牡丹ACC合成酶基因Ps-ACS1特异性探针的制作方法

专利名称：：牡丹ACC合成酶基因Ps-ACS1特异性探针的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及牡丹ACC合成酶基因iVJGS/的特异性探针。
背景技术：
：牡丹(尸aeo"/aw,i^cosa)是中国传统名花中的精品，素有"国色天香"、"花中之王"的美誉，它花大色艳，不仅深受我国人民的喜爱，而且也符合西方人的审美观，因此逐渐成为目前世界上最流行的花木之一。近年来，随着巿场对鲜切花需求的日益增长，除了园林用苗及盆花以外，牡丹切花的潜在国际巿场也日趋扩大。然而，由于牡丹自然花期集中、单朵花花期短、釆后贮运保鲜技术不过关，致使鲜切花质量难以保证、无法实现长期和远距离供货，这不仅成为制约我国牡丹切花产业化生产的重要因素之一，而且为此还失去了很多创汇良机。被称为衰老激素的乙烯与切花衰老的关系密切，多年来一直是切花衰老研究的热点。目前，已发现乙烯的大量产生是促使牡丹切花衰老的重要生理原因之一(史国安等，1997,1999);在此基础上，我们对13个牡丹品种内源乙烯代谢特征进行分析发现，以牡丹'洛阳红，为代表的几种切花乙烯释放量与花朵开放衰老进程密切相关(Jiaetal.，2006)，但其对外源乙烯的反应却非常复杂(Zhouetal.，2006)。因此，为了探明乙烯在牡丹切花开放衰老进程中的作用机理，从而为其采后保鲜技术的开发提供理论依据，还需要更深入的研究。自乙烯生物合成途径揭示以来(YangandHoffman,1984)，切花乙烯致衰机理的研究逐渐进入到分子水平。在乙烯生物合成途径中，有ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)两个关键酶。其中，ACS被认为是乙烯生物合成中的限速酶，它由一个多基因家族编码(JohnsonandEcker，1998;Geetal.,2000),且不同成员受不同因子(包括发育信号、植物激素和环境刺激等)的诱导而产生乙烯(Za腿binskiandTheologis,1997;BuiandO'Neill,1998)。目前，香石竹(Parketal.,1992;VanAltvorstandBovy,1995)、月季(Wangetal.,2004)及兰花(O'Neiletal.，1993)等许多观赏植物中的爿CS基因在花朵开放衰老进程中的分子调控机理研究相继开展。但在牡丹，甚至整个芍药科中，」GS基因的克隆及其调控机理的研究还未有报道。
发明内容本发明的目的在于提供牡丹ACC合成酶基因户^4C^的特异性探针，为AJCW基因的后续功能研究和应用提供基础。本发明所述的特异性探针具有序列表SEQIDNO.l所示的核苷酸序列或者其有效长度片段。本领域技术人员应能理解，这里所述的有效长度片段是按照SEQIDNO.l产生的指能够与尸5""CS7特异杂交的序列。这些序列长度优选60bp以上。探针的标记物可以是放射性标记或者是非放射性标记，例如釆用荧光标记。可以将上述探针与适当的试剂组成试剂盒，以方便使用。通过实验表明，本发明探针具有良好的特异性，能够用于P^4CW基因的特异性检测。本发明首次从牡丹'洛阳红'花瓣中分离A"CS/基因，并合成了该基因的特异性探针，避免了在基因表达分析研究中因为同源性较高而带来的其它基因家族成员的表达干扰，有利于在此基础上研究^CS不同成员在牡丹乙烯反应中的调控机理及作用模式。为全面了解乙烯与牡丹切花开花衰老的关系、揭示乙烯在其采后开花和衰老进程中的作用模式和调控机制提供了基础。图la、图lb(续图la)A-基因cDNA全长核苷酸及推定的氨基酸序列，其中小写字母表示非翻译区，星号表示终止子，阴影区表示ACC合成酶的7个保守区，方框内为所有转氨酶中保守存在的氨基酸残基，划线部分为ACC合成酶的活性中心，加粗的氨基酸残基表示结合磷酸吡哆醛和蛋氨酸的赖氨酸残基活性位点；图2牡丹P^4CS7基因Southern杂交分析。将'洛阳红，幼嫩叶片中提取的30jugDNA,以五coRI(a)、五coRV(b)、///"dll(c)进行酶切，0.8%(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上，分别以地高辛标记的中间片段探针(A)和特异性探针(B)进行杂交；图3乙烯和1-MCP处理对'洛阳红，花瓣内i^-v4CW基因表达的影响。切花在测定乙烯生成量后立即用来花瓣取样提取总RNA,每个泳道为20jag总RNA,以rRNA为内参来衡量总RNA上样量。数字代表牡丹切花的开花指数。每次杂交均重复至少两次。具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例liV^CW基因的克隆1.牡丹花瓣总RNA的提取(1)RNA提取所用的塑料、玻璃器皿和试剂配制均按《分子克隆实验指南》(第三版)进行去除Rnase处理。