专利名称：胚胎干细胞样多能性细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域。更具体地说，本发明涉及一种诱导体
细胞产生胚胎干细胞(ES)样多能性细胞的方法、利用该方法获得的ES样多能性细胞及其用途。
背景技术：
胚胎干细胞一直是各国科学家研究的热点，因为这种细胞具有形成完整个体的分化潜能，可以无限增殖并形成全身两百多种细胞，随着研究的深入，其有可能形成4几体的组织和器官，并有可能应用到临床医学，为人类带来福音，另外在动物克隆、转基因动物生产、细力包工禾呈、组织工^E、治疗性克隆和发育生物学等的研究应用中起着重要的作用。但是胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团或胚胎外胚层经体外抑制分化培养分离得到的多能性细胞，从而引发了胚胎相关实验的伦理道德问题。特别是在宗教信仰的国家，限制了胚胎千细胞的研究。
为了避免伦理道德的问题，科学家们一直在尝试不用破坏胚胎来建立胚胎干细月包系，目前常用的方法有两种， 一种是利用细月包融合技术，把体细胞和干细胞相融合以获得具有干细胞潜能的融合细胞，不过得到的是四倍体，这个问题一直没有得到解决；另一种方法是目前在生命科学引起轰动，被誉为人类生命科学新的里程碑的技术，即利用几种因子转染成纤维细胞诱导而成的多能性干细胞。但是这几种因子中有原癌基因，另外所使用的是病毒转染，所获得的干细胞的安全性是个巨大的问题，所以离临床应用还有 一定的距离。
除了多能性基因诱导、核移植、细胞融合外，利用细胞或者组
织的提取物同样可以对细胞进行重编程。利用SLO通透的方法4巴细胞提取物导入其它细胞，是近年来发展起来的对细胞重编程的一种方法。它是提取一种细胞(靶细胞)的可溶性内容物，并4巴另外一种细胞用SLO进行膜通透处理，使细胞膜形成较大的孔，然后置于耙细胞的提取物中，使得被处理的细胞内物质能够与提取物中的成分发生交换，从而使提取物中的细胞因子在被处理细胞中发挥作用，使被处理的细胞表达靶细胞的基因，甚至形态和功能也向耙细胞方向改变。目前提取物的研究主要限于不同类型体细胞之间的转换，即用一种类型的体细胞的提取物处理另一种类型的体细胞，使处理的细力包的基因表达向制备纟是取物的细月包方向转变。
ES细胞作为一种多能性细胞，其对体细胞的重编程能力在融合的细胞中已经得到充分的证实，ES细胞的提取物同样也被检测到具有对体细胞进行重编程的能力。用小鼠的ES细胞处理NIH3T3细胞系后，被处理的细胞形成了类ES的集落，并表达了干细胞的标记基因[Taranger et al., 2005]。 4旦是NIH3T3是永生化的细胞系，4艮难应用到临床，为了找到一种真正地将体细胞重编程为ES细胞并能应用到临床的可行性方法，本研究首先尝试利用小鼠ES细胞的提取物通过药物通透处理的小鼠成纤维细胞，以探索对正常体细月包进4于重编程的方法。结果表明，对正常体细胞力莫进4于药物通透处
理，这种导入ES细胞提取物方法的效率非常低，不能得到满意的效果，无法获得ES细胞样的多能性细胞。
为了克服上述方法的缺点，本发明提出了诱导体细胞产生ES样多能性细胞的方法、以及利用该方法获得的ES样多能性细胞及其用途。其中使用显微注射技术，其是利用显微操作系统将外源的物质直接注入到细胞、卵或胚胎中的方法，显樣i注射技术可以向细胞中注射多种物质，包括细胞因子、转基因构件、生长因子、药物和染料等。显孩"主射方法基本上对细胞或胚胎的后续生长和发育没有影响。所以本发明采取了显孩i注射方法注射ES的提取物到体细胞中，并获得ES样的多能性细胞，这些细胞可以表达ES的特异性的标志性因子和蛋白，并能在体外无限地传代。
发明内容
本发明的目的在于，^是供一种诱导体细胞产生ES样多能性细胞的方法、以及利用该方法获得的ES样多能性细胞及其用途。
本发明通过一种根据下述的诱导体细胞产生ES样多能性细胞的方法、由该方法获得的ES样多能性细胞以及该ES样多能性细胞的用途达到该目的。
