专利名称：一种产脂肪氧合酶的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种产脂肪氧化酶(lipoxygenase，EC 1. 13. 11. 12，简称L0X)的基因工程菌及其构建方法与应用，特别是一种高产脂肪氧化酶的基因工程菌及构建方法与应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
脂肪氧合酶(Lipoxygenase，ECl. 13. 11. 12，简称L0X)属氧化还原酶，能专一催化含有cis，cis-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其酯，使其通过分子内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化物。脂肪氧合酶又称不饱和脂肪酸氧化还原酶，存在于苜蓿、豌豆、扁豆、等豆科植物中，萝卜及马铃薯中也有，但以大豆中的活性最强。由大豆结晶的脂肪氧合酶，相对分子量为102000，等电点为5. 14。最适pH不能简单决定，而是受底物的溶解性左右，一般pH 6. 10-3. 10，最适温度在20-30°C之间。脂肪氧合酶可催化分子氧对面粉中具有戊二烯_1， 4双键的油脂发生氧化，形成氢过氧化物。氢过氧化物氧化蛋白质分子的巯基(-SH)形成二硫键(-S-S-)并能诱导蛋白质分子聚合，使蛋白质分子变得更大，从而起到强筋的作用。脂肪氧合酶可通过耦合反应破坏胡萝卜的双键结构，从而起到漂白面粉，改善面粉色泽的作用。而脂肪氧合酶催化亚油酸生成的过氧化物，可改善面包的香气，为面包增香。由此可见， 脂肪氧合酶兼具强筋和增白的功效，可以用来替代强筋剂溴酸钾以及减少漂白剂过氧化苯甲酰的用量。目前，国内外对脂肪氧合酶研究报道很少，主要集中于生理功能研究，关于高产脂肪氧合酶基因工程菌的报道则更少。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种产脂肪氧合酶(Lipoxygenase， ECl. 13. 11. 12，简称L0X)的基因工程菌，该菌株所携带的质粒上含有脂肪氧合酶基因，可分泌表达脂肪氧合酶基因。所述脂肪氧合酶基因来源于铜绿假单胞菌，该菌株于2011年5月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2011185，地址中国，武汉，武汉大学，其分类学命名为铜绿假单胞菌BBEO^ewi/offloaas aeruginosa BBE)。因大肠杆菌表达体系具有发酵周期短、蛋白表达量高、提取工艺成熟等优点，优选大肠杆菌表达体系为宿主。本发明要解决的技术问题之二是提供了一种脂肪氧合酶基因工程菌的构建方法。为解决上述技术问题提供如下技术方案 第一步脂肪氧合酶基因的获得
根据NCBI数据库中PA1169基因设计引物，以铜绿假单胞菌ATCC 15692为模板PCR克隆得到脂肪氧化酶基因；
第二步脂肪氧合酶(LOX)重组质粒的构建
为了使脂肪氧合酶基因能在大肠杆菌中的可控高效表达，选用带有T7启动子的表达载体(例如pET22b，美国^witrogen公司)，利用克隆得到的脂肪氧合酶基因序列端的 3'Nde限制性内切酶位点与5’端的HindIII限制性内切酶位点，将脂肪氧合酶基因克隆入载体pET22b ；由于在T7启动子后面有一段pelB信号肽序列，这也为脂肪氧合酶基因在大肠杆菌中的正确分泌表达奠定了基础；另外，由于pET22b载体中含有氨苄青霉素抗性基因， 在筛选重组菌时较为方便；
将含有脂肪氧合酶基因的载体与要连接的表达载体pET22b进行Nde和Hind III酶切， 连接得到含有脂肪氧合酶基因的重组质粒pET22b-L0X ； 第三步脂肪氧合酶基因工程菌的构建
将重组质粒pET22b-L0X转化宿主大肠杆菌(E coli Rosetta (DE3))，构建高效表达脂肪氧合酶的诱导型大肠杆菌基因工程菌；
本步骤采用的含脂肪氧合酶的重组表达质粒pET22b-L0X可转化大肠杆菌(B. coli Rosetta(DE3) hvitrogen)，成为能分泌表达外源脂肪氧合酶的功能大肠杆菌；在外源诱导物IPTG存在的情况下，T7启动子启动外源脂肪氧合酶基因的表达，信号肽指导表达产物进入大肠杆菌的分泌途径，正确切割成具有生物活性的外源蛋白表达产物，最终将产物分泌至胞外。大肠杆菌的转化常采用化学转化法首先接种活化后的大肠杆菌一环于25 mL LB 液体培养基中，37°C振荡培养过夜，然后将上述培养液转入25 mL LB(250 mL三角瓶)液体培养基中，37 ！振荡培养，培养直至菌体浓度0D_为0.3-0. 7。随后参照Takara公司 competent cell试剂盒制作感受态、转化。本发明要解决的技术问题之三是提供了一种脂肪氧合酶基因工程菌的应用方法。为解决上述技术问题，提供如下技术方案 第一步重组菌株的筛选