(2)取牡丹'洛阳红，盛开期花朵的花瓣样品l.Og，液氮中研磨至粉末后，迅速转入1.5mL离心管中，加入65。C预热的CTAB提取液600|aL(2%CTAB,2%PVP，100mMTrisCl(pH8.0),10mMNaCl,25mMEDTA(pH8.0),2%(3-巯基乙醇(使用前加入))，盖紧盖子，立即剧烈涡旋振荡30s，使粉末完全分散在溶液中，65'C温浴2-5min,期间剧烈涡旋振荡3-5次，冷却至室温后，向上述混合液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，每次涡旋振荡5min后，室温或18。C下10,000rpm离心15min，转移上清至新的离心管中，加入1/4体积lOMLiCl,混匀，4。C过夜沉淀后，4°C，10,000rpm离心20min收集沉淀，用500juLSSTE(l.OMNaCl，0.5%SDS，10mMTrisCl，1mMEDTA)缓冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿/异戊醇再抽提l-2次。转移上清后加入2倍体积无水乙醇，-2(TC放置2h或—70。C放置30min,4。C，10，000rpm离心20min,沉淀RNA，先后用500)aL70y。乙醇、500mL无水乙醇漂洗沉淀，超静台上吹干后，用30jaLRNase-freeddH20溶解。琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测其质量并计算总RNA含量(RNA含量=0260x0.04x稀释倍数)，保存于-8(TC超低温冰箱中备用。2.牡丹ft-^:s2基因同源片段的克隆(1)反转录取2iag上述总RNA,加DEPCddH20至9.5|aL，70°C变性5min，立即冰洛2min后稍微离心。按表1依次加入各组分。42。C水洛60min，-2(TC保存备用。表1反转录体系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)PCR扩增按表2依次加入各组分后进行PCR扩增。所用引物为:ACS-F:5'-CGGGATCCGTATCAAGATTATCATGG-3'ACS-R:5'-AACTGCAGGAGAGGCTGTAGAGAATATG-3'表2PCR反应体系组分体积(w1)PCR程序ddH2013PCR10Xbuffer(Mg2+，2.0mM)2.595°C4mindNTPmix(2.5mM)230-35cycles:引物1(ACS-F)2"95°Clmin引物2(ACS-R)2<53°C40s反转录产物、72'ClminTaqDNA聚合酶0.572°C7min(3)PCR产物琼脂糖凝胶回收将PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，紫外灯下切取与预期片段大小一致的条带回收，操作方法详见北京天根生化有限公司产品琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书。(4)连接取PCR产物7pL,分别加入lpLT4DNA连接酶10xBuffer,lpLT4DNA连接酶和lpLpGEM-T载体至总体系lOiaL后，混勻，置16'C条件下连接过夜，然后置-2(TC保存。(5)转化大肠杆菌DH5a感受态细胞及阳性克隆筛选A.大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备釆用氯化钙制备法，方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)。B.制备LB固体培养基(加100mg/LAmp)，其中含有50jag/mL的氨节，黑暗中将4)aLIPTG(200mg/mL)及40|aLX-gal(20mg/mL)均匀涂布于平板上，正向吸收l-3h。C.用无菌吸头吸取200nL感受态细胞(冰上操作)置1.5mL7预冷的无菌Eppendorf管中，加入10jaL连接产物，轻轻混匀(用手指轻弹管壁3-4下)，立即置于冰上30min。D.将管置42。C恒温水洛中热激90s,期间尽量防止摇动，并立即放回冰上2min。E.加入800uL不含抗生素的LB液体培养基，颠倒混匀，于37。C振荡培养1-2h(150r/min)。F.5000rpm离心3min后，吸去600juL上清液，将沉淀重新悬浮，于无菌条件下用细菌涂布器将上述培养物均勻涂布于LB固体培养基上。G.平板于37。C正向放置至液体完全被培养基吸收后，倒置培养过夜至长出单菌落(12-16h)。H.用无菌牙签挑取白色单菌落于LB(Am+)液体培养基中，37'C条件下振荡过夜，提取质粒DNA并进行菌液PCR鉴定。