本发明的一个方面涉及一种诱导体细胞产生胚胎干细胞(ES )样多能性细月包的方法，包4舌下述步-骤l)体细月包的制备；2)ES细月包l是取物的制备；3 )利用该ES细力包纟是取物处理该体细月包。优选地，在利用ES细胞提取物处理体细胞的步骤中使用显微注射方法。
优选地，培养的ES细胞经0.05 %胰蛋白酶消化离心后，用PBS和Lysis緩沖液洗细胞，再用Lysis緩冲液重悬沉淀，用超声波细胞破石争仪石皮石争细胞，离心后取上层液体冻存。
优选地，在利用ES细胞提取物处理体细胞的步骤中，将体纟田胞接种到玻片上，此时体细胞刚贴壁伸展稍许，把玻片转移到含有hepes的胚胎干细胞培养液进行注射，在注射之后用ES的培养液在37°C、 5% C02条件下培养获得所述ES样多能性细胞。
优选地，进4亍注射时所用的注射针直径是0.5nM。
本发明的另一个方面涉及一种利用上述方法获得的ES样多能斗生细月包。
根据本发明所述的ES样多能性细胞，其特征在于，所述ES样多能性细胞表达了 oct4、sox2和nanog等早期胚胎发育相关基因。
优选地，所述ES样多能性细胞表达了多能性标志蛋白oct4、sox2、 和nanog。
本发明的另一个方面还涉及所述ES才羊多能性细月包在分化为不同胚层来源的细月包和组织中的应用。
本发明首次利用胚胎干细胞的提取物通过显孩i操作方法诱导体细胞重编程，经用显微注射的方法对体细胞进行重编程后，得到ES样多能性细月包，ES样多能性细月包表达oct4、 sox2、和nanog等多能性基因。这种4支术无需采用卵细胞或胚胎，没有病毒和癌基因的引入，从而避免了伦理和生物安全问题。
下面参照附图#4居本发明的实施例更详细地描述本发明，附图
中示出了
图1是利用ES提取物注射小鼠成纤维细胞后获得的ES样多能性细胞及其荧光的表达结果，其中，A是同样条件培养的没有注射提取物的小鼠成纤维细胞；B是注射提取物后各个时期的小鼠成纤维细胞形态及其荧光表达。
图2是利用ES细胞提取物处理小鼠成纤维细胞后获得的ES样多能性细胞的基因表达检测结果，其中，ES-like是利用ES提取物处理的小鼠成纤维细力包；MEF是没有经过处理的小鼠成纤维细胞；ES是Rl纟田胞。
图3利用ES细胞提取物处理小鼠尾尖成纤维细胞后获得的ES样多能性细胞的基因表达检测结果。
图4是利用ES细胞提取物处理心脏间充质细胞后获得的ES样多能性细胞的基因表达检测结果
图5是ES细胞提取物处理小鼠成纤维细胞后获得的ES样多能性细胞的多能性标志蛋白表达才企测结果oct4、 sox2、 nanog。
图6A是形成的拟胚体，图6B是利用RT-PCIU企测拟胚体三胚层分化基因表达。
具体实施例方式
A定义
胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES )是指从早期胚胎内细胞团(ICM)或胚胎原始生殖细月包(PGC)分离出来的一种具有自我更新、无限繁殖能力和全能分化能力的干细胞。
反转录聚合酶链反应 RT- PCR ( ReverseTranscription匿Polymerase Chain Reaction )是4是取纟且织或纟田月包中的总RNA,以总RNA作为模版，釆用Oligo (dT)或随机引物利用逆转录酶(即反转录酶)反转录成cDNA。再以cDNA为才莫版进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵每丈性*提高了几个#:量级，^吏一些才及为孩i量的RNA样品分析成为可能。
B诱导成纤维细胞产生ES样多能性细胞的方法和所使用的材
1 )体细胞的制备
OCT4-GFP的成纤维细力包的制备
