2002)]。 因此研究该菌属的氢酶特性、基因及其功能解析，对于实现提高产气肠杆菌产氢得 率的技术突破具有重要意义。
对大肠杆菌产氢过程的研究表明，大肠杆菌可直接利用甲酸，也可以在同化糖 类物质代谢过程中产生的甲酸为底物，在甲酸裂解酶系的作用下，分解甲酸生成C02 禾服2。 [Akihito Yoshida， Taku Nishimura, Hideo Kawaguchi， 1 Masayuki Inui, and Hideaki Yukawa*. Appl Environ Microbiol. 71:6762 - 6768(2005)]。甲酸产氢 途径是产氢速度最快的途径。
产气肠杆菌是兼性厌氧菌，生长速度快，在厌氧条件下可以产生氢气，且具有 利用底物范围广，生长适应性强等优点，是具有优良工业性状的菌株。已有许多关 于产气肠杆菌产氢的报道，但多是在工艺及培养方面[E. Palazzi, B. Fabiano， P. Perego. Bioprocess Eng. 22:205 - 213(2000).]，有关产氢相关的基因还没有 任何报道。研究表明，产气肠杆菌具有和大肠杆菌相似的利用甲酸产氢的能力 [Tatsuo， K. ， Shigeharu， T. Mar Biotechnol. 7:112 - 118(2005).]，而且其具有 吸氢过程，即有吸氢酶的存在[Y. L Ren. ， X. H. Xing. ， C. Zhang. ， and Z. X. Gou. Biotechnol Lett. 27 (14) : 1029-1033 (2005).]。因此克隆产气肠杆菌利用甲酸途 径产氢的基因及吸氢酶基因，对理解其利用甲酸产氢和耗氢的过程，从而利用甲酸 途径生物制氢具有重要的意义。克隆甲酸氢酶基因和吸氢酶基因也是对氢酶基因家 族有益的补充。 发明内容本发明的目的是提供产氢工程菌及其应用。 本发明提供的产氢工程菌，是如下a)或b)的工程菌
a) 灭活A 3erog朋es IAM1183中的AhybO蛋白得到的工程菌；
b) 灭活A 3&ro《e/ e5" IAM1183中的Ahyb0蛋白和AhycA蛋白得到的工程菌； 所述AhybO蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列l;所述AhycA蛋白的氨基酸
序列是序列表中的序列4。
所述灭活《3erog朋es IAM1183中的Ahyb0蛋白可通过将DNA片段Q导入所述 A朋rogOT" IAM1183中实现；所述DNA片段Q自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片 段N、同源臂L;所述同源臂T,和同源臂T2能与所述AhybO蛋白的编码基因发生同源 重组，灭活所述AhybO蛋白；所述DNA片段N为抗生素抗性片段。
所述AhybO蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列2;所述同源臂Ti
的核苷酸序列是序列表中的序列7;所述同源臂T2的核苷酸序列是序列表中的序列8;
所述DNA片段N为四环素抗性片段。
所述DNA片段Q的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3。
所述灭活E aerog朋es IAM1183中的AhybO蛋白和AhycA蛋白可通过将DNA片段 P和DNA片段Q导入所述A aeroge/ es IAM1183中实现；实际操作中，DNA片段P和DNA 片段Q的导入可采取任意先后的顺序，如先导入DNA片段P，筛选得到重组菌后再在 重组菌中导入DNA片段Q;
所述DNA片段P自上游至下游依次为同源臂T3、 DNA片段M、同源臂1;所述同源 臂T3和同源臂T4能与所述AhycA蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述AhycA蛋 白；所述DNA片段M为抗生素抗性片段；
所述DNA片段Q自上游至下游依次为同源臂T,、 DNA片段N、同源臂T2;所述 同源臂T,和同源臂L能与所述AhybO蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述A hybO蛋白；所述DNA片段N为抗生素抗性片段。
所述AhybO蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列2;所述同源臂L
的核苷酸序列是序列表中的序列7;所述同源臂T2的核苷酸序列是序列表中的序列8;
所述DNA片段N为四环素抗性片段；所述AhycA蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列 表中的序列5;所述同源臂T3的核苷酸序列是序列表中的序列9;所述同源臂T4的核 苷酸序列是序列表中的序列10;所述DNA片段M为卡那霉素抗性片段。
所述DNA片段Q的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3;所述DNA片段P的
7核苷酸序列具体可为序列表中的序列6。
本发明还保护一种DNA片段Q， DNA片段Q自上游至下游依次为同源臂T" DNA片段 N、同源臂T2;所述同源臂L和同源臂T2能与Eaer^e朋sI細1183的AhybO蛋白的编 码基因发生同源重组，灭活AhybO蛋白；所述AhybO蛋白的氨基酸序列是序列表中 的序列l;所述DNA片段N为抗生素抗性片段。
所述AhybO蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列2;所述同源臂L
的核苷酸序列是序列表中的序列7;所述同源臂T2的核苷酸序列是序列表中的序列8;
所述DNA片段N为四环素抗性片段。
所述DNA片段Q的核苷酸序列最优选为序列表中的序列3。
含有所述DNA片段Q的表达盒或重组表达载体或转基因细胞系或重组菌均属于 本发明的保护范围。