(6)阳性克隆的质粒酶切鉴定取经PCR鉴定的单菌落菌液，接种于LB(Am+)液体培养基中，培养至对数生长期，碱法小量提取质粒DNA。取质粒7pL，加入2pL酶切缓冲液和lpL五coRI酶，ddH20补足20pL,放至37。C下酶切1-2h后进行琼脂糖凝胶电泳检测，将连接正确的单克隆委托北京奥科生物公司完成测序工作。3.牡丹基因cDNA全长序列的获得(图1)按照Race试剂盒SMARTRACEcDNAAmplificationKit说明书合成5'和3'RACEcDNA第一链，以此为模版分别进行RACE扩增。其中3'RACE特异性引物为5'-AGCCTCGTTTCATTAGCATTGCAG-3'，5'RACE特异性引物为5'-CTCATGACAATGCGGTCTGGATCGA-3'，在94°C30s，57°C30s，72°C2.5min条件下完成28个循环。PCR产物凝胶回收、连接、转化及鉴定等步骤同上。对阳性克隆测序后，将两末端序列与RT-PCR所得到的中间序列相拼接获得A-JCS7基因cDNA全长序列。4.户s-JCWcDNA全长序列釆用RT-PCR和RACE-PCR相结合的方法，获得长度为1766bp的牡丹Z^-v4GS7cDNA全长序列(图1)。利用NCBI提供的ORFFinder进行序列分析发现，该cDNA全长包含有一个1479bp的开放读码框，编码492个氨基酸，5'非翻译区长146bp，3'非翻译区长141bp。ProtParam(http:〃au.expasy.org/tools/protparam.html)预观B亥蛋白的分子量是54.91kD,理论等电点为7.15。利用prosite软件(http:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa—automat.plpage=npsa_prosite.html)预测编码蛋白的特定功能位点发现，A-v4GS7全长cDNA编码蛋白含有1个N-糖基化位点(N-glycosylationsite)(位于179-182氨基酸残基NFTV)、2个环磷酸腺苷和环磷酸鸟苦依赖的蛋白激酶磷酸化位点(cAMP-andcGMP-dependentproteinkinasephosphorylationsite)(位于302-305位的氨基酸残基RKMS和445-448位的氨基酸残基KKQS)、4个蛋白激酶C礫酸化位点(ProteinkinaseCphosphorylationsite)(221-223位的氨基酸残基TLK，457-459位的氨基酸残基SFK，460-462位的氨基酸残基SGK,469-471位的氨基酸残基SPR)、3个酪蛋白激酶II磷酸化位点(CaseinkinaseIIphosphorylationsite)(185-188位的氨基酸残基SALE,254-257位的氨基酸残基SIAE,292-295位的氨基酸残基SYND)、10个N-肉豆蔻酰化位点(N-myristoylationsiteX位于19-24位的氨基酸残基GNGHGE，53-58位的氨基酸残基GLAENL，113-118位的氨基酸残基GGRVTF，308-313位的氨基酸残基GLVSTQ等)以及1个转氨酶I类磷酸吡哚醛辅基结合位点(Aminotransferasesclass-Ipyridoxal-phosphateattachmentsite)(位于275-288位的氨基酸残基SLSKDMGFPGFRVG)。对/V^4CWcDNA全长推测的氨基酸序列进行分析发现(图1),所编码的开放阅读框中存在所有的保守区(ZarembinskiandTheologis，1997;BleekerandKende，2000)，其中一个保守区中还包含了具有结合磷酸吡哆醛和蛋氨酸能力的赖氨酸残基活性位点(SLSKDMGFPGFRVG)(Yipetal.,1990)。另外，i亥氨基酸序列中还含有11个在所有转氨酶中都存在的氨基酸残基。实施例2探针的制备及杂交检测1.探针制备按照PCRDIGprobesynthesisKit(Roche，Cat.No.1636090)说明书，将RT-PCR获得的iVJCW中间片段进行地高辛标记，制备探针A。另外，根据A"C57靠近3'端的序列，设计一对特异引物，Ps-ACS1F:5'-CAGGTCTCTTCTTATGGATGG-3'，Ps-ACSIR:5'-GTAATTAAGCTCGAAGAAGGG-3',以/V^CS73'RACE的产物为模板，进行扩增片段的地高辛标记，制备特异性探针B。反应结東后，取3MlPCR产物检测标记情况，剩余的探针放于-2(TC冰箱中保存备用。2.Southern杂交(1)主要试剂及其配制A.变性液0.5MNaOH,1.5MNaCl。B.中和液0.5MTris碱，1.5MNaCl，调pH值至7.5。