牡丹ACC氧化酶基因Ps-ACO1特异性探针的制作方法

专利名称：牡丹ACC氧化酶基因Ps-ACO1特异性探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及牡丹ACC氧化酶基因 iVJC(97的特异性探针。
背景技术：
牡丹(尸"eom'a w,w"cora )是中国传统名花中的精品，素有"国 色天香"、"花中之王"的美誉，它花大色艳，不仅深受我国人民的喜 爱，而且也符合西方人的审美观，因此逐渐成为目前世界上最流行的 花木之一。近年来，随着巿场对鲜切花需求的日益增长，除了园林用 苗及盆花以外，牡丹切花的潜在国际巿场也日趋扩大。然而，由于牡 丹自然花期集中、单朵花花期短、采后贮运保鲜技术不过关，致使鲜 切花质量难以保证、无法实现长期和远距离供货，这不仅成为制约我 国牡丹切花产业化生产的重要因素之一，而且为此还失去了很多创汇 良机。
被称为衰老激素的乙烯与切花衰老的关系密切，多年来一直是切 花衰老研究的热点。目前，已发现乙烯的大量产生是促使牡丹切花衰 老的重要生理原因之一(史国安等，1997， 1999);在此基础上，我 们对13个牡丹品种内源乙烯代谢特征进行分析发现，以牡丹'洛阳 红，为代表的几种切花乙烯释放量与花朵开放衰老进程密切相关(Jia etal.，2006)，但其对外源乙烯的反应却非常复杂(Zhou et al.， 2006 )。 因此，为了探明乙烯在牡丹切花开放衰老进程中的作用机理，从而为 其釆后保鲜技术的开发提供理论依据，还需要更深入的研究。
自乙烯生物合成途径揭示以来(Yang and Hoffman, 1984)，切花 乙烯致衰机理的研究逐渐进入到分子水平。在乙烯生物合成途径中， 有ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)两个关键酶。其中，ACO在植物乙烯生物合成途径中将ACC氧化生成乙烯，是整个过程
中的最后一个酶。早期的研究表明，把外源的ACC供给植物组织就
能使乙烯的生成量增加，从而认为它是组成性的，不构成乙烯生物合
成的限速酶。但近年来也有一些研究发现，IAA能够促进乙烯产量的 增加是通过乙烯自身诱导了 ^CO基因的转录来实现的，因此，ACO 也有可能是影响乙烯生物合成途径中的一个限速酶，并且^C(9基因 的表达是非组成型的，其转录水平上的调控可能控制着乙烯的生成速 率(ten Have and Woltering， 1997)。目前，鍔梨(McGarvey a/" 1990)、香石竹(Woodson etal., 1992)、杉^ ( Callahan et al.， 1992)、 苹果(Dongetal.， 1992 )、蝴蝶兰(O'Noill et al.， 1993 )、拟南芥(Kieber etal., 1997)等物种的ACO基因cDNA克隆已相继获得，有关爿CO 基因的表达分析研究也已在多种切花中开展起来，其中以模式植物香 石竹研究得最为深入，现已通过导入反义JCO基因成功抑制了其自 身的表达，使得乙烯产量显著下降，花瓣卷缩受到抑制，切花寿命明 显延长(Savineta1.,1995)。
迄今为止，有关乙烯在牡丹切花釆后衰老中的作用机理研究仍为 空白，更没有分子水平上的相关研究。为探明牡丹切花开放衰老进程 中JCO基因是否存在调控作用，为其釆后保鲜技术的开发、乃至转 基因育种提供理论依据，牡丹'洛阳红'花瓣中的P^4COf被首次 分离，并合成了该基因的特异性探针，避免了在基因表达分析研究中 因为同源性较高而带来的其它基因家族成员的表达干扰，有利于在此 基础上研究JCO不同成员在牡丹乙烯反应中的调控机理及作用模 式。

发明内容
本发明的目的在于提供牡丹ACC氧化酶基因iV^Q9/的特异性 探针，为A"CO/基因的后续功能研究和应用提供基础。
本发明所述的特异性探针具有序列表SEQ ID NO.l所示的核苷酸序列或者其有效长度片段。本领域技术人员应能理解，这里所述的
有效长度片段是按照SEQ ID NO.l产生的指能够与尸^4C"特异杂 交的序列。这些序列长度优选60bp以上。
探针的标记物可以是放射性标记或者是非放射性标记，例如釆用
荧光标记。
可以将上述探针与适当的试剂组成试剂盒，以方便使用。 通过实验表明，本发明探针具有良好的特异性，能够用于
AJCO/基因的特异性检测。
本发明首次从牡丹'洛阳红'花瓣中分离iV^C07基因，并合 成了该基因的特异性探针，避免了在基因表达分析研究中因为同源性 较高而带来的其它基因家族成员的表达干扰，有利于在此基础上研究 ^CO不同成员在牡丹乙烯反应中的调控机理及作用模式。为探明牡 丹切花开放衰老进程中JCO基因是否存在调控作用，为其釆后保鲜 技术的开发、乃至转基因育种提供理论依据。


