专利名称：一种水稻丙酮酸激酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水稻丙酮酸激酶及其编码基因与应用。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，是世界上年产量超过五千万吨的三大粮食作物之一，是全世界三分之一以上人口的主要食物，在国民经济中占有举足轻重的地位。在禾谷类作物中水稻的基因组最小，约为389Mbp，其中高密度地分布有3-4万个基因。水稻的基因组与其它禾谷类作物的基因组存在共线性关系，目前已成为遗传学、分子生物学和基因组学研究的模式植物(Goff，1999；Goff et al.，2002；Yu et al.，2002)。
上述水稻的3-4万个基因的功能绝大多数是未知或假定的，因此，需要通过实验来鉴定其在水稻生长发育以及对环境应答过程中的功能。对水稻基因，特别是与重要农艺性状相关的基因的克隆和功能研究有助于阐明作物基因型和表型的内在联系，为水稻育种提供理论基础，同时也能为水稻育种提供新的育种材料。随着国际上水稻结构基因组研究及水稻测序工作的完成，其功能基因组学的研究已经成为全球研究的重点。
株高是农作物重要的农艺性状，水稻第一次绿色革命的兴起缘由于大面积地种植矮秆水稻品种，所以当前寻求新的矮秆资源又成为了育种工作者的目标。水稻矮化基因遗传主要有两种类型一类是由单基因控制的质量性状遗传，另一类是由多基因控制的数量性状遗传，多数矮化突变由一对隐性基因控制。
日本水稻基因连锁群和命名委员会(The Japanese Committee on Nomencla-ture and Linkage Groups of Rice Gene)将矮杆基因及少数半矮杆基因统一以d为符号，根据矮杆基因被鉴定的时间顺序，将其编号为d1到d61，其中缺d8、d15、d16、d25、d34和d36，共有55个以d命名的矮杆基因(Matsuo et al.，1997)；半矮秆基因以sd命名，如sd1-sd9等。
影响水稻株高的内源激素主要有两种赤霉素(GA)和油菜素类酯(BRs)。水稻的矮化或增高突变大多是由GA或BRs合成途径或信号传导途径的相关基因发生突变导致的。合成途径相关基因的突变体对外源施加的激素敏感，能恢复株高的表型，这类矮化突变称为敏感型突变；而信号传导途径相关基因的突变体对外源施加的激素不敏感，这类突变称为钝感型突变。
赤霉素是植物和真菌次生代谢二萜途径的产物，由前体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)形成。中间体GGPP是由异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophophate，IPP)分别在质体或胞质中合成的。最近发现在植物的质体中IPP是由甘油醛-3-磷酸和丙酮酸缩合成的5-磷酸木酮糖转化而成的，而不是由甲羟戊酸直接合成的(Hedden and Proebsting，1999)。Schwender等用稳定同位素示踪方法证明在植物中丙酮酸盐(PYA)是合成GA前体异戊烯焦磷酸(IPP)的前体，是GA合成的最初前体(Schwender J 1996；Lichtenthaler HK 1997)。
丙酮酸激酶是生物体内糖酵解途径中的一个重要酶，催化的反应是将底物磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸，同时产生ATP，在植物中丙酮酸激酶有很多重要的生理功能，如种子萌发时提供ATP和脂肪酸合成时提供碳骨架等(P.K.AMBASHT，2002)。丙酮酸激酶影响到GA合成的最初前体丙酮酸盐(PYA)的合成，由于GA是影响水稻株高性状的重要内源激素，因此，丙酮酸激酶最终影响到水稻的株高性状。
通过基因工程手段控制农作物生长是农业生产中成本更低廉、效益更高的增产措施，近年来，已克隆了许多与株高密切相关的基因。如从拟南芥中克隆到了5个GA生物合成的关键酶基因GA1、GA2、GA3、GA4、GA5。克隆得到的与GA信号传导相关基因有拟南芥的GAI、RGA，玉米的d8，小麦的Rht，大麦的SLN1等等。利用这些基因控制GA或BR的生物合成或信号传导从而获得适合的株高，将是未来农业生产的重要手段。