C.20xSSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g,加ddH20至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddHiO定容至1000ml,高压灭菌(3MNaCl，3M柠檬酸钠)。D.预杂交液7%SDS，50%去离子甲酰胺，5xSSC，2%Blockingreagent,50mMPh7.0NaH2P04。E.洗膜液I:2xSSC，0.1%SDS。F.洗膜液II:O.lxSSC,0.1%SDS。G.马来酸溶液0.1M马来酸，0.15MNaCl，用NaOH固体调节pH至7.5(20°C)。H.Washingbuffer:马来酸溶液中加入0.3%(v/v)Tween20。I.10xblocking:将阻断剂粉末溶于马来酸溶液中至终浓度为10%(W/V),振荡并加热助溶，高压灭菌后，保存在-20'C。J.封闭液按10:1的比例用马来酸溶液稀释10Xblocking，现用现配。K.检测液O.lMTris-HCl，0.1MNaClpH9.5(20°C)。L.抗体溶液取出抗体AP(Anti陽Digoxingenin)，10,000rpm离心5min,从表面吸取液体。用封闭液按10000-20000:1稀释，终浓度为75-37.5mU/ml，现用现配。M.显色液按1:100稀释CDP-Star于检测液中。(2)基因组DNA酶切基因组DNA提取按文献(MurrayandThompson,1980)的方法进行。取基因组DNA30jJg分别经五coRI、￡coRV、///"dn等根据酶说明书进行酶切过夜。取5jil酶切产物在0.8%琼脂糖凝胶上80V电泳lh，紫外检测酶切是否彻底。如彻底，则将剩余的酶切产物上样电泳，用于转膜杂交。(3)电泳向酶切产物中加入1/10V的上样缓冲液，充分混匀，离心收集，65。C变性10min,冰激5min后，进行0.8%琼脂糖凝胶电泳(电压1~2V/cm)8h，至溴酚兰迁移至胶的2/3处。(4)转膜按《分子克隆实验指南》(第三版)进行。(5)杂交A.取适量预杂交液(20ml/100cm2)于杂交管中42。C预热后，将膜置于管内，不含DNA—面紧贴管壁，排尽气泡，密封，42匸预杂交至少lh。B.按照2-4plPCR探针标记产物/100cm2，取适量探针到1.5ml离心管中，密封后，置沸水中5-10min变性，然后立即放于冰上5min，用预热的适量预杂交液(3.5ml/100cm2)稀释，混匀。C.倒掉预杂交液，沿管壁加入混匀的杂交液，注意不要直接加到膜上并避免产生气泡，42'C杂交过夜。D.杂交完成后，将杂交液回收于一可耐低温又可沸水洛的试管中，贮存在-20'C以备重复使用。重复使用时，解冻并在68'C下变性10min。(6)洗膜A.杂交膜取出后置于塑料盒中，用洗膜液I，室温下洗膜2次，每次5-10min，除去非结合探针以减少背景。B.洗膜液II,60-65°C洗膜2次，每次15min。(7)杂交信号的检测按照CDP-Star(购自德国Roche公司)说明书进行。3.Northern杂交(1)主要试剂及其配制A.0.5MEDTA:EDTA16.61g加ddH20至80ml，调pH至8.0，定容至100ml,力口DEPClOOjal,振荡，37。C过夜，高压灭菌。B.1MNaAc:NaAcl3.6g加ddfLO至100ml,力卩DEPC100ju1，振荡，37'C过夜，高压灭菌。C.10xMOPS缓冲液准确称取41.86gMOPS溶于700mlDEPC-H20中，用2mol/LNaOH调pH值至7.0，加入DEPC处理的20ml1MNaAc和20ml0.5MEDTA(pH8.0)，DEPC-H20定容至1L,过滤灭菌后避光保存(200mMMOPS，pH7.0,50mMNaAc,10mMEDTA)。D.甲醛凝胶加样缓冲液50%甘油，ImMEDTA(pH8.0),0.25%(m/v)溴酚蓝，0.2mg/ml溴化乙锭。E.RNA样品缓冲液10%10xMOPS缓冲液，17%甲醛，45%去离子甲酰胺。F.10x甲醛凝胶电泳加样缓冲液50%甘油(稀释于DEPC处理水中)，10mMEDTA(Ph8.0),0.25%(m/v)溴酚蓝。G.20xSSC:NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g,加ddH20至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddJLO定容至lOOOml。DEPC处理、高压灭菌(3MNaCl，3M杼檬酸钠)。其余试剂的配制参考Southern杂交部分。(2)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳A.取不同开花级别的牡丹'洛阳红，花瓣提取RNA。B.制胶将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。