本发明以产气肠杆菌A aer收朋es为出发菌株，通过对产气肠杆菌￡ aero《e/ " 中的产氢相关蛋白编码基因进行灭活，获得了两株甲酸途径产氢能力提高的菌株， 可应用于生物制氢，对生物制氢具有巨大的指导意义。
本发明获得的工程菌具有以下优点
1) 出发菌株Aaerc^e/2esIAM1183是兼性厌氧菌，在好氧、厌氧条件下均能快 速生长，对环境适应性强；利用其进行生物制氢具有利用底物范围广、利用底物能 力强和产氢较高的优点，是具有潜在应用于工业化制氢的优良菌株。
2) 本发明获得的工程菌￡ 3e/"ge/7" IAM1183-0和工程菌A aerog朋es IAM1183-AO，除了具有原始菌l)的优点外，还具有底物利用能力更强，产氢能力 进一步提高的特点，尤其是A aeroge/ " IAM1183-A0。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为工程菌A aer塔e/ as IAM1183-0的单抗和双抗筛选图
图2为工程菌￡ ser^朋es IAM1183-0的PCR鉴定图
图3为工程菌￡ seroge/ es IAM1183-A的单抗和双抗筛选图
图4为工程菌A aerow/ " IAM1183-A的PCR鉴定图
图5为工程菌￡ seroge/ es IAM1183-A0的PCR鉴定图
图6工程菌的生长曲线0D6。。
图7工程菌生长过程中的pH变化图8工程菌的H2生成分析
图9工程菌的C02生成分析
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用到的引物如下
hycA-Km-fw: CTGCA ATTCGCTGGT TCAGGGCATC ACCCTGTCAA AAGCG
ATAGGCTCCGCCCCCCTGA; hycA-Km-rv: GGCTTAAATCCACCGGCTGGTCGTGTTCCATGGCGTCATA
CAGGTGGCAC TTTTCGGGG; HybO-tet-fw: AATCTCTGCTTCGTGCAACGCATCCAACGGTAGAAAACCT
TTTGGTGACTGCGCTCCTC; HybO-tet-rv: GATACCTTCT TCGTTACAGC CATAGCAAGG GTGACCAATC
TGTTGTTGCTCAGGTCGCA; hycA-fw: CTGCAATTCGCTGGT TCAGGGCATC; hycA-rv: GGCTTAAATCCACCG GCTGGTCGTG; hybO-fw: AATCTCTGCT TCGTGCAACGCATC; hyb0-rv: GATACCTTCT TCGTTACAGCCATA。 以下实施例中所涉及的培养基配方及用途如下
(1) LB培养基(l/'):蛋白胨10g、酵母浸粉5g、 NaCl 10g、琼脂粉15g (固体
培养基时添加)；用于菌种短期保藏和活化培养。
(2) 葡萄糖培养基(L—1):葡萄糖15g、蛋白胨5g、 K2HP04 3H20 14g、 KH2P04 6g、 (NH4)2S04 2g、 MgS04'7H20 0. 2g;用于发酵制氢。
实施例1、产气肠杆菌￡ ae^ra《朋es I細l 183-0的获得
出发菌株产气肠杆菌U". 3eiY^e"es IAM1183)购自日本东京大学应用微生物研 究所(IAM)菌种库。
对NCBI中的产气肠杆菌基因序列(Genbank NO: EF601126)进行序列分析， 设计一对引物HybO-tet-fw和Hyb0-tet-rv，序列如下
HybO-tet-fw:
5， -AATCTCTGCTTCGTGCAACGCATCCAACGGTAGAAAACCTTTTGGTGACTGCGCTCCTC-3，; HybO-tet-rv:引物中的带划线的序列为产气肠杆菌(A se/Y^e^es IAM1183)中AA7/^基因的 同源序列。
通过电转化的方式将pYM-red质粒(于梅，周建光，陈伟，李山虎，黄翠芬， 一种可转移的重组工程系统pYM-Red的建立.生物化学与生物物理进展.2005， 32
(4).)电击到产气肠杆菌aeroge/ es IAM1183中，进行氯霉素(24mg/mL)抗 性筛选，从阳性菌株中提取pYM-red质粒进行鉴定，获得了含有pYM-red重组质粒的 产气肠杆菌(A aero^wes IAM1183)。
以pACYC184质粒(Chang, A. C., and S. N, Cohen. 1978. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic rainiplasmid. J. Bacteriol. 134:1141 - 1156.)賺为模板， 用引物HybO-tet-fw和HybO-tet-rv进行PCR扩增，获得含有四环素标记的线性 DNA，将该线性DNA作为打靶载体。通过电转化的方式，将打耙载体导入含有pYM-red 质粒的产气肠杆菌(A aer收朋es 1細1183)。
将转化后的菌涂布于含有的四环素(4ug/ml)的单抗LB平板上，3(TC培养培 养l天；然后将长出的菌转接入含有四环素(4 ug/ml)和氯霉素(24 ug/ml)的 双抗LB平板上，3(TC培养培养1天。单抗和双抗筛选的结果见图1，图1中左图为 单抗筛选的图，右图为双抗筛选的图。
随机挑取几个双抗培养基上生长的克隆，提取基因组DNA，通过PCR的方法鉴 定打靶载体是否与染色体上的目标位点发生了同源重组，PCR反应所用的一对引物 为hyb0-fw和hyb0-rv, hyb0-fw和hyb0-rv的序列如下
hyb0-fw 5， - AATCTCTGCT TCGTGCAACG CATC-3，；
hyb0-rv 5, - GATACCTTCT TCGTTACAGC CATA -3，。