所述重组表达质粒pET22b-L0X上含有氨卞青霉素抗性基因，如果重组质粒转化进入大肠杆菌，重组菌株具有氨卞青霉素抗性，可在含有氨卞青霉素的平板上生长；涂布含氨卞青霉素抗性平板，挑取阳性转化子，即为产脂肪氧合酶的大肠杆菌工程菌五coli -LOX ； 第二步菌株经培养分泌脂肪氧合酶培养基组成(g/L)
种子培养基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5;
发酵培养基将下列组分溶解在0. 9 L水中蛋白胨12 g，酵母提取物M g，甘油4
mL。；
各组分溶解后高压灭菌；冷却到60°C，再加100 mL灭菌的170 mmol/L ΚΗ2Ρ04/0. 72 mol/L K2HPO4的溶液(2. 31 g的KH2PO4和12. 54 gK2HP04溶在足量的水中，使终体积为100 mL ；高压灭菌或用0. 22 μ m的滤膜过滤除菌)；
培养方法种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25 mL的三角瓶Q50 mL)中， 培养温度37°C，摇床转速200 r/min，培养12 h ；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为 25 mL的三角瓶Q50 mL)中，培养温度37°C，当OD6tltl达到0. 6时，将培养温度降为16°C，同时加入终浓度为1. 0 mM的诱导剂IPTG。脂肪氧合酶酶活测定方法
反应温度为25°C。3 mL体系中，178 mM硼酸，0. 011%(ν/ν)亚油酸，0. 01%(ν/ν)乙醇和 500-1000 U/mL的脂肪氧合酶。pH 9. 0，25°C下，3 mL体系中(1 cm比色皿)。每分钟变化吸光度0.001定义为一个酶活。本发明构建了一株高效分泌表达脂肪氧合酶的基因工程菌，解决了现有技术脂肪氧合酶产量低的问题；应用该菌种生产脂肪氧合酶，产量高、工艺简单、便于工业化应用，该菌株生产的目的蛋白直接分泌到胞外，提取过程简单，产品纯度高，发酵结束后脂肪氧合酶 (LOX)活力可达1000 U/mL。本发明为生物法生产脂肪氧合酶的研究、开发、生产工作奠定了基础，有利于早日实现面粉的生物漂白。
具体实施例方式以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。材料和方法所用限制性内切酶，T4 DNA连接酶，PCR试剂，DNA Marker等均购于 TaKaRa宝生物公司；大肠杆菌感受态细胞五c^iJM109，引物，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购于上海生工生物工程公司；电转仪购自Bio-Rad公司。实施例1 脂肪氧合酶基因的获得根据NCBI数据库中PA1169基因设计引物。:gggaattcca tatgaaacgc aggagtgtgc tcttgtcg 下游:cccaagcttt cagatattgg tgctcgccgg gate
引物3，端分别引入Nde I和Hind III酶切位点，以本实验室筛选铜绿假单胞菌DNA为模板PCR克隆得到脂肪氧化酶基因，将基因克隆到质粒pMD19T。所述铜绿假单胞菌于2011 年5月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2011185，地址中国，武汉，武汉大学，其分类学命名为铜绿假单胞菌BBE (Pseudomonas aeruginosa BBE)。实施例2 重组质粒pET22b_L0X的构建
带有脂肪氧合基因的载体和表达载体pET22b分别进行Nde I和Hind III双酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶进行连接。连接反应体系为(10 yL):目的基因片断2 yL，载体 DNA 2 μ L，IOX T4 连接酶 Buffer 1 μ L, T4 DNA 连接酶 1 μ ，蒸馏水 4 μ L。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109进行转化。转化方法如下
(1)无菌状态下取感受态细胞200μ L置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2μ L重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30 min；
(3)42°C热休克90 s (准确)，不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800uL；
(6)用无菌铺菌器将200μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37°C平放20 min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。 挑选阳性转化子，测序验证，结果表明连接成功。