配制1.2%甲醛变性胶称取1.2g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入80mlDEPC处理水，微波炉内低火加热熔化均匀。待胶凉至60-7(TC时，依次向其中加入10ml甲醛和10ml10xMOPS缓冲液，混句后立即倒入制胶槽内(注意避免产生气泡)，盖上保鲜膜，室温放置至少lh。C.将RNA样品冰上溶解，用DEPC处理水稀释至2jag/jal。取10jil稀释好的RNA样品于DEPC处理过的500jul小离心管中，加入30inlRNA样品缓冲液和1julEB，混勻，将离心管置于65。C水浴中保温10min,再置于冰上2min;每管中加入4jal甲醛凝胶加样缓冲液，混匀。D.上样将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液(lxMOPS缓冲液)，液面高出胶面l-2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔。E.电泳盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的电压下电泳lh左右，颠倒正负极与凝胶方向，以保证缓冲液的pH值稳定，继续电泳lh左右，当溴酚蓝到达胶长的3/4时停止电泳。电泳结東后，即可在紫外灯下检测结果。G.观察完毕，将胶切除一角，DEPC处理水淋洗3次，每次至少5min,以彻底去除甲醛，再用10V的20xSSC浸泡20min，以备转膜。(3)转膜、杂交、洗膜、检测等步骤同Southern杂交。4.A"C^7特异性探针序列及特异性检测结果扩增得到的AdC57特异性探针序列横跨编码区的3'末端和部分3'非翻译区，长为399bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示。Southern杂交。将'洛阳红，幼嫩叶片中提取的30|ugDNA,以五coRI(a)、EcoRV(b)、历"^in(c)进行酶切，0.8%(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上，分别以地高辛标记的中间片段探针A和特异性探针B进行杂交，其中，探针A在全长中的起始位点为410-986bp,探针B在全长中的起始位点为123l-1630bp。通过Southern杂交，以A"C57中间序列合成的探针作为对照，检测该探针的特异性(图2)。结果表明利用中间片段为探针进行杂交后，EcoRI酶切的泳道出现4条带、EcoRV酶切的泳道出现两条带、i^w/in酶切后出现1条主带和3-4条弱带，说明基因组中存在^CS基因家族的不同成员，该探针可以和不同的成员进行杂交，在基因表达分析研究中会造成不同成员之间的表达干扰。而釆用A"CW特异性探针进行杂交发现在各泳道上均只出现l个条带(图2,B)，从而排除了该基因在基因组中为多拷贝的可能，并证明该探针可作为A4CS7的特异性探针用于Northern杂交。Northern杂交。将开花指数为l级的牡丹花技瓶插于盛有200mL蒸馏水的容器中，分成三组，每组50枝，分别放置在100L的玻璃箱内。用注射器向其中一个已密封好的玻璃箱内注入乙烯，使箱内乙烯终浓度达到10nL.L-1;另一个箱内放置适量l-MCP粉末，使加水溶解后释放的l-MCP气体浓度达到l.OiaLU1，迅速密封；密封对照花材的玻璃箱内不注入任何气体，2(TC放置6h。处理期间为防止C02积累，箱内放置100mL1N浓度的NaOH溶液。处理结東后将花枝取出，每天定时按开放级别各取4支(每支作为一个重复)，分别测定切花的内源乙烯生成量，然后按照每3g花瓣为一包进行取样，锡箔纸包好，液氮速冻后保存于-80'C超低温冰箱中，用于取样提取总RNA。每个泳道为20/ag总RNA，以rRNA为内参来衡量总RNA上样量。数字代表牡丹切花的开花指数。每次杂交均重复至少两次。利用该特异性探针进行Northern杂交。结果如图4所示，AJGS7在对照切花开放前期(1-3级)一直没有检测到，当切花达到4级时才开始表达，并在开放后期强烈增强。乙烯显著促进了iV^CS7的表达，处理结東后，切花仍处于1级时便可以检测到其转录产物的积累，随着花朵的开放，尸^4C57的表达量在2、3级逐渐下降，然后在开放至4级时又恢复到1级的水平。与对照相似的是，乙烯处理的切花A"GS7在5级时也强烈增强，且其表达量明显受到外源乙烯的诱导。在切花整个开放进程中，/VJGS7受到l-MCP处理的显著抑制，只在花朵盛开至5级时才检测到少量表达。说明该探针可以被用来进行基因表达分析研究。5.釆用SEQIDNO.l上的第40位至260位的片段作为探针，按照上述方法分别进行Sorthern和Northern杂交并检测。