PCR鉴定结果见图2，图2中，1: DNA 2000 marker ; 2: ￡ ser0欲/7es I AMI 183-0。 由图可见，Aaer0ge/7es IAM1183-0的扩增产物获得了 1800 bp目标带，与预期结 果一致。结果表明，获得的克隆中，打靶载体与染色体上的目标位点发生了同源重 组。将发生了同源重组的突变型菌株命名为冗36ro^y ^ IAM1183-0。
实施例2、产气肠杆菌A ae2Y^e/7es IAM1183-A的获得
出发菌株产气肠杆菌(￡ ae/Y^e/7" IAM1183)购自日本东京大学应用微生物研 究所(I雄)菌种库。对NCBI中的产气肠杆菌基因序列(Genbank NO: EF601125)进行序列分析， 设计一对弓l物hycA-Km-fw禾口 hycA-Km-rv， hycA-Km-fw禾口 hycA-Km-rv的序歹ij如下 hycA-Km-fw:
hycA-Km-rv:
引物中的带划线的序列为产气肠杆菌(Aaerc^朋^IAM1183)zyu^4的同源臂。 通过电转化的方式将pYM-red质粒(于梅，周建光，陈伟，李山虎，黄翠芬， 一种可转移的重组工程系统pYM-Red的建立.生物化学与生物物理进展.2005， 32
(4).)电击到产气肠杆菌(￡ aeroge/2es I扁1183中，进行氯霉素(24rag/mL)抗 性筛选，从阳性菌株中提取pYM-red质粒进行鉴定，获得了含有pYM-red重组质粒的 产气肠杆菌(￡ aeroge/7es IAM1183)。
以pET28a质粒DNA为模板，用引物hycA-Kra-fw和hycA-Km-rv进行PC財广增，获得 含有卡那霉素标记的线性DNA，将该线性DNA作为打靶载体。通过电转化的方式，将 打靶载体导入含有pYM-red重组质粒的产气肠杆菌U aero^^es IAM1183)。将转化 后的菌涂布于含有卡那霉素(50rng/mU的单抗LB平板上，3(TC培养培养1天；然后 将长出的菌转接入含有卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(30mg/mL)的双抗LB平板上， 3(TC培养培养1天。单抗和双抗筛选的结果见图3，图3中左图为单抗筛选的图，右 图为双抗筛选的图。
随机挑取几个双抗培养基上生长的克隆，提取基因组DNA，通过PCR的方法鉴 定打靶载体是否与染色体上的目标位点发生了同源重组，PCR反应所用的一对引物 为hycA—fw禾口 hycA—rv， hycA—fw禾口 hycA—rv的序歹U如下
hycA-fw: 5， -CTGCAATTCGCTGGTTCAGGGCATC-3';
hycA-rv: 5， -GGCTTAAATCCACCGGCTGGTCGTG-3'。
PCR鉴定结果见图4，图4中，1: ￡ aerogey es IAM1183-A; 2: ￡犯r^e/7" IAM1183 (对照)；3: DNA 2000 marker。由图可见，￡ ae/Y^e/ es IAM1183-A的扩 增产物获得了 1700 bp目标带；￡ ae^^朋es IAM1183的扩增产物获得了 550 bp 的条带，与预期结果一致。结果表明，获得的克隆中，打耙载体与染色体上的目标 位点发生了同源重组。将发生了同源重组的突变型菌株命名为A ser^"朋es IAM1183-A。实施例3、产气肠杆菌￡ aarograes IAM1183-AO的获得
以Eaeix^e"es IAM1183-0为出发菌株，灭活Z^yd蛋白(方法同实施例2); 或以Eaez^朋es IAM1183-A为出发菌株，灭活zy yc趣白(方法同实施例l)，均 可以获得突变株A aeroge/ e5" IAM1183-A0。以下以￡ serc^e/ es IAM1183-A为出发 菌株，构建￡ aeroge"es IAM1183-A0。
以pACYC184质粒DNA为模板，用引物HybO-tet-fw和HybO-tet-rv进行PCR 扩增，获得含有四环素标记的线性DNA，将该线性DNA作为打靶载体。通过电转化 的方式，将打靶载体导入含有pYM-red质粒的产气肠杆菌￡ 3erog朋es IAM1183-A。 将转化后的菌涂布于含有卡那霉素(50mg/mL)和四环素(4mg/mL)的双抗LB平板 上，3(TC培养培养1天。
随机挑取几个双抗培养基上生长的克隆，提取基因组DNA，通过PCR的方法鉴 定打靶载体是否与染色体上的目标位点发生了同源重组，PCR反应所用的一对引物 为hyb0-fw和hyb0-rv， hybO-fw和hybO-rv的序列如下
hybO-fw 5， - AATCTCTGCT TCGTGCAACG CATC-3';
hybO-rv 5， - GATACCTTCT TCGTTACAGC CATA -3，。
PCR鉴定结果见图5，图5中，1: DNA 2000 marker ; 2: A se/Y^ev " IAM1183-A0。 由图可见，￡ ae/Y^e"es IAM1183-AO的扩增产物获得了 1800 bp目标带，与预期结 果一致。结果表明，获得的克隆中，打靶载体与染色体上的目标位点发生了同源重 组。将发生了同源重组的突变型菌株命名为Aaero^ 77es IAM1183-A0。
实施例4、工程菌的产氢性能及生理特性测定
在不同的70mL血清瓶中，分别装20mL葡萄糖培养基，分别将活化后的工程菌 A. aer收e"es IAM1183-0和工程菌￡ aer收e"es 1颜1183-A0进行摇瓶培养，同时将 活化后的野生菌进行同样条件摇瓶培养，作为对照。具体操作步骤如下.-
(1) 种子培养采用15ml离心管，LB培养基装液量5ml，从固体平板接种， 培养温度37"C，空气浴摇床转速170rpm，过夜培养。
(2) 厌氧摇瓶培养采用70ml血清瓶厌氧培养瓶，葡萄糖培养基装液量20ml (预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)；种子菌的接种量2.5% (v/v)，
培养温度37。C，空气浴，摇床转速170rpm。培养24小时。