图1 /^"CO 基因cDNA全长核苷酸及推定的氨基酸序列； 图2 BlastP推导的A-JCO/氨基酸序列保守区预测； 图3 牡丹A"CO 基因Southern杂交分析，将'洛阳红，幼 嫩叶片中提取的30|ag DNA，以￡coRI (a)、五coRV(b)、历"Jin(c) 进行酶切，0.8% (w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后，转移至尼龙膜上，
以地高辛标记的特异片段作为探针进行杂交；
图4 乙烯和1-MCP处理对'洛阳红，花瓣内尸s"ca 基因表
达的影响，切花在测定乙烯生成量后立即用来花瓣取样提取总RNA, 每个泳道为20 ja g总RNA,以rRNA为内参来衡量总RNA上样量。 数字代表牡丹切花的开花指数。每次杂交均重复至少两次。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。
实施例l A"CO/基因的克隆
1. 牡丹花瓣总RNA的提取
(1) RNA提取所用的塑料、玻璃器皿和试剂配制均按《分子 克隆实验指南》(第三版)进行去除Rnase处理。
(2) 取牡丹'洛阳红，盛开期花朵的花瓣样品l.Og，液氮中研 磨至粉末后，迅速转入1.5mL离心管中，加入65T预热的CTAB提 取液600 ja L ( 2 % CTAB， 2 % PVP, 100 mM TrisCl (pH8.0), 10 mM NaCl， 25 mM EDTA (pH8.0) , 2% P-巯基乙醇(使用前加入))，盖 紧盖子，立即剧烈涡旋振荡30s,使粉末完全分散在溶液中，65'C温 洛2-5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次，冷却至室温后，向上述混合 液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，每次涡旋振荡5 min后，室温或18X:下10,000 rpm离心15 min,转移上清至新的离 心管中，加入1/4体积lOMLiCl,混匀，4。C过夜沉淀后，4°C， 10,000 rpm离心20min收集沉淀，用500 n L SSTE ( 1.0M NaCl， 0.5% SDS, 10mMTrisCl， 1 mM EDTA )缓冲液溶解沉淀，加入等体积的氯仿/ 异戊醇再抽提l-2次。转移上清后加入2倍体积无水乙醇，-2(TC放 置2 h或—70。C放置30 min， 4'C ， 10， 000 rpm离心20 min,沉淀RNA, 先后用500 jaL70y。乙醇、500 iaL无水乙醇漂洗沉淀，超静台上吹 干后，用30 nL RNase-free ddH20溶解。琼脂糖凝胶电泳和分光光 度计检测其质量并计算总RNA含量(RNA含量=0260 x 0.04 x稀释 倍数)，保存于-8(TC超低温冰箱中备用。
2. 牡丹i^^4CO 基因同源片段的克隆(1)反转录
取2pg上述总RNA,加DEPC ddH20至9.5 pL， 70°C变性5 min， 立即冰浴2 min后稍微离心。按表1依次加入各组分。42°C水洛60min， -2(TC保存备用。
表1反转录体系组分体积(Hi)
M-MLV 5xbuffer5
dNTPmix (2.5mM)
核糖核酸酶抑制剂0.5
Oligo dT2
DEPC ddH202
M-MLV RT1
(2) PCR扩增
按表2依次加入各组分后进行PCR扩增。所用引物为:
ACO-F: 5' -CGAAAATTGGGGTTTGTATGAGl ACO-R: 5' -TCGAAGCGCGGTTCCTTGG画3,
表2PCR反应体系
组分体积(u 1)PCR程序
ddH2013
PCR 10 X buffer (Mg2+，2,0mM)2.595 °C 4min
dNTP mix(2.5mM)230-35 cycles:引物1 (ACO-F)2"95 °C lmin
引物2 (ACO-R)2《51°C 40s
反转录产物、72。C lmin
TaqDNA聚合酶0.572 °C 7min
(3) PCR产物琼脂糖凝胶回收
将PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，紫外灯下切 取与预期片段大小一致的条带回收，操作方法详见北京天根生化有限 公司产品琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书。(4) 连接