目前，水稻株高性状基因的克隆都是通过突变体材料进行的，自然界存在许多矮秆的自发突变植株，同时科研人员也通过各种诱变方法得到了很多的矮化突变材料。T-DNA标签法是一种较常见的反向遗传学研究功能基因的方法。近年来，T-DNA标签法分离和克隆基因的技术取得了极大的进展(Krysan et al.，1999；Joen etal.，2000)。由于T-DNA随机插入，平均每个转化株系只含有1.4个拷贝，在转化后代中能够稳定遗传，而且T-DNA本身不仅可以干扰基因的表达，其插入片段还可以成为克隆该基因的分子标记，因此由农杆菌介导的T-DNA标签法在拟南芥和水稻基因组学的研究中得到了许多成功的应用(Filleur，et al.，2001；Maria，etal.，2001；Shihshieh，et al.，2001)。在水稻功能基因组学的研究中，国内外已经有一些实验室利用T-DNA标签法构建了水稻突变体库，并从突变体株系的T2代中得到了矮秆、叶色变异、假病斑、叶形变异、开花时间提前或推迟等各种突变表型(Jeon，et al.，2000；Jeong，et al.，2002；Jung，et al.，2003；Chen，et al.，2003)。An(2003)分析了3793个转化植株中的T-DNA在水稻基因组中的插入位点，其中有1637个位点落在NCBI注释的基因序列中。
在水稻的大量矮秆基因中，Dwarf1和d-61先后被克隆和研究(Ashikari，etal.，1999；Yamamura，et al.，2000)，Dwarf1是与赤霉素信号传导有关的GTP结合蛋白的d亚基的编码基因，d-61基因编码的BR受体激酶是油菜素内脂信号传导的相关基因，这些基因的突变导致株高生长受抑制。Zhi等在2003年克隆了水稻D2基因，通过对该基因的研究发现，D2基因编码细胞色素P450家族中一个新成员，属于与BR合成酶高度相似的CYP90D家族，而水稻矮秆基因则缺失了这种编码功能，使得BR合成受阻，引起水稻植株的矮化。
Monna等(2002)利用图位克隆的方法分离得到绿色革命相关基因sd-1，sd-1位点与在拟南芥中分离出来的GA20氧化酶突变基因(Ds20ox2)连锁，在sd-1控制的半矮秆水稻品种中GA20氧化酶活性减弱从而导致植株矮化。Sasaki等在2003年克隆了一个水稻GA信号传导途径的基因gid2，其编码的产物是F-box蛋白，是一种GA的受体。Miyako等2005年克隆了水稻GID1基因，编码产物是可溶性的GA受体蛋白。Itoh等(2004)利用同源克隆法克隆了5个KO-like基因(OsKOL1-5)，这些基因编码的蛋白与已克隆的拟南芥和西葫芦的KOs高度同源，序列分析和互补试验证实，其中OsKOL2基因与D35对应，编码产物是GA合成途径的贝壳杉烯氧化酶。
发明内容
本发明提供了一种水稻丙酮酸激酶及其编码基因与应用。
本发明提供的水稻丙酮酸激酶，是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丙酮酸激酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
序列表中的序列1由527个氨基酸残基组成，是丙酮酸激酶，命名为OsPK1。自序列1的氨基末端第30-379位氨基酸残基是PK结构域，第394-524位氨基酸残基是PK_C结构域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列1的上述PK结构域和PK_C结构域外进行取代和/或缺失和/或添加。
为了使(a)中的OsPK1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列 上述(b)中的OsPK1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsPK1的编码基因可通过将序列表中序列2自5′端第1至1584位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述丙酮酸激酶的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述丙酮酸激酶的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子 1)其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子； 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 3)与序列表中序列2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列表中的序列2由1584个脱氧核糖核苷酸组成。
含有OsPK1基因的表达盒或重组表达载体也属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有OsPK1基因的重组表达载体。