从13.5Dpc的OCT4-GFP C57雌鼠(为oct4启动子-绿色焚光蛋白GFP转基因小鼠)和DBA雄鼠交配的孕鼠收集胚胎，将胚胎在去除头、尾、四肢之后切碎，利用胰蛋白酶(0.05%)消化后，4吏用10%的DMEM培养4妾种培养两天获得原 的成纤维细月包，扩增保存，具体方法如下细胞的培养液为含有10。/。胎牛血清(FBS)的DMEM,以1 x 106个细胞/1111的密度将获得的原代的成纤维细胞种植到10cm的培养亚中，置入含5%二氧化碳培养箱中培养，两天后将处于对数生长期的细胞进行消化传代。将生长的细胞弃掉培养液，然后用PBS(NaCl 8g/L、KCl 0.3g/L、KH2PO4 0.02g/L、Na2HPO40.726g/L、 Glucose 2g/L )洗细胞两次，除去残余的血清。倒掉PBS并加入在37。C预热的2ml 0.05%的胰蛋白酶消化3min,在培养m中加入上述培养液终止胰蛋白酶的作用，按lxl(^个细胞/皿分装到一个10cm培养皿中继续培养，培养到细胞汇集程度90%后消化冻存。细胞的冻存细胞消化离心后，计数，然后用4"C预冷的冻存液(10%DMSO、 50。/。DMEM培养液、40 %的月台牛血清)重悬，按1 ~ 5xl06个细胞/ml的浓度分装到无菌的lml冻存管中，做好标记，在4。C放置20min,随后在-20。C》文置2小时，之后在-80。C放置6小时或过夜。然后液氮中冻存，备用。
小鼠心脏间充质细胞的制备
把2-3周龄幼小鼠(ICR,维通利华，清洁级)引颈处死，利用1%新洁尔灭将其洗涤后，用1%0新洁尔灭浸泡5min或双抗(sigma1000u)浸泡10min对小鼠进行灭菌处理，之后在无菌状态下取其心脏，用PBS将心脏充分洗涤后，尽量晾干表面的水分。将心脏剪成2-3mmS的组织块，均匀摆放在培养瓶中，距离0.3cm左右。如果植块周围仍有液体，用尖头毛细吸管吸净；另外往培养并瓦中摆;改时需要一个长的前头扁的药勺或其他东西，翻转培养瓶J吏组织块在上面，然后在其顶面力。入5ml左右的10%DMEM，置于5% C02、 37°C培养箱中放置2_3小时，緩慢翻转培养瓶使培养液完全覆盖组织块，l-2天后可见细胞长出，4-6天后可形成单层细胞。将所述细胞冻存(同上)以用于胚胎干细胞提取物处理。
小鼠尾尖成纤維细胞的制备
用剪刀将小鼠尾尖组织剪成2-3mm长的小组织块，然后在室温条件下将其贴在培养皿(falcon no. 3001 )底部让其自然干燥1小时。在培养皿中轻轻加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，并防止贴壁的组织块漂浮起来。最后，将含有贴壁鼠尾尖组织块的培养皿在37。C、 5%C02、 95。/。空气的i咅养箱中i咅养4-8天，直至成纤维细胞长满培养皿。将所述细胞冻存(同上)以用于胚胎干细胞提取物处理。
2 ) ES细胞提取物的制备
首先，进行小鼠胚胎干细胞的培养和冻存。本发明利用小鼠ES-R1系和CK35干细胞系(国际认证的干细胞系，分别来自美国和法国实验室的赠送)，所用培养液为D-MEM培养基(Gibco，No. 11320-033 ), 20%FBS ( Gibco， No.10099-141 ), lmM丙酮&复4内(Sigma, No丄1375 ) ， 2mM谷氨酰胺(Sigma, No.G8540 ) , O.lmMp-统u基乙醇(Sigma, No.M6250) , IX非必须氨基酸(Gibco,No. 11140-050 ), 1000U/ml LIF( leukemia inhibitory factor, Chemicon,ESG1107) , 0.05mM/ml的青霉素和链霉素。在室温下，ES细月包i咅养过,呈中每天更换培养液，每两天传4戈一次。传4戈方法用PBS洗细胞两次，除去残余的血清。倒掉PBS并加入在37。C预热的0.05%的胰蛋白酶消化3-5min，所用的量能盖住皿底即可进行消化，用含10 % Gibco血清的DMEM终止月夷蛋白酶的作用。以1000 Rpm离心5min后4安lxl05 1.5x105个纟田月包/ml的纟田月包密度传^。