取PCR产物7 nL，分别加入lpL T4 DNA连接酶10 x Buffer, 1 pL T4 DNA连接酶，和lpL pGEM-T载体至总体系10 pL后，混 句，置16'C条件下连接过夜，然后置-2(TC保存。
(5) 转化大肠杆菌DH5a感受态细胞及阳性克隆筛选
A. 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备釆用氯化钙制备法，方法
参照《分子克隆实验指南》(第三版)。
B. 制备LB固体培养基(加100mg/L Amp)，其中含有50 |ii g/mL的氨节，黑暗中将4(iL IPTG(200 mg/mL)及40 m L X-gal(20 mg/mL)均匀涂布于平板上，正向吸收l-3h。
C. 用无菌吸头吸取200 jaL感受态细胞(冰上操作)置1.5mL 预冷的无菌Eppendorf管中，加入10 jaL连接产物，轻轻混匀(用 手指轻弹管壁3-4下)，立即置于冰上30min。
D. 将管置42。C恒温水浴中热激90s，期间尽量防止摇动，并立 即放回冰上2min。
E. 加入800 iaL不含抗生素的LB液体培养基，颠倒混匀，于 37。C振荡培养1-2 h(150r/min)。
F. 5000rpm离心3 min后，吸去600 iuL上清液，将沉淀重新 悬浮，于无菌条件下用细菌涂布器将上述培养物均匀涂布于LB固体 培养基上。
G. 平板于37。C正向放置至液体完全被培养基吸收后，倒置培养 过夜至长出单菌落(12-16h)。
H. 用无菌牙签挑取白色单菌落于LB (Am+)液体培养基中，37 'C条件下振荡过夜，进行菌液PCR鉴定。
(6) 阳性克隆的质粒酶切鉴定
取经PCR鉴定的单菌落菌液，接种于LB ( Am+ )液体培养基中， 培养至对数生长期，碱法小量提取质粒DNA。取质粒7iaL ，加入2j^L酶切缓冲液和l|aL￡coRI酶，ddH20补足20|iL，放至37。C下酶切 1-2 h后进行琼脂糖凝胶电泳检测，将连接正确的单克隆委托北京奥 科生物公司完成测序工作。
3. 牡丹A"CO 基因cDNA全长序列的获得(图1)
按照Race试剂盒SMART RACE cDNA Amplification Kit说明 书合成5'和3' RACE cDNA第一链，以此为模版分别进行RACE 扩增。其中3' RACE特异性引物为5' -AGCAGCTCCTCGGCCAGT GTCTCT-3' ， 5' RACE特异性引物为5' -GATGCACCGTGTGATC GCTCAAAC-3',在94°C 30s, 59°C 30s， 72°C 2.5min条件下完成 28个循环。PCR产物凝胶回收、连接、转化及鉴定等步骤同上。对 阳性克隆测序后，将两末端序列与RT-PCR所得到的中间序列相拼接 获得/V」CO 基因cDNA全长序列。
4. /VJCO cDNA全长序列
将RT-PCR、 3' RACE、 5' RACE扩增所得的牡丹i^-^CO/基 因中间片段与末端序列相拼接，获得长度为1221bp的牡丹A"(X>7 cDNA全长序列(图1)。目前研究发现，在其他植物中分离得到的 力CO基因全长一般编码306-326个氨基酸(Pogsonetal., 1995 ),利 用NCBI提供的ORF Finder进行序列分析发现，该cDNA全长包含 有一个939bp的开放读码框和一个poly(A)尾巴，5'非翻译区长 65bp, 非翻译区长217bp，编码312个氨基酸。ProtParam (http:〃au.expasv.org/tools/protparam.html) 预观!l该蛋白的分子量是 35.22kD，理论等电点为5.32。
用BlastP对户^4CC^所编码的蛋白保守区进行预测发现，与该 基因匹配的蛋白保守区共两个，分别为双加氧酶家族的PcbC和依赖 于二价铁离子和2-酮戊二酸的双加氧酶家族的2-OG-FeII—Oxy (图 2 )，这与目前有关ACO蛋白性质的研究结果一致(Ververdis and John， 1991 )。禾!j用prosite教i^(htt.p:〃npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl page，sa圃ite.html)预测编码蛋白的特定功能位点发现， A"CO 全长cDNA编码蛋白含有1个蛋白激酶C磷酸化位点 (303-305位的氨基酸残基SVK)、 2个酪蛋白激酶II磷酸化位点 (116-119位的氨基酸残基SK正，120-123位的氨基酸残基TLAE ) 和4个N-肉豆蔻酰化位点(位于14-19位的氨基酸残基GGERAA， 134-139位的氨基酸残基GLEKGY， 153-158位的氨基酸残基 GTKVSN， 239 -244位的氨基酸残基GNRMSL )。