使用OsPK1构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因菌株进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可在菌株中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等。
所述重组表达载体具体可为pET-23b-OsPK1；所述pET-23b-OsPK1是将所述基因插入pET-23b的多克隆位点得到的；所述pET-23b-OsPK1具体可将所述基因插入所述pET-23b的XhoI和BamHI位点间。
含有OsPK1基因的转基因细胞系和重组菌都属于本发明的保护范围。
所述重组菌具体可为DH10B/pET-23b-OsPK1；所述DH10B/pET-23b-OsPK1是将pET-23b-OsPK1导入DH10B得到的。
本发明还提供了一种表达所述OsPK1蛋白的方法，是通过培养所述重组菌，得到所述OsPK1蛋白。
所述OsPK1蛋白或所述OsPK1基因可应用于培育矮杆水稻。
本发明还提供了一种培育矮杆水稻的方法，是通过沉默水稻中的OsPK1基因来培育矮杆水稻。
本发明创建了T-DNA插入产生的水稻突变体库，通过筛选突变体库，发现了植株半矮化、鞘包穗的突变体A846。遗传分析表明突变体A846的表型是由于T-DNA插入在某个基因的5′端不翻译区(un-translated region，UTR)减弱其功能引起的。该基因的编码区为1584bp，编码一个含527个氨基酸的蛋白质，与拟南芥的丙酮酸激酶家族基因具有很高的同源性，含有典型的PK-PK_C结构域，将其命名为OsPK1。通过对突变体A846进行解剖观察发现，株高矮化主要是由于水稻的穗下第一节明显变短。应用显微镜和扫描电镜观察发现，第一节的细胞数量没有明显变化，但细胞的长度明显变短。由于GA能促进细胞的伸长，突变体细胞变短可能与GA有关。通过施加GA3能使苗期突变体株高恢复，证明A846突变体是GA敏感型突变，而敏感型的株高突变都与GA或BRs合成途径的一些酶有关。
为进一步验证OsPK1基因的功能，本发明通过在体外表达丙酮酸激酶OsPK1蛋白，用Velemine Tanaka方法检测表达的OsPK1蛋白的激酶活性，证明了OsPK1基因是水稻基因组上的功能基因。OsPK1基因编码丙酮酸激酶，是水稻中第一个被鉴定功能的丙酮酸激酶家族基因。该基因在水稻茎的GA合成过程中起重要作用，影响GA合成的最初前体丙酮酸盐的形成，突变后能使水稻茎第一节的伸长明显变短，进而影响植株的高度。该基因功能的阐明，能够促进水稻茎生长发育的理论研究，加快水稻或其它单子叶作物的株高选育种进程，因而具有重要的理论与实践意义。
本发明提供的水稻突变体A846是一个株高半矮化、鞘包穗的水稻突变体。突变体A846的创建及OsPK1基因功能的鉴定、研究结果不仅能完善植物重要的内源激素GA的合成途径，揭示丙酮酸激酶基因影响水稻株高的分子机制，而且为水稻大田育种提供新的矮化品质资源、为水稻基因工程育种提供功能基因资源，在水稻常规育种和基因工程育种上有广泛的应用价值。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为突变体A846和日本晴的表型 图2为Southern blot检测图 图3为T-DNA插入位点示意图 图4为突变体的共分离鉴定图 图5为突变体株高解剖特征图 图6为突变体穗下第一节的居间分生组织显微镜解剖观察图 图7为突变体穗下第一节节间成熟区的扫描电镜照片 图8为GA3处理突变体的幼苗长势 图9为OsPK1蛋白电泳图 图10为用Velemine Tanaka方法测检测表达的丙酮酸激酶活性
具体实施例方式 以下实施例中的培养基组成如下 LB培养基10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl、15g/L琼脂粉(固体培养基需加)；PH7.0。
NB0培养基大量元素(28.3g/L KNO3，4g/L KH2PO4，4.63g/L(NH4)2SO4，1.85g/LMgSO4，1.66g/L CaCl2)，微量元素(0.7578g/L MnSO4，0.2g/L ZnSO4，0.3g/LH3BO3，0.0025g/L Na2MoO4，0.0025g/L CuSO4，0.0025g/L CoCl2)和有机成分(1g/L盐酸塞胺/硫胺素，0.1g/L盐酸吡多辛/醛/醇，0.1g/L烟酸，10g/L肌醇)，300mg/L酪蛋白水解物，500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3g/L植物凝胶(Phytagel)；PH5.8。
ABC培养基 A液20×磷酸缓冲液(60g/L K2HPO4、20g/L NaH2PO4)； B液20×盐溶液(20g/L NH4Cl、6g/L MgSO4·7H2O、3g/L KCl、0.2g/L CaCl2、0.05g/L FeSO4·7H2O；pH7.0)； C液5g蔗糖/900ml水； 临用前，按5∶5∶90比例混合。