培养的ES细胞经0.05 %胰蛋白酶消化离心后，用冰预冷达4°C的PBS (3ml)洗细胞一次，再用冰预冷达4。C的lml Lysis 1￡冲液(10mM HEPES、 5mM MgCl2、 50mM NaCl、 lmM DTT、 lul/mlProtease Inhibitor Cocktail);先细月包一次。用细月包一倍体积、的Lysis緩冲液重悬沉淀。用超声波细胞破碎仪破碎细胞，超声的强度是40W,时间是5-10秒。其中每隔10秒超声一秒，共进行超声处理5-10次，基本上超声5次后，取样本在孩史量4竟下7见察，如有整个的细胞，还要继续超声。超声结束后，在4。C以M,000rpm离心15分钟，取上层液体立即方文入-80。C冰箱冻存。
3 )利用ES细胞提取物处理小鼠体细胞
提前两个小时把小鼠体细胞接种到圓形玻片上，这时小鼠体细胞刚贴壁伸展稍许，之后把玻片转移到显微注射的操作亚(chamber)上，并把玻片转移到含有HEPES的所述胚胎干细胞培养液进行注射，所用的注射针直径是0.5jam( Eppendorf 930000035 ),注射后用ES的培养液37。C、 5。/。C02培养箱中培养，大概七八天后可以发现ES样多能性细胞。
C反转录聚合酶链反应RT-PCR
以下所有才才坤+要求无才亥泮唐才亥酸酶(RNase)污染。RNA提取(即提取细胞中的总RNA ):将培养的ES样多能性纟田月包用PBS (3ml) 5先2 ,欠，力口入TRIzol ( 1ml) ( invitrogen.catNO.15596-026) 4吏细月包迅速裂解，然后專争移至1.5ml的Enpendorf管，静置3分钟，每lml TRIzol加200 pi氯仿，手动剧烈震摇15秒，静置5分钟，以12，000rpm在4。C离心15分钟。4巴上层液体转入另一 1.5ml的Enpendorf管，加入与上清液等体积的异丙醇，混匀，》文置10分钟后，以12,000rpm在4。C离心15分钟。弃上清，每lml TRIzol加入lml 75%的乙醇，以7,500 rpm在4°C离心5分钟。弃上层液体，在空气中室温干燥15分钟，加入二乙基焦磷酰胺(DEPC )水20 pl，在56 - 6(TC水浴10分钟后获得总RNA，用总RNA直接进行转录。
在提取RNA的过程中，有可能会带有基因组的DNA，这样会严重影响PCR结果，因此需要消化DNA。
消化DNA:反应体系共10pl，其中包括提取的总RNA8ial，加入10 X Buffer (Promega, M198A )、 ljil DNase (Promega,M610A),在37。C》文置30分钟。随后加入ljul DNase抑制剂(Promega,M199A ),并在65。C灭活10分钟。
反转录从上述步骤中获得的总RNA中取出15.75^1,加入2|ilRandom primer ( Promega, CI 181 ), ^夸RNA和Random primer的〉、昆合物65。C水浴5分钟后，立即放置于冰上。5分钟后，加入5x的反转录酶纟爰沖液(Promega M-MLV M531A) 5 (^1， 10mM dNTP(Sigma ) 1.25， RNase承卩制齐寸Recombinant RNasin RibonucleaseInhibitor ( promega, N2515 ) 1 pl，混匀，在25。C7jc浴io分钟；力口入反转录酶(PromegaM-MLV M10B ) 1 (il，在42。C水浴50分钟，在72。C水浴15分钟获得反转录物(即cDNA)。对反转录物的样品做无反转录酶的阴性对照，以检测提取的RNA是否存在DNA污染。
PCR反应体系20nl，即所有的液体的量的总合是20^1,包括去离子7jc 14.3pl， 10 x -爰沖液(Takara) 2^il, 1 OmM dNTP ( Takara )0.5ul， Taq酶(Takara ) 1U，上步反应获得的反转录物(即cDNA )1|^1，如下文所示的上、下游引物(Primer)各lfil。反应禾呈序在95。C时预变性3分钟。随后进行30个循环的扩增，每个循环的温度和时间分别为在94。C时变性30秒，在60。C时退火30秒，在72°C时延伸30秒。最后在72。C时保持5分钟。