实施例3 脂肪氧合基因工程菌的构建感受态大肠杆菌Rosetta(DE3)进行转化。转化方法如下
(1)无菌状态下取感受态细胞200μ L置于无菌的微量离心管中；
(2)每管加入1-2PL重组质粒，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30 min ；
(3)42°C热休克90 s (准确)，不要摇动离心管；
(4)快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(5)每管加入无抗生素的普通LB培养液800uL；
(6)用无菌铺菌器将200μ L菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板，37°C平放20 min直至液体被吸收，然后倒置培养过夜，观察。挑选阳性转化子，提取质粒验证，证明转化成功。实施例4 发酵生产脂肪氧合酶培养基组成(g/L)
种子培养基蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5。发酵培养基将下列组分溶解在0.9 L水中蛋白胨12 g，酵母提取物24 g，甘油 4 mLo各组分溶解后高压灭菌。冷却到60°C，再加IOOmL灭菌的170mmol/L ΚΗ2Ρ04/0. 72 mol/L K2HPO4的溶液(2. 31 g的KH2PO4和12. 54 gK2HP04溶在足量的水中，使终体积为100 mL。高压灭菌或用0.22 μπι的滤膜过滤除菌)。培养方法种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25 mL的三角瓶Q50 mL) 中，培养温度37°C，摇床转速200 r/min，培养12 h ；发酵培养，按10%的接种量接入装液量为25 mL的三角瓶050 mL)中，培养温度37°C，当OD6tltl达到0. 6时，将培养温度降为16°C， 同时加入终浓度为1. 0 mM的诱导剂IPTG，发酵M h胞外酶活达1000 U/mL。本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种产脂肪氧合酶的基因工程菌，其特征在于，所携带的质粒上含有脂肪氧合酶基因。
2.权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，是将脂肪氧合酶基因导入大肠杆菌。
3.权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述脂肪氧合酶基因来源于CCTCC NO :M 2011185。
4.权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述脂肪氧合酶基因位于表达载体 pET22b 上。
5.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤 第一步以CCTCC NO =M 2011185基因组为模板PCR克隆得到脂肪氧化酶基因； 第二步克隆脂肪氧合酶基因到表达载体pET22b ；第三步将所得的表达载体转化宿主大肠杆菌，构建高效表达脂肪氧合酶的诱导型大肠杆菌基因工程菌。
6.一种权利要求1所述大肠杆菌工程菌在脂肪氧合酶生产中的应用。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，每升发酵培养基组成如下蛋白胨 12 g，酵母提取物 24 g，甘油 4 mL, 2.31 g KH2PO4 和 12.54 g Κ2ΗΡ04。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60°C，再加灭菌后的磷酸盐缓冲溶液。
9.权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液的灭菌采用高压灭菌或滤膜过滤除菌。
全文摘要
本发明公开了一种产脂肪氧合酶(Lipoxygenase，EC1.13.11.12，简称LOX)的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明通过将脂肪氧合酶基因导入大肠杆菌，构建了一株高效分泌表达脂肪氧合酶的基因工程菌，解决了脂肪氧合酶产量低的问题。应用该菌种摇瓶条件下生产脂肪氧合酶，产量高达1000U/mL，并且该生产工艺具有简单、适于工业化应用等优点。
文档编号C12R1/19GK102268400SQ20111021230
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者堵国成, 孙福新, 宗伟刚, 张东旭, 蒋晓东, 陆信曜, 陈坚 申请人:宜兴协联生物化学有限公司, 江南大学