实施例2探针的制备及杂交检测
1. 探针制备
根据A-^靠近3'端的序列，设计 一 对特异引物，Ps-ACO1F: 5' -ATGGTAATAGGATGTCGCTTG-3' ， Ps-ACOIR: 5' -ACCCCA ACATTCTAAACACAC-3'，以iV^CO 3' RACE的产物为模板， 按照PCR DIG probe synthesis Kit (Roche,Cat.No. 1636090)说明书，进 行扩增片段的地高辛标记，制备特异性探针。反应结東后，取3 ML PCR产物检测标记情况，剩余的探针放于-20 °C冰箱中保存备用。
2. Southern杂交
(1)主要试剂及其配制
A. 变性液0.5MNaOH， 1.5MNaCl。
B. 中和液0.5MTris碱，1.5MNaCl，调pH值至7.5。
C. 20 x SSC: NaCl 175.3g、种檬酸三钠88.2g，加ddH20至 800ml，用2N NaOH调pH至7.0,再用ddHaO定容至lOOOml，高 压灭菌(3MNaCl， 3M狞檬酸钠)。
D. 预杂交液7%SDS, 50%去离子甲酰胺，5 x SSC， 2% Blocking reagent, 50mM Ph7.0 NaH2P04。
E. 洗膜液I: 2xSSC， 0.1%SDS。
F. 洗膜液II: O.lxSSC， 0.1%SDS。G. 马来酸溶液0.1 M马来酸，0.15MNaCl，用NaOH固体 调节pH至7.5 (20°C )。
H. Washing buffer:马来酸溶液中加入0.3%(v/v) Tween 20。
I. 10 x blocking: 将阻断剂粉末溶于马来酸溶液中至终浓度为 10%(W/V)，振荡并加热助溶，髙压灭菌后，保存在-20'C。
J.封闭液按10:1的比例用马来酸溶液稀释10 x blocking,现 用现配。
K.检测液O.lMTris-HCl， O,IM NaCl pH 9.5 (20°C)。
L.抗体溶液取出抗体AP ( Anti-Digoxingenin ) ， 10,000 rpm
离心5min,从表面吸取液体。用封闭液按10000-20000:1稀释，终
浓度为75 -37.5 mU/ml，现用现配。
M.显色液按1:100稀释CDP-Star于检测液中。
(2) 基因组DNA酶切
基因组DNA提取按文献(Murray and Thompson, 1980)的方法 进行。取基因组DNA 30 jag分别经五coRI 、五coRV、 等根 据酶说明书进行酶切过夜。取5pl酶切产物在0.8%琼脂糖凝胶上 80V电泳lh，紫外检测酶切是否彻底。如彻底，则将剩余的酶切产 物上样电泳，用于转膜杂交。
(3) 电泳
向酶切产物中加入1/10V的上样缓冲液，充分混匀，离心收集， 65。C变性10 min，冰激5min后，进行0.8%琼脂糖凝胶电泳(电压 l-2V/cm)8h，至溴酚兰迁移至胶的2/3处。
(4) 转膜按《分子克隆实验指南》(第三版)进行。
(5) 杂交
A.取适量预杂交液(20ml/100cm2)于杂交管中42'C预热后， 将膜置于管内，不含DNA—面紧贴管壁，排尽气泡，密封，42匸预 杂交至少lh。B. 按照2-4 MlPCR探针标记产物/100cm2，取适量探针到1.5 ml 离心管中，密封后，置沸水中5-10min变性，然后立即放于冰上5min， 用预热的适量预杂交液(3.5ml/100cm2)稀释，混匀。
C. 倒掉预杂交液，沿管壁加入混匀的杂交液，注意不要直接加 到膜上并避免产生气泡，42'C杂交过夜。
D. 杂交完成后，将杂交液回收于一可耐低温又可沸水浴的试管 中，贮存在-2(TC以备重复使用。重复使用时，解冻并在68"C下变性 10 min。
(6)洗膜
A. 杂交膜取出后置于塑料盒中，用洗膜液I，室温下洗膜2次， 每次5-10min。除去非结合探针以减少背景。
B. 洗膜液II, 60-65°C洗膜2次，每次15min。
(7 )杂交信号的检测按照CDP-Star (购自德国Roche公司)
说明书进行。
3. Northern杂交
(1)主要试剂及其配制
A. 0.5MEDTA: EDTA 16.61g力口 ddH20至80ml，调pH至8.0, 定容至lOOml，力口DEPC 100|ul，振荡，37。C过夜，高压灭菌。