本发明所使用基因的引物序列及其合成方法
gapdh 141bp
正向引物GACTCCACTCACGGCAAATTC反向引物CACGACATACTCAGCACCGG
nanog lllbp
正向引物AGGATGAAGTGCAAGCGGTG反向引物GGGATAGCTGCAATGGATGC
oct4 116bp
正向引物CAGCCAGACCACCATCTGTC反向引物GTCTCCGATTTGCATATCTCCTGsox2 151bp
正向引物CCAGCTCGCAGACCTACATG反向引物GAGTGGGAGGAAGAGGTAAC
nanog、 oct4、 sox2基因是在胚胎早期表达的基因，在ES细胞中表达，但在正常的小鼠体细胞中不表达。Gapdh为持家基因，在所有小鼠细胞中均有表达。
在本发明中所使用的引物是由上海生工生物工程技术有限公司根据上述引物序列合成的。此外，本发明中所使用的引物序列均来源于小鼠(mouse )。
D结果
1 ) ES样多能性细胞的获得及其传代
请参照图1，图1示出了利用ES提取物注射小鼠胚胎成纤维细胞后获得的ES样多能性细胞及其荧光的表达结果，其中，A是同样条件培养的没有注射提取物的小鼠胚胎成纤维细胞；B是注射提取物后各个时期的小鼠胚胎成纤维细胞形态及其荧光表达。
显孩i注射后，部分成纤维细胞在7-8天后逐渐形成ES样多能性细月包，由于所述成纤维细月包是由oct4启动子-乡录色荧光蛋白GFP转基因小鼠胎儿制备的，所以在该成纤维细胞中不表达绿色荧光蛋白，当转变为ES样多能性细胞后即表达绿色荧光蛋白，因此在荧光显微镜下有绿色表达，说明此时细胞已经开始表达多能性ES的标志分子oct4 (图1 )。取出ES样多能性细胞进行机械切割传代并得到了扩增，说明ES样的细胞多能性细胞具有增殖能力。ES样多能性细月包形成岁爻率为2%0。
2)小鼠ES细胞提取物处理体细胞后基因表达检测结果
请参照图2,图2是利用ES细胞提取物处理小鼠胚胎成纤维细胞后，利用上述检测方法获得的ES样多能性细胞的基因表达检测结果，其中，ES-like是利用ES提取物处理的小鼠胚胎成纤维细胞；MEF是没有经过处理的小鼠胚胎成纤维细胞；ES是R1细胞。
用RT - PCR方法检测了 ES样多能性细胞的4个小鼠胚胎发育早期表达的基因的表达，其中gapdh是看家基因(house-keepinggene)，作为阳性对照。同时用RT - PCR方法才企测了没有经过处理的成纤维细月包和ES纟田月包，作为只于照。结果如图2,利用ES纟田月包提取物处理的成纤维细胞，即ES样多能性细胞表达了 4个早期胚胎发育相关基因中的3个基因oct4、 nanog、和sox2,没有经过处理的成纤维细胞只表达了看家基因gapdh, ES细胞表达了包括看家基因和胚胎早期相关基因的所有基因。试验结果说明，使用ES细胞的提取物对成纤维细胞的处理，诱导激活了胚胎早期基因的表达。
图3和图4是利用ES细胞提取物处理小鼠尾尖成纤维细胞和心脏间充质细胞后获得的ES样多能性细胞的基因表达检测结果。
用RT-PCR方法检测了 ES样的细胞的3个小鼠胚胎发育早期表达的基因的表达。结果如图3和图4， ES细胞提取物处理的尾尖成纤维细月包和心脏间充质细月包均表达了 3个早期胚胎发育相关基因oct4、 nanog 、 sox2。试-验结果说明，ES细胞的提取物对尾尖成纤维细胞和心脏间充质细胞的处理，诱导激活了胚胎早期基因的表达。
3)多能性蛋白的检测
用4%的多聚曱醛(0.5ml )室温固定细胞30分钟或者4。C过夜，0.5 Q/q的TritonX _ 100( 0.5ml )室温处理30分钟，用2%BSA( 0.5ml)封闭，加入兔源的Nanog ( 0.5ml)(由清华大学赠送)和sox2抗体(0.5ml) ( chemicon cat, No AB5603 )在4。C过夜，用PBS( 0.5ml)洗细月包后加入0.5ml驴抗兔IgG-FITC ( Jakson， 711-095-152)室温作用1小时后用PBS洗细月包，之后加入含50ug/ml RNase( Promega )的10ug/ml的石典化丙咬(Sigma 7>司)进行细胞核染色，然后PBS洗细胞30分钟。用激光共聚焦显孩"竟^L察照相，其结果如下。