结果表明，在Southern杂交中，不同酶切处理的各泳道上均出现单一条带，且Northern杂交能够检测出不同处理后牡丹花瓣中AJCS7的表达，说明该探针能够特异性地检测基因。6.釆用SEQIDNO.l上的第IOO位至320位的片段作为探针，按照Southern杂交中，不同酶切处理的各泳道上均出现单一条带，且Northem杂交能够检测出不同处理后牡丹花瓣中/V^GW的表达，说明该探针能够特异性地检测基因。参考文献萨姆布鲁克J，弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T,著.分子克隆实验指南.第3版.北京:科学出版社，2002.史国安，郭香凤，韩建国，等.牡丹开花和衰老期间乙烯及脂质过氧化的硏究[J].西北农业大学学报1999,27(5):50-53.史国安，杨正申，王长忠，等.温度和化学药剂对牡丹切花乙烯释放及贮藏品质影响[J].北方园艺，1997，6:62—63.BleeckerAB,KendeH.Ethylene:agaseoussignalmoleculeinplants[J],AnnuRevCellDevBiol2000，16:1-18.BuiAQ.,O'NeillSD.Three1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthasegenesregulatedbyprimaryandsecondlypollinationsignalsinorchidflowers[J].PlantPhysiol,1998,116:419-429.GeL，LiuJZ，^^ongWSetal.Identificationofanovelmultipleenvironmentalfactorresponsive1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthasegene，NT-ACS2,fromtobacco[J].PlantCellEnviron.2000,23，1169-1182.JiaPY，ZhouL，GuoWW，etal.Postharvestbehaviorandendogenousethylenepatternoftree-peonycutflowers[C].InternationalSocietyforHorticulturalScience.27thInternationalHorticulturalCongress&ExhibitionAbstracts.SeoulKorea,2006:267.JohnsonPR,EckerJR,Theethylenegassignaltransductionpathway:amolecularperspective[J].AnnuRevGenet，1998,32:227-254.MurrayMG，ThompsonWF，，RapidisolationofhighmolecularweightplantDNA[J].NucleicAcidRes，1980，8:4321-4325.ParkKY，DroryA,WoodsonWR.Molecularcloningofan1-aminocyclopropane-l-carboxylatesynthasefromsen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ArgAla490tatgtaatttagaacaaattgatgeattetttcctgtggtccatttaattgactgtagacaagaggaagaaattcga肪g<210〉3〈211〉492<212>PRT〈213〉牡丹肌cAsntctSerccaPro485cttLeucctPro470caaGinagaetcArgLeu455cgtatgArgMetteacccSerPro3gCSerMetcttLeu<400>3GlyPheThrAlaMet1AlaGlyLysValGin65GlyPheGlyAlalie50GluHeProGlyThr130Tyr35GinTrpAsnGluArg115GlyMetAsn20AspMetValGluPhe100ValAlaSer5GlySerGlyLeuPhe85ArgThrHisThrHisAsnLeuAsn70ArgAsmPheGluAspGlyProAla55AsnAspAlaAsplie135GinGluPhe40GluProThrValPro120LeuGinAsp25HisAsnLysAlaAla105AspAlaLys10SerLeuLeuAlalie90LysArgPheGinProAsnLeuSer75PhePhelieCysLeuTyrAsnSer60lieGinMetValCeu140LeuPheAsn45PheCysAspGlyMet125AlaSerAsp30ProAspThrTyrLys110SerAspLys15GlyAsnValProHis95ValGlyProMetTrpGlylieGlu80GlyGlyGlyGly151715651613166517251766AspAlaPheLeuValProThrProTyrTyrProGlyTyrAspArgAsp145150155160LeuSerLysProlie225lieGluVallieSer305MetAsnValAspLeu385SerAsnPheTrpAsp465HisArgAsnAlaSer210ValTyrlieTyrVal290SerLeuLysGlyLeu370TrpSerlieAlaGin450ValSerTrpAsnGin195AsnAsnAlaValSer275TyrPheSerLeulie355SerArgPheAspLeu435AsnLysProArgPhe180AlaProPheAlaAsn260LeuSerGlyAspAla340AsnSerValHisAsp420LysAsnLeulieThr165ThrAlaLeulieThr245AspSerTyrLeuGlu325GluPheLeulieCys405AlaAlaAsnSerPro485GlyValAsnGlyAsn230ValMetLysAsnVal310HisArgLeuLeulie390SerThrLysLeuPro470GinAlaThrlieThr215GluPheAsnAspAsp295SerPheGinLysCys375AsnGluMetGluArg455ArgSerGinlieLys200ValCysSerGlyMet280AlaThrlieArgSer360GluGluProAspAla440LeuMetProLeuSer185ValLeuAsnHisVal265GlyValGinGluLeu345AsnLysValGlylie425AspSerMetLeuLeu170AlaLysAsnliePro250AsnPheValThrArg330PheAlaThrLysTrp410AlaValPheSerVal490ProLeuGlyGlyHis235ArgArgProAsnGin315TyrThrGlyValLeu395PheLeuProLysPro475ArgValGluLeuGlu220CeuPheAsnGlyCys300HislieArgLeuGlu380AsnArgArgArgSer460CysAlaGinLeulie205ThrVallieLeuPhe285AlaLeuValGlyPhe365AlaValValArgLys445GlyMetCysAla190lieLeuCysSerlie270ArgArglieGluLeu350LeuGluSerCyslie430LysLysArgAsp175TyrAsnLysAsplie255HisValCysAlaSer335SerTrplieProPhe415LeuGinTyrSerSerGluAsnThrGlu240AlaValGlyMetSer320AlaGinMetThrGly400AlaThrSerAspPro480〈210>4<211>26<212>DNA〈213〉人工序列<400>4CGGGATCCGTATCAAGATTATCATGG26<210>5<211>28<212〉DNA<213〉人工序列<■>5AACTGCAGGAGAGGCTGTAGAGAATATG28权利要求1、牡丹ACC合成酶基因Ps-ACS1特异性探针，其具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或者其有效长度片段。2、如权利要求l所述的探针，其特征在于，所述有效长度片段大于60bp。3、如权利要求2所述的探针，其特征在于，所述有效长度片段靠近SEQIDNO.l序列的3'端。4、含有权利要求13任一项所述探针的试剂盒。5、权利要求13任一项所述探针或者权利要求4所述试剂盒在检测牡丹ACC合成酶基因/^JGS/中的应用。全文摘要本发明提供了一种牡丹ACC合成酶基因Ps-ACS1特异性探针，其具有序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，或者其有效长度片段。实验表明，本发明探针能够用于Ps-ACS1基因的特异性检测，避免了在基因表达分析研究中因为同源性较高而带来的其它基因家族成员的表达干扰，有利于在此基础上研究ACS不同成员在牡丹乙烯反应中的调控机理及作用模式。为全面了解乙烯与牡丹切花开花衰老的关系、揭示乙烯在其采后开花和衰老进程中的作用模式和调控机制提供了基础。文档编号C12N15/11GK101603079SQ200810114829公开日2009年12月16日申请日期2008年6月12日优先权日2008年6月12日发明者琳周,王玮然,丽董,贾培义申请人:北京林业大学