B. 1MNaAc: NaAcl3.6g加ddtLO至100ml,加DEPC100jal， 振荡，37t:过夜，高压灭菌。
C. 10 x MOPS缓冲液准确称取41.86g MOPS溶于700ml DEPC-H20中，用2mol/LNaOH调pH值至7.0，加入DEPC处理 的20ml 1M NaAc和20ml 0.5M EDTA ( pH8.0 ) , DEPC-H20定容 至1L，过滤灭菌后避光保存(200mMMOPS, pH7.0, 50mMNaAc， 10mMEDTA)。
D. 甲醛凝胶加样缓冲液50%甘油，ImMEDTA (pH 8.0 )，0,25% (m/v)溴酚蓝，0.2mg/ml溴化乙锭。E. RNA样品缓冲液10%10xMOPS缓冲液，17%甲醛，45
%去离子甲酰胺。
F. 10x甲醛凝胶电泳加样缓冲液50%甘油(稀释于DEPC处 理水中)，10mMEDTA(Ph8.0)， 0.25% (m/v)溴酚蓝。
G. 20 x SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g,加ddH20至 800ml,用2NNaOH调pH至7.0，再用ddHiO定容至lOOOml。 DEPC 处理、高压灭菌(3MNaCl， 3M柠檬酸钠)。
其余试剂的配制参考Southern杂交部分。 (2)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
A. 取不同开花级别的牡丹'洛阳红，花瓣提取RNA。
B. 制胶将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。配制1.2% 甲醛变性胶称取1.2 g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入80ml DEPC 处理水，微波炉内低火加热熔化均匀。待胶凉至60-7(TC时，依次向 其中加入10ml甲醛和10ml 10xMOPS缓冲液，混匀后立即倒入制 胶槽内(注意避免产生气泡)，盖上保鲜膜，室温放置至少lh。
C. 将RNA样品冰上溶解，用DEPC处理水稀释至2iug/Ml。取 10jul稀释好的RNA样品于DEPC处理过的500 jal小离心管中， 加入30jli1RNA样品缓冲液和1 julEB，混匀，将离心管置于65。C水 浴中保温10min,再置于冰上2min;每管中加入4pl甲醛凝胶加样 缓冲液，混匀。
D. 上样将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液(l xMOPS缓冲液)，液面高出胶面l 2mm,小心拔出梳子使样品孔 保持完好。用微量移液器将制备好的样品加入加样孔。
E. 电泳盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于7.5V/ml的 电压下电泳lh左右，颠倒正负极与凝胶方向，以保证缓冲液的pH 值稳定，继续电泳lh左右，当溴酚蓝到达胶长的3/4时停止电泳。 电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。G.观察完毕，将胶切除一角，DEPC处理水淋洗3次，每次至
少5min,以彻底去除甲醛，再用10V的20 x SSC浸泡20min，以备转膜。
(3)转膜、杂交、洗膜、检测等步骤同Southern杂交。
4.」P^4CO/特异性探针序列及特异性检测结果
扩增得到的尸^4C(97特异性探针序列横跨编码区的3'末端和 部分3'非翻译区，长为338 bp,其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.l 所示。
Southem杂交。将'洛阳红，幼嫩叶片中提取的30 jn g DNA,以 五coRI (a)、五coRV(b)、历"dn(c)进行酶切，0.8% ( w/v )琼脂糖凝 胶电泳分离后，转移至尼龙膜上，以地高辛标记的特异片段作为探针 进行杂交。通过Southern杂交，检测该探针的特异性(图3)。结果表 明各泳道上均只出现一个条带，证明该探针可作为尸^4C(97的特异 性探针用于Northern杂交。