请参照图3,图3是ES细胞提取物处理小鼠成纤维细胞后获得的ES样多能性细胞的多能性标志蛋白表达检测结果oct4 (绿色)、sox2(红色)、和nanog(红色)，利用免疫荧光染色的方法，检测了 ES样多能性细胞中特异性表达的多能性蛋白oct4、 sox2、纖og之后，由oct4、 sox2、譲og基因分另'J转录翻译后获得oct4、sox2、 nanog蛋白。在使用oct4-GFP标记的成纤维形成ES样多能性细胞时，利用上述4企测方法检测时，oct4表达绿色荧光；而在做sox2和nanog的免疫荧光时利用TRITC, sox2和nanog显纟工色；merge是oct4和sox2复合以及oct4和nanog复合的《贞色，即红和绿复合成黄色。结果表明(如图3 ) ES样多能性细胞表达多能性蛋白的标志，也就是说，提取物不但激活了多能性基因的表达而且多能性蛋白也得到了表达。
4 ) ES样多能性细胞的分化
将所获得的ES样多能性细胞在无伺养层、无血清的培养基画ESGRO CompleteTM Clonal Grade Medium (Invitrogen， #SF001-500)中培养。吸弃上清，用PBS润洗一次后，加入1 ml/3.8cm2 Tryple(Invitrogen， #12604-039)消化纟田胞，吸弃上清，在37。C、 5%C02的培养箱中温育3-5分钟，加入10%FBS-DMEM培养基终止消化。将单细胞悬液以lOOOrpm离心5分钟之后，加入适量自发分化培养基-ESGRO Complete Basal Medium (Invitrogen， #SF002-500 )将细月包团块重悬至40,000个细月包/毫升;咅养基，用悬滴法形成25^1/滴的拟胚体悬、液，i咅养15天。
4安照试剂盒(Invitrogen, Grand Island, NY ) -使用方法乂人第十五天的拟胚体中提取总RNA,然后合成cDNA。利用cDNA作为才莫板，PCR扩增三胚层特异性基因Soxl、 Nes、 T、 Myodl、 Gata6、 Afp、以及Gapdh作为对照。PCR引物序列如表1所示。基因 引物 大小(bp) 基因库登记
号
Soxl正义5'- TGGCCCAGGAAAACCCCAAG-3 反义5'- GTCTCTTGGCCTCGTCGATG陽3114009233
Nes正义5'- GGACAGGACCAAGAGGAACA-3 反义5'- TCCCACCTCTGTTGACTTCC-3599016701
T正义5'- CCCGAGACCCAGTTCATAG-3 反义5'-:ATTACATCTTTGTGGTCGTTTC-3127009309
Myodl正义5'- CCTGAGCAAAGTGAATGAG匿3 反义5'- ACCTTCGATGTAGCGGATG-3115010866
Gata6正义5'-:TCAGGGGTAGGGGCATCAG-3 反义5'- GAGGACAGACTGACACCTATG-3113010258
Afp正义5'- GC丁CACACCAAAGCGTCAAC-3 反义5'- CCTGTGAACTCTGGTATCAG-3410007423
Gapdh正义5'陽CTCGTCTCATAGACAAGATGGTGAAG-3' 反义5'-AGACTCCACGACATACTCAGCACC-3'15014433
表l拟胚体三胚层分化基因引物
图6A是形成的拟胚体，图6B是利用RT-PCR4企测拟胚体三胚层分化基因表达，其中1和2来源于分别形成的拟胚体EB， 3是小鼠胚胎作为阳性对照。取PCR产物做凝胶电泳检测基因表达。通过RT-PCR可以才企测到这些EB表达外胚层标志分子Soxl 、 Nes;中胚层标志性分子T、 Myodl;以及内胚层标志性分子Gata6、 Afp。结果说明细胞具有自发分化成三胚层细胞的能力。