试验设三次重复，所有结果均为三次重复的平均值，用平均值士标准差表示。 分别收集工程菌和野生菌产生的气体，利用注射器测定生成的气体量；利用分光光度计(UV-1206, SHIMADZU公司(日本))测定菌体的生长情况；利用pH计 (CHN060(828)， ORION公司(美国))测定pH的变化情况。工程菌和野生菌的0"。。的 变化见图6，工程菌和野生菌的培养液的pH变化见图7，工程菌和野生菌的氢气生成 情况见图8，工程菌和野生菌的C02生成情况图9。
工程菌和野生菌的最大比生长速率和菌体最大产氢速率比较见表1。
表1最大生长速率和产氢速率(『3)
菌株最大生长速率(h—')最大产氢速率(ml , h—' 0Du it I—')
￡ aero《e/7es IAM11830. 523±0. 034300. 89 ±15. 34
￡ ae/Y^e; es IAM1183-00. 381±0. 013356. 01 ±13. 25
IAM1183-A00. 359±0. 002436. 98±4. 39
以上结果表明，经过12 h的批式培养后，野生菌的细胞密度达到最高(0De。。为
2.26)，而在产氢最快的对数生长期中，两株工程菌的细胞密度均比野生菌高。氢 气是与细胞生长偶联的初级代谢产物，在对数生长期时2株工程菌也表现出较高的 产氢速率，并且最终氢气产量也较高，分别达到76. 8 mM和83. 0 mM。 3株菌的pH变 化趋势是一致的，均在发酵过程中产酸而使发酵液呈酸性，pH从初始值6.9下降到 4. 7-4. 9之间。工程菌￡ ae2》g朋es IAM1183-0和￡ serog朋es IAM1183-A0在对数生 长期的pH下降速率要略快于野生菌，这和它们在对数生长期的高增值速率是相关 的。工程菌￡ 3erc^朋a IAM1183-A0的二氧化碳产量要明显低于其它两株菌。将2 株工程菌的最大比生长速率和最大产氢速率并与野生菌进行比较，野生菌的最大比 生长速率高于2株工程菌，达0. 523 h—'，而工程菌￡ aero《e/ es IAM1183-A0的最大 比生长速率最低，为0.523 h—'。最大产氢速率反映的是单位细胞单位时间的氢气最 高产出量，与野生菌相比，2株工程菌的菌体最大产氢速率均有一定程度的提高， 分别是野生型的l. 18和1.45倍。
实施例5、工程菌的代谢流分析
分别检测野生菌和工程菌细胞内各代谢通量的分布，具体步骤如下
(1) 种子培养釆用15ml离心管，LB培养基装液量5ml，从固体平板接种菌， 培养温度37i:，空气浴摇床转速170rpm，过夜培养。
(2) 厌氧摇瓶培养采用70ml血清瓶厌氧培养瓶，葡萄糖培养基装液量20ml (预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)；种子菌的接种量2.5% (v/v)，
培养温度37。C，空气浴摇床转速170rpm。培养16小时。
(3) 厌氧摇瓶培养16h后对代谢产物进行检测。将发酵物离心取上清后，过滤。利用高压液相色谱测定代谢物的产量和组成。高压液相气谱为(HPLC-10A ， SHIMADZU 公司(日本)。具体检测方法如下10ml样品在12000rpm， 4"离心5分钟，取上 清冻存于-8(TC冰箱直至测量。采用高效液相色谱(HPLC)测定葡萄糖、乳酸、琥 珀酸、甲酸、乙酸、2,3-丁二醇和乙醇的浓度。
分析方法及条件色谱柱选用岛津Shim-pack SCR-102H，基质为PS/DVB，功 能基为-S03H。该柱尺寸为300mm (长度)X8mra (内径)，粒径为7ura。色谱分 析条件如下柱温40 °C，流动相5mM高氯酸，流速1. Oml min—1;示差检测器(RID); 样品进样量20ix 1。采用岛津公司提供的HPLC计算机控制软件CLASS-VP工作站进 行数据的分析处理。
实验重复三次，实验结果如表2所示。表2中的数据为平均值士标准差。
表2代谢流分析(n4)
代谢终产物代谢终产物产量(mol mol_1 glucose)
IAM1183IAM1183-0I雄1183-AO
氢气1. 16±0. 041.27±0. 041. 36±0. 01
二氧化碳0. 80±0. 120. 86±0. 020. 54±0. 04
2, 3-丁二醇0. 04±0. 010. 05 ±0. 000. 05 ±0. 00
乳酸1. 24±0. 171. 24±0. 021. 48±0. 03
乙酸0. 31±0. 040. 37±0. 010. 40±0. 01
琥珀酸0. 02±0.010. 03 ±0. 000. 03±0. 01
乙醇0. 34±0. 010. 41±0. 010. 43±0. 01
生物量0. 07±0.000. 07±0. 000. 05±0. 00
碳的衡算(%)106±13113±2119±4
结果表明，2株工程菌的氢气对葡萄糖的得率分别达到1. 27和1. 36mol-氢气 mol-葡萄糖—、均高于野生菌的相应值(1. 16mol-氢气'mo1-葡萄糖—')。这说明 对ZUyc力的灭活和对Z^j^"勺灭活都能有效地增加产氢代谢途径的通量，从而提高 细胞产氢得率。与此同时，上述基因修饰对其它代谢产物的分布也有一定的影响。 2， 3-丁二醇、乳酸、琥珀酸和乙醇都是依赖胞内NADH而产生的代谢产物，与野生 菌相比，这些物质的得率在2株工程菌中均有所增加，显示出胞内可利用的还原力 的增加，而这是有利于产氢的一个重要条件。2株工程菌的乙酸和乙醇产量之和均 比野生型菌株有一定幅度的提高，表明甲酸产氢途径在产氢过程中被强化，这也达
14到了甲酸脱氢酶负调控基因灭活预期的效果。
试验表明，对靶基因的灭活会引起胞内相应酶活性的变化，进而改变代谢通量， 增加目标产物的产量。本发明所获得的基因工程菌株具有较高的产氢能力，可应用 于发酵制氢。序列表
<110>清华大学 〈120〉产氢工程菌及其应用
〈130〉CGGNARY81442
<160> 10
<210〉 1
〈211〉 263
<212> PRT
〈213> 产气肠杆菌(￡ 3eroge"es)