Northern杂交。将开花指数为1级的牡丹花技瓶插于盛有200 mL 蒸馏水的容器中，分成三组，每组50枝，分别放置在100L的玻璃 箱内。用注射器向其中一个已密封好的玻璃箱内注入乙烯，使箱内乙 烯终浓度达到10pL七"；另一个箱内放置适量l-MCP粉末，使加水 溶解后释放的l-MCP气体浓度达到1.0nL丄"，迅速密封；密封对照 花材的玻璃箱内不注入任何气体，20'C放置6h。处理期间为防止C02 积累，箱内放置100 mL 1N浓度的NaOH溶液。处理结東后将花技 取出，每天定时按开放级别各取4支(每支作为一个重复)，分别测 定切花的内源乙烯生成量，然后按照每3g花瓣为一包进行取样，锡 箔纸包好，液氮速冻后保存于-8(TC超低温冰箱中，用于取样提取总 RNA，每个泳道为20吗总RNA，以rRNA为内参来衡量总RNA上 样量。数字代表牡丹切花的开花指数。每次杂交均重复至少两次。利 用该特异性探针进行Northern杂交。结果如图4所示，iV^CO/的表达无论在对照、或乙烯、l-MCP处理的切花中都不随开放衰老的 进程产生变化，但受到乙烯与l-MCP处理的轻微促进或抑制。说明 该探针可以被用来进行基因表达分析研究。
5. 釆用SEQIDNO.l上的第65位至240位的片段作为探针，按照上 述方法分别进行Sorthern和Northern杂交并检测。结果表明，在 Southern杂交中，不同酶切处理的各泳道上均出现单一条带，且 Northem杂交能够检测出不同处理后牡丹花瓣中尸^4CO 的表达， 说明该探针能够特异性地检测A-」CO 基因。
6. 采用SEQIDNO.l上的第105位至310位的片段作为探针，按照 上述方法分别进行Southern和Northern杂交并检测。结果表明，在 Southem杂交中，不同酶切处理的各泳道上均出现单一条带，且 Northern杂交能够检测出不同处理后牡丹花瓣中的表达， 说明该探针能够特异性地检测iV^CO 基因。参考文献
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<110>北京林业大学
<120>牡丹ACC氧化酶基因/^-ZCW特异性探针
<130>
<160> 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211〉 338
<212〉 DNA
<213> 牡丹
<400〉 1
atggtaataggatgtcgcttgcttcgttttac肌cccgggaagcga_tgccgttatctatc60
cggcaccggctttgctaggg肌ag3ggcacaagtgtaccccaaattcatttttgaagact120
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tagtgttgtgttggttgttgttgtttgttggtgtgtgtgtgtgaccaaagctagtttaag300
tcaaaatggatg"ttt兆a^tgttggggt338
<210> 2
<211> 1221
<212> DNA
〈213> 牡丹
〈220>
〈221 > 5'UTR <222〉 (l)..卿
<220>
<221> CDS
〈222〉 (66)., (1004)
〈220>
〈221> 3'證
〈222> (1005).. (1221)
<400> 2
acgcggggag atcagtaaca cacaactcag agattgagag agagagagag agagaaagag 60 agaaa atg gca aac ttc cca gtg atc aac tta gag aaa cta aat ggt ggg 110 Met Ala Asn Phe Pro Val lie Asn Leu Glu Lys Leu Asn Gly Gly 15 10 15gag aga gca get acc atg gag ate ate aac gat get tgt gag aac tgg 158 Glu Arg Ala Ala Thr Met Glu lie lie Asn Asp Ala Cys Glu Asn Trp
20 25 30
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35 40 45
aca gta gaa aag ttg acs aag gag cat tac aag肌g tgt atg gag cag 254 Thr Val Glu Lys Leu Thr Lys Glu His Tyr Lys Lys Cys Met Glu Gin
50 55 60
aag ttc aag gaa ctg gtg gca age aaa get eta gag aca gaa_ ate aat 302 Lys Phe Lys Glu Leu Val Ala Ser Lys Ala Leu Glu Thr Glu lie Asn
