专利名称：一种产脂肪氧合酶铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
铜绿假单胞菌(A JaiT^iz70l5a)原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。专性需氧菌，生长温度范围25 42°c，最适生长温度为25 30°C。近些年，有研究报道指出，铜绿假单胞菌含有脂肪氧合酶基因。脂肪氧合酶(Lipoxygenase，ECl. 13. 11. 12，简称L0X)属氧化还原酶，能专一催化含有cis，cis-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其酯，使其通过分之内加氧，形成具有共轭双键的氢过氧化物。脂肪氧合酶又称不饱和脂肪酸氧化还原酶，存在于苜蓿、豌豆、扁豆、等豆科植物中，萝卜及马铃薯中也有，但以大豆中的活性最强。由大都结晶的脂肪氧合酶，相对分子量为102000，等电点为5. 14。最适pH不能简单决定，而是受底物的溶解性左右，一般pH 6. 10-3. 10，最适温度在20-30°C之间。脂肪氧合酶可催化分子氧，对面粉中具有戊二烯1， 4双键的油脂发生氧化，形成氢过氧化物。氢过氧化物氧化蛋白质分子的巯基(-SH)形成二硫键(-S-S-)并能诱导蛋白质分子聚合，使蛋白质分子变得更大，从而增强面筋的作用。脂肪氧合酶可通过偶合反应破坏胡萝卜的双键结构，从而起到漂白面粉，改善面粉色泽的作用。而脂肪氧合酶催化亚油酸生成的过氧化物，可改善面包的香气，为面包增香。由此可见， 脂肪氧合酶兼具强筋和增白的功效，可以用来替代强筋剂溴酸钾以及减少漂白剂过氧化苯甲酰的用量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种产脂肪氧合酶的铜绿假单胞菌，该菌株于 2011年5月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 2011185， 地址中国，武汉，武汉大学，其分类学命名为铜绿假单胞菌BBE iPseudomonas aeruginosa BBE)。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种筛选产脂肪氧合酶的铜绿假单胞菌的方法。解决上述问题的技术方案为油脂厂附近土壤样品用无菌水稀释后，涂布于含有含有0.5%亚油酸和0.5% β-胡萝卜素的LB平板上。挑选能够产生变色圈的菌株，接种到含有1%葡萄糖和m油酸的液体培养基中，30°C培养24h小时后分别测定胞外和胞内的脂肪氧合酶活性。本发明具有如下优点
1)筛选得到的铜绿假单胞菌能够产脂肪氧合酶。2)本发明提供的选育方法简单易行并且效果明显。
具体实施例方式实施例1铜绿假单胞菌(CCTCC NO =M 2010292)的筛选方法
从油脂厂采集土壤，将Ig 土壤与IOml无菌水混勻，用滤纸过滤，将滤液涂布于含有将土壤稀释液涂布于含有0. 005%亚油酸和0. 005% β-胡萝卜素的LB平板上，30°C培养20h 后，挑选菌落周围有变色圈的菌落于含有0. 005%亚油酸和0. 005% β-胡萝卜素的LB平板上划线。挑选划线有变色圈的单菌落，接种于GL培养基中，30摄氏度培养Mh，IOOOrpm离心aiiin，收集上清液测脂肪氧合酶活性；菌体用50mM，pH7. 0的Tris-HCl缓冲液复溶用超声破壁，破壁液IOOOrpm离心2min，取上清液测脂肪氧合酶活性。脂肪氧合酶活力为300U/mL。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种产脂肪氧合酶铜绿假单胞菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO :M 2011185。
2.—种权利要求1所述铜绿假单胞菌的筛选方法，包括如下步骤1)从油脂厂附近土壤采样；2)将土壤稀释液涂布于含有0.005%亚油酸和0. 005%β -胡萝卜素的LB平板上；3)挑选有变色圈的菌落接种到含有1%葡萄糖和1油酸的GL液体培养基中；4)将3得到的上清液和菌体破壁上清液分别检测酶活；5)将能检测到酶活的菌株在LB平板上划线分离，最终得到单菌。
3.—种权利要求1所述铜绿假单胞菌在脂肪氧合酶发酵生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株产脂肪氧合酶的铜绿假单胞菌及其筛选方法和应用，属于生物技术领域。本发明将土壤样品涂布于含有亚油酸和β-胡萝卜素的筛选平板上进行初筛，挑选有变色圈的菌株进行摇瓶复筛。成功筛选得到一株能产脂肪氧合酶的铜绿假单胞菌。本发明有效地提高了筛选产脂肪氧合酶菌株的效率，可用于选育产脂肪氧合酶的菌株。
文档编号C12N1/20GK102277317SQ201110212308
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月28日 优先权日2011年7月28日
发明者堵国成, 张东旭, 陆信曜, 陈坚 申请人:江南大学