好的使细胞重编程和定向诱导分化的手段。
由于目前对细胞重编程的机制了解得还不太清楚，对细胞进行定向的诱导分化的方法还处于探索阶段，所以利用ES细胞提取物诱导体细胞可以帮助研究细胞因子对细胞的重编程作用，研究细胞分化和转分化的机制，以及鉴定有利于细胞重编程的细胞因子，为对细胞进行定向分化提供更高效的手段。
本发明首次利用ES细胞的提取物对体细胞进行了诱导研究，结果表明ES细胞的提取物可以诱导体细胞激活胚胎早期基因的表达。此发明不需采用卵细月包或胚胎，这种l支术不用石皮坏胚胎，没有病毒和癌基因的引入，从而避免了伦理和生物安全问题。
对于本发明所属4支术领域的4支术人员来i兌，在获知前述描述冲是供的教导之后，可以想到本发明的许多修改和其它实施方式。因此，应该理解本发明不应该局限于所纟皮露的特定的具体实施方式
，这些
在文中使用了特定的术语，但它们仅以一般和描述性的意义被使用而不用于限制的目的，本发明的范围由片又利要求书限定。
权利要求
1.一种诱导体细胞产生胚胎干细胞(ES)样多能性细胞的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤1)体细胞的制备；2)ES细胞提取物的制备；以及3)利用所述ES细胞提取物处理所述体细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在利用所述ES细 胞提取物处理所述体细胞的步骤中使用显微注射方法。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述ES细胞提 取物的制备的所述步骤中，培养的所述ES细胞经0.05 %胰蛋 白酶消化离心后，用PBS和Lysis緩冲液洗所述ES细胞，再 用所述Lysis緩冲液重悬沉淀，用超声波细胞破碎仪破石争所述 ES纟田月包，离心后取上层液体冻存。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在利用所述ES细 胞提取物处理体细胞的所述步骤中，将体细胞接种到玻片上， 此时所述体细月包刚贴壁伸展稍许，4巴所述3皮片转移到含有 hepes的胚胎干细胞培养液进行注射，在所述注射之后用ES 的培养液在37。C、 5% C02条件下培养获得所述ES样多能性 细胞。
5. 4艮据4又利要求2所述的方法，其特征在于，进4亍所述注射时所 用的注射4十直^圣是0.5j^m。
6. 利用根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的ES样多 能性细胞。
7. 根据权利要求6所述的ES样多能性细胞，其特征在于，所述 ES样多能性细胞表达了 oct4、 sox2和nanog等早期胚胎发育 相关基因。
8. 才艮据4又利要求6所述的ES样多能性细J包，其特征在于，所述 ES样多能性细胞表达了多能性标志蛋白oct4、 sox2、和nanog。
9. 根据权利要求6至8中任一项所述的ES样多能性细胞在分化 为不同胚层来源的细月包和组织中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种诱导体细胞产生胚胎干细胞(ES)样多能性细胞的方法以及利用该方法获得的ES样多能性细胞及其应用。本发明首次利用胚胎干细胞的提取物，经用显微注射的方法对体细胞进行重编程后，得到ES样多能性细胞，ES样多能性细胞表达oct4、sox2、和nanog等多能性基因。此发明无需采用卵细胞或胚胎，没有病毒和癌基因的引入，从而避免了伦理和生物安全问题。
文档编号C12N5/06GK101603025SQ20081011490
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月13日 优先权日2008年6月13日
发明者琪 周, 李雪梅, 柳 王, 勇 范, 捷 郝 申请人:北京华盛兴邦生物技术有限公司