65 70 75
gat atg gat tgg gaa age act ttc cac ttg cgc cat etc ccc ata tec 350 Asp Met Asp Trp Glu Ser Thr Phe His Leu Arg His Leu Pro lie Ser 80 85 90 95
aac atg get gaa att cct gat ctt gat gat gaa tac agg aaa gtc atg 398 Asn Met Ala Glu lie Pro Asp Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Lys Val Met
100 105 110
aag g犯ttt gca tea aaa ata gag aca ctg gcc gag gag ctg eta gac 446 Lys Glu Phe Ala Ser Lys lie Glu Thr Leu Ala Glu Glu Leu Leu Asp
115 120 125
ttg ata tgt gaa aat etc gga eta gag aaa ggc tac tta aag aag gcc 494 Leu lie Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly Tyr Leu Lys Lys Ala
130 135 140
ttt tat gga tec aag ggt cca acc ttt ggc acc aag gtc age aac tac 542 Phe Tyr Gly Ser Lys Gly Pro Thr Phe Gly Thr Lys Val Ser Asn Tyr
145 150 155
cct cca tgc ccc aaa cca gac ttg att aag gga etc cga get cac act 590 Pro Pro Cys Pro Lys Pro Asp Leu lie Lys Gly Leu Arg Ala His Thr 160 165 170 175
gat gcc ggt ggc ctt ate tta etc ttc caa gat gat cgt gtt age ggt G38 Asp Ala Gly Gly Leu lie Leu Leu Phe Gin Asp Asp Arg Val Ser Gly
180 185 190
ctt cag eta etc aaa gac gat cag tgg gtc gat gtt cct cct atg cgt 686 Leu Gin Leu Leu Lys Asp Asp Gin Trp Val Asp Val Pro Pro Met Arg
195 200 205
cat tec att gtg ate aac att ggt gat cag ctt gag gtg ate acc aat 734 His Ser lie Val lie Asn lie Gly Asp Gin Leu Glu Val lie Thr Asn 210 215 220
gga aag tac aag agt gtg atg ca_c cgt gtg ate get caa acc gat ggt 782 Gly Lys Tyr Lys Ser VaJ Met His Arg Val lie Ala Gin Thr Asp Gly 225 230 235Asn 240 ate lie
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830
878
926
974
1024
1084 1144 1204 1221
〈210> 3
<211> 312
<212> PRT
<213> 牡丹
<400〉 3
Met 1
Arg
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Phe
65
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Ala
Phe
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5 10 15
Met Glu lie lie Asn Asp Ala Cys Glu Asn Trp Gly
25 30 Val Asn His Gly lie Ser Pro Glu Phe Met A印Thr