〈400〉 1
Val lie 1
Leu Arg
Trp Ala
lie Gly Ala Gin Glu Cys Thr Gly Cys Thr Glu Ser Leu
15
Thr lie
Ser Leu Glu 35 Asn
Glu Glu
50 Leu Val 65
Met Val
Ala
Gly 5
His Pro Thr Val
Thr 20
Tyr His Glu Val
Thr 10
Asn Leu Val Leu
Lys Asp Gly
Leu 40 Leu
Glu 25
Ser Ala Ala Phe
Glu
Val Asp Gly
His Asn Ala 55
lie Pro Leu
Gly Ala Ala Ala 100
Glu
85
lie
Ser 70 Pro
Lys Lys
Tyr Lys
60 Asp Asn 75
lie Arg
lie Ala lie Gly 105
Glu 30
His Gin Val
Gly 45
Gly Gin Tyr Val
Gly Lys
lie Val Asp His 90
Ser Cys Ser Ala
lie
Ala
Trp 110
Tyr Cys 80 Ala Glu 95
Gly GlyVal Ala Ala Ala Gly Val Asn Pro Thr Gly Ala Val Ser Leu Gin Glu
115 120 125
Val Leu Pro Gly Lys Thr Val lie Asn lie Pro Gly Cys Pro Pro Asn
130 135 140
Pro His Asn Phe Leu Ala Thr Val Ala His lie lie Thr Tyr Gly Lys 145 150 155 160
Pro Pro Lys Leu Asp Asp Lys Asn Arg Pro Thr Phe Ala Tyr Gly Arg
165 170 175
Leu lie His Glu His Cys Glu Arg Arg Pro His Phe Asp Ala Gly Arg
180 185 190
Phe Ala Lys Glu Phe Gly Asp Glu Gly His Arg Glu Gly Trp Cys Leu
195 200 205
Tyr His Leu Gly Cys Lys Gly Pro Glu Thr Tyr Gly Asn Cys Ser Thr
210 215 220
Leu Gin Phe Cys Asp Val Gly Gly Val Trp Pro Val Ala lie Gly His 225 230 235 240
Pro Cys Tyr Gly Cys Asn Glu Glu Gly lie Gly Phe His Lys Gly lie
245 250 255
His Gin Leu Ala Asn Val Glu 260
<210〉 2
〈211> 789
<212〉 DNA
<213> 产气肠杆菌(￡ aerogewes)
〈400〉 2
gttatctgga ttggcgcgca ggagtgcacc catccaacgg tagaaaacct cgtactggag tccgccgcct tcggtcatca ggtcgaagag
ggttgtacgg aatctctgct tcgtgc肪cg 60 actatctctc tggagtatca cgaagtgctt 120 aacaaacata acgctcttga gaagtacaaa 180
17gggcagtatgtgttagtggt ggatggttcc atcccattaa aagataaeggtatttattgc240
atggttgccggtgagecgat tgtggatcac ateegcaaag eggeggaaggcgcagcagcc300
attategetatcggttcctg ctctgcgtgg ggcggtgttg ccgcagctgg3gttsaccca360
actggcgcsgtcagcctgca agaagttctg ccaggcaaaa ccgttatcaatattceggge420
tgcccgccgaacccgcacaa cttcctcgcg accgttgcgc acatcatcacttacggcaaa480
ccgccgaaactggatgacaa aaaccgtccg accttcgcct ettggcegtetgattcacgaa540
cactgcgaacgtcgcccgca ettcgatget ggtcgttttg ccaaagagttcggtgstg肌600
ggccaccgcgaaggctggtg cctgtaccac ctcggctgta aagggecagaaacttaegge660
aactgctc肌egctgeaatt ctgcgatgtt ggcggtgtgt ggccggtggcg3ttggtcac720
ecttgetatggCtgt33Cg3 3g33ggtatC ggCttCC3t3朋ggC3tCC3tcaactggcc780
aacgtcgaa789
<210> 3
〈211〉 1910
<212〉 腿
〈213〉人工序列
<400〉 3
aatctctgettcgtgcaacg catccaacgg tagaaaacct tttggtgactgcgctcctcc60
aagccagttacctcggttca aagagttggt agctcagaga accttcgaaaaaccgccctg120
caaggeggttttttcgtttt cagagcaagei gattacgege agaccaaaacgatctcaaga180
agatcatcttattaatcaga taaaatattt ctagatttca gtgeaatttatctcttcaaa240
tgtagcacctgaagtcagee ccatacgata taagttgtaa ttctcatgtttgacagctta300