AAM培养基大量元素(29.4g/L KCl，1.7g/L KH2PO4，3.7g/L MgSO4，4.4g/LCaCl2)，微量元素(1.69g/L MnSO4，0.86g/L ZnSO4，0.62g/L H3BO3，0.0025g/LNa2MoO4，，0.0025g/L CuSO4，0.0025g/L CoCl2)和有机成分(1g/L盐酸塞胺/硫胺素，0.1g/L盐酸吡多辛/醛/醇，0.1g/L烟酸，10g/L肌醇)，MS基本培养基的维生素，0.5g/L酪蛋白水解物，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，100μM乙酰丁香酮；PH5.2。
2N6-AS培养基大量元素(28.3g/L KNO3，4g/L KH2PO4，4.63g/L(NH4)2SO4，1.85g/L MgSO4，1.66g/L CaCl2)，微量元素(0.7578g/L MnSO4，0.2g/L ZnSO4，0.3g/L H3BO3，0.0025g/L Na2MoO4，CuSO4，0.0025g/L CoCl2)和N6培养基的维生素，2mg/L 2，4-二氯本氧乙酸(2，4-D)，1g/L酪蛋白水解物，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，2.0g/L Phytagel，100μM乙酰丁香酮；PH5.2。
1/2MS培养基1/2MS无机盐和维生素，30g/L蔗糖，3.0g/L Phytagel；PH5.8。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、日本晴T-DNA插入突变体A846的获得 水稻突变体A846是通过根癌农杆菌介导转化的方法获得的，具体步骤如下 1、水稻愈伤组织的诱导 取成熟的日本晴水稻种子脱壳，用70％乙醇处理1-2min，0.1％氯化汞处理15-20min，灭菌的去离子水冲洗4-6次。无菌滤纸吸干表面水分后，接种到含2mg/L 2，4二氯本氧乙酸(2，4-D)(Fluka公司)的NB0培养基上，parafilm膜封口，在25℃培养箱内暗培养，诱导胚性愈伤组织。7-10天后，剥离由盾片诱导出来的愈伤组织，继代培养于相同的培养基上。25℃培养箱内暗培养约20天后，得到可用于转化的旺盛生长的胚性愈伤组织。
2、农杆菌的培养与前处理 将pCAMBIA 1301(CAMBIA公司)导入根癌农杆菌EHA105得到重组菌EHA105/pCAMBIA 1301。
将EHA105/pCAMBIA 1301在含有50mg/L卡那霉素(Amresco公司)和10mg/L利福平(Sigma公司)的LB固体培养基上划线，28℃暗培养2天。挑取单菌落到含相同抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇动培养约12小时至菌液浓度达到OD595≈0.5。再以1％接种量转接于含相同抗生素的ABC培养基中，28℃，200rpm摇动培养约14小时至菌液浓度达到OD595≈0.8-1.0。将菌液倒入灭菌的50mL离心管中，eppendorf 5810R离心机室温下3800rpm离心30min，收集菌体，倒掉上清，用等体积的AAM培养基重悬菌体一次，再次离心后，用AAM培养基重悬菌体至OD595≈0.3，备转化用。
3、水稻胚性愈伤组织和农杆菌的共培养 挑取步骤1制备得到的淡黄色旺盛生长的水稻愈伤组织至无菌培养皿中，把步骤2制备得到的农杆菌菌液倒入培养皿，轻轻搅动混匀使水稻愈伤组织充分浸泡在菌液中。15-20min后，倒掉菌液，将愈伤组织接种于2N6-AS培养基上，25℃培养箱内暗培养2-3天。期间检查农杆菌的生长状况，以农杆菌长满水稻愈伤组织表面为宜。
4、水稻转化体的筛选和植株的再生 将共培养后的愈伤组织转移至灭菌的三角瓶中，用灭菌的去离子水清洗约15次，至液体澄清为止，再加入含500mg/L头孢霉素(Sigma公司)和200mg/L氨苄青霉素(华北制药股份有限公司)的灭菌去离子水，25℃条件下120rpm摇动清洗2hr。倒掉去离子水，并将愈伤组织转移至无菌滤纸上，晾干后的愈伤组织接种于含2mg/L 2，4-D、250mg/L头孢霉素、200mg/L氨苄青霉素和50mg/L潮霉素B(Roche公司)的NB0培养基上，parafilm膜封口，25℃培养箱内暗培养20-30天。期间时常观察愈伤状态和生长情况，避免杂菌污染。挑取潮霉素B抗性愈伤组织继代培养于相同培养基，25℃培养箱内再暗培养约15天。
将旺盛生长的潮霉素B抗性愈伤组织接