40 45 Thr Lys Glu His Tyr Lys Lys Cys Met Glu Gin Lys
55 60 Val Ala Ser Lys Ala Leu Glu Thr Glu lie Asn Asp
70 75 80
Ser Thr Phe His Leu Arg His Leu Pro lie Ser Asn 85 90 95
Pro Asp Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Lys Val Met Lys 105 110
Glu Phe Ala Ser Lys lie Glu Thr Leu Ala Glu Glu Leu Leu Asp Leu 115 120 125lie Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly Tyr Leu Lys Lys Ala Phe
130 135 140
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Pro Cys Pro Lys Pro Asp Leu lie Lys Gly Leu Arg Ala His Thr Asp
165 170 175
Ala Gly Gly Leu lie Leu Leu Phe Gin Asp Asp Arg Val Ser Gly Leu
180 185 190
Gin Leu Leu Lys Asp Asp Gin Trp Val Asp Val Pro Pro Met Arg His
195 200 205
Ser lie Val lie Asn lie Gly Asp Gin Leu Glu Val lie Thr Asn Gly
210 215 220
Lys Tyr Lys Ser Val Met His Arg Val lie Ala Gin Thr Asp Gly Asn 225 230 235 240
Arg Met Ser Leu Ala Ser Phe Tyr Asn Pro Gly Ser Asp Ala Val lie
245 250 255
Tyr Pro Ala Pro Ala Leu Leu Gly Lys Glu Ala Gin Val Tyr Pro Lys
260 265 270
Phe lie Phe Glu Asp Tyr Met Lys Leu Tyr Ala Gly Leu Lys Phe Gin
275 280 285
Ala Lys Glu Pro Arg Phe Glu Ala Met Lys Ala Val Glu Glu Ser Val
290 295 300
Lys Leu Gly Pro lie Ala Thr Ala 305 310
<210> 4
<211> 22
<212> 廳 <213〉人工序列
〈400〉 4
CGAAAATTGG GGTTTGTATG AG 22
<210> 5
<211> 19
<212> 醒 <213>人工序列
〈400〉 5
TCGAAGCGCG GTTCCTTGG 19
权利要求
1、牡丹ACC氧化酶基因Ps-ACO1特异性探针，其具有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列，或者其有效长度片段。
2、 如权利要求l所述的探针，其特征在于，所述有效长度片段 大于60bp。
3、 如权利要求2所述的探针，其特征在于，所述有效长度片段 靠近SEQIDNO.l序列的3'端。
4、 含有权利要求l-3任一项所述探针的试剂盒。
5、 权利要求1~3任一项所述探针或者权利要求4所述试剂盒在 检测牡丹ACC氧化酶基因/^-^CO 中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种牡丹ACC氧化酶基因Ps-ACO1特异性探针，其具有序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者其有效长度片段。实验表明，本发明探针能够用于Ps-ACO1基因的特异性检测，为探明牡丹切花开放衰老进程中ACO基因是否存在调控作用，为其采后保鲜技术的开发、乃至转基因育种提供理论依据。
文档编号C12Q1/68GK101603078SQ200810114828
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者琳 周, 王玮然, 丽 董, 贾培义 申请人:北京林业大学