tcatcgataagetttaatge ggtagtttat cacagttaaa ttgetaaegeagtcaggcac360
cgtgtatgaaatctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg caccgtcaccctggatgctg420
taggcataggcttggttatg ccggtactgc cgggcctctt gegggatategtccattccg■
acagcatcgccagtcactat ggcgtgctgc tagegctata tgcgttgatgcaatttctat540
gcgcacccgtteteggagea ctgtccgacc gctttggccg ccgcccagtcctgctcgctt600
cgctacttggagccactatc gaetacgega teatggegae cacacccgtcctgtggatcc660
tctacgccggaegcategtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggttgctggcgcct720atatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgctt780
gtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctcct840
tgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgct900
tcctaatgcaggagtcgcataaggg卿gcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacc恥O
cagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtct1020
tctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgagg1080
accgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgc1140
acgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccacc犯acgtttcggcgagaagcagg1200
ccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgc1260
gaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccg1320
cgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggat1380
cgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcactggaccgctgatcgtcacggcgattt1440
atgccgcctcggcgagcacatgg織gggttggcatggattgt鄉cgccgccctatacc1500
ttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatgg1560
肌gccggcggcacctcgctascggattc3cC3ctccaag3attgg3gcc8atcaattctt1620
gcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccat1680
ctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggceigcgttgggtcctggccacgggtgcgcat1740
gatcgtgctcctgtcgttgaggacccggct鄉ctggcggggttgccttactggttagca1800
gaatgaalcaccgatacgcgagcgaacgtg犯gcgactgctgctgc肌aacgtctgcgac1860
ctgagcaacagattggtcacccttgctatggctgtaacgaagaaggtatc1910
〈210〉 4 <211〉 134 〈212〉 PRT
<213〉 产气肠杆菌aer0ge;7es) <400〉 4
Arg His Arg Arg Tyr Gin Asp Gin Trp Arg Gin Tyr Cys Asn Ser Leu 15 10 15Val Gin Gly lie Thr Leu Ser Lys Ala Arg Leu His His Ala Met Ser
20 25 30
Cys Ala Pro Asp Lys Glu Leu Cys Phe Val Leu Phe Glu His Phe Gin
35 40 45
Val Tyr Val Ala Leu Ala Glu Gly Phe Asn Asn His Thr lie Glu Tyr
50 55 60
Tyr Val Glu Thr Arg Asn Gly Asp Asp Lys Arg Uu lie Ala Gin Ala 65 70 75 80
Thr Leu Ala Ser Asp Gly Thr Val Asp Gly Arg lie Ser Asn Arg Ser
85 90 95
Arg Glu Gin Val Leu Glu His Tyr Leu Ala lie lie Ala Ser Val Tyr
100 105 110
Asp Arg Leu. Tyr Asp Ala Met Glu His Asp Gin Pro Val Asp Leu Ser
115 120 125
His Leu Ala Leu Ala His 130
〈210〉 5
<211〉 405
〈212〉 DNA
〈213〉 产气肠杆菌aerobe/ ")
<400〉 5
cgtcaccgccgctatcaggatcagtggcgccagtactgcaattcgctggttcagggcatc60
accctgtcaaaagcgcgtttgcatcatgcgatgagctgcgcgccggacaaagagctgtgc120
ttcgtcctgtttgaacattttcaggtgtatgtcgcgctggcgga鄉gttcaacaaccac180
accatcgagtactacgtcgaaacgcgcaatggtgatgataagcgattgattgctcaggca240
acgctggcatccgacggtaccgttgacggccggatcagcaaccgttcgcgcg犯caggtg300
ctggaacattacctggccattattgccagcgtctatgaccgtctgtatgacgccatggaa360
cacgaccagccggtggatttaagccatctggcgctggccc405<210〉 6
<211> 1693
<212> DNA
<213〉 6
〈400〉 人工序列
ctgcaattcgctggttcagggcatcaccctgtcaaa^gcgataggctccgcccccctgac60
gagcatcacactcaagtcag鄉tggcgaaacccgacaggactataaaga120
taccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttxcgaccctgccgctt180
accggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgc240
tgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagc"tgggctgtgtgcacgaaccc300
cccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaacta/tcgtcttg已gtccaacccggta360
agacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaagcgaggtat420
gt郷cggtgct3C3ga^gttcttg犯gtggtggcct犯ctacggctacac480
gtatttggtatctgcgctctgctg犯gccagttaccttcgtggtagctct540
tgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaaigC3gC3g3tt600
acgcgcagaa8a^aagg3tctc肌ga^gatcctttgatcttttctacggggtctgacgct660
cagtggaacgadaactcacgttaagggattttggt:catgaacaataaaactgtctgctta720
cataaacagtaataca3ggggtgttatgagcggg犯acgtcttgctctag780
gccgcgattaaattccaaca"tggatgctgatttatatgggctcgcgataa840
tgtcgggcaatx鄉tgcgacaatctatcgattgtMgggaagcccgatgcgccagagtt■
gtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgtttggtcagact960
a3actggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctga1020
tgatgcatggctgcgatccccgggaaaacagcattccaggtsttagaaga1080
atatcctgattcaggtg3aaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgca1140
ttcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggc1200
gcaatcacgsatga3ta^cggtttggttgatgcg敏g3ttttgatgacgagcgt朋tgg1260
ctggcctgttg肌ca3gtctgga^agaaa1:gcataaacttttgccattctcaccggattc1320
agtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttattUtg3Cg3gggg3朋tt朋t1380
21aggttgtatt gatgttggac gagtcgg犯t cgcagaccga taccaggatc ttgccatcct 1440
atggaactgc ctcggtgagt tttctccttc attacagaaa cggctttttc aaaaatatgg 1500
tattgataat cctgatatga ataaattgca gtttcatttg atgctcgatg agtttttcta 1560
agaattaatt catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa c犯atagggg 1620
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgtatgacg ccatggaaca cgaccagccg 1680
gtggatttaa gcc 1693
<210〉 7
<211〉 40
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 7
aatctctgct tcgtgcaacg catccaacgg tagaaaacct 40
〈210〉 8
<211〉 40
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈400〉 8
gataccttct tcgttacagc catagcaagg gtgaccaatc 40
<210> 9
〈211〉 40
〈212> DNA <213〉人工序列
<400〉 9
ctgcaattcg ctggttcagg gcatcaccct gtcaaaagcg 40〈210〉 10
〈211〉 40
<212〉 醒
〈213〉 人工序列
〈400〉 10
ggcttaaatc caccggctgg tcgtgttcca tggcgtcata 40
权利要求
1、产氢工程菌，是如下a)或b)的工程菌a)灭活E.aerogenes IAM1183中的ΔhybO蛋白得到的工程菌；b)灭活E.aerogenes IAM1183中的ΔhybO蛋白和ΔhycA蛋白得到的工程菌；所述ΔhybO蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列1；所述ΔhycA蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列4。
2、 如权利要求1中a)所述的工程菌，其特征在于所述灭活￡ 3eroge"esI扁1183 中的AhybO蛋白是通过将DNA片段Q导入所述￡ aero^ / es IAM1183中实现的；所述DNA片段Q自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片段N、同源臂T2;所述同 源臂T,和同源臂T2能与所述AhybO蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述AhybO 蛋白；所述DNA片段N为抗生素抗性片段。
3、 如权利要求2所述的工程菌，其特征在于所述AhybO蛋白的编码基因的核 苷酸序列是序列表中的序列2;所述同源臂L的核苷酸序列是序列表中的序列7;所 述同源臂T2的核苷酸序列是序列表中的序列8;所述DNA片段N为四环素抗性片段。
4、 如权利要求3所述的工程菌，其特征在于所述DNA片段Q的核苷酸序列为 序列表中的序列3。
5、 如权利要求1中b)所述的工程菌，其特征在于所述灭活￡ aerobe""IAM1183 中的AhybO蛋白和AhycA蛋白是通过将DNA片段Q和DNA片段P导入所述se/Y^e/ ^ 1認1183中实现的；所述DNA片段P自上游至下游依次为同源臂T3、 DNA片段M、同源臂L;所述同源臂 T3和同源臂T4能与所述AhycA蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述AhycA蛋白； 所述DNA片段M为抗生素抗性片段；所述DNA片段Q自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片段N、同源臂TV,所述同源臂 L和同源臂T2能与所述Ahyb0蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述AhybO蛋白； 所述DNA片段N为抗生素抗性片段。
6、 如权利要求5所述的工程菌，其特征在于所述AhybO蛋白的编码基因的核 苷酸序列是序列表中的序列2;所述同源臂T的核苷酸序列是序列表中的序列7;所 述同源臂T2的核苷酸序列是序列表中的序列8;所述DNA片段N为四环素抗性片段； 所述AhycA蛋白的编码基因的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述同源臂T3的核苷酸序列是序列表中的序列9;所述同源臂T4的核苷酸序列是序列表中的序列10;所述DNA片段M为卡那霉素抗性片段。
7、 DNA片段Q，自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片段N、同源臂T2;所述同 源臂L和同源臂L能与A seroge/7es IAM1183的AhybO蛋白的编码基因发生同源重 组，灭活AhybO蛋白；所述AhybO蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列1;所述DNA 片段N为抗生素抗性片段。
8、 如权利要求7所述的DNA片段Q，其特征在于所述AhybO蛋白的编码基因 的核苷酸序列是序列表中的序列2;所述同源臂T,的核苷酸序列是序列表中的序列7; 所述同源臂T2的核苷酸序列是序列表中的序列8;所述DNA片段N为四环素抗性片段。
9、 如权利要求8所述的DNA片段Q，其特征在于所述DNA片段N的核苷酸序列 为序列表中的序列3。
10、 含有权利要求7-9中任一所述DNA片段Q的表达盒或重组表达载体或转基因 细胞系或重组菌。
全文摘要
本发明公开了产氢工程菌及其应用。本发明提供的产氢工程菌，是如下a)或b)的工程菌a)灭活E.aerogenes IAM1183中的ΔhybO蛋白得到的工程菌；b)灭活E.aerogenes IAM1183中的ΔhybO蛋白和ΔhycA蛋白得到的工程菌；所述ΔhybO蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列1；所述ΔhycA蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列4。本发明得到的工程菌可应用于生物制氢，对生物制氢具有巨大的指导意义。本发明获得的工程菌具有以下优点对环境适应性强、利用底物范围广、利用底物能力强、产氢效率高。
文档编号C12N5/10GK101608170SQ20081011523
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者元 卢, 翀 张, 瑢 施, 王立言, 赵洪新, 邢新会, 堃 马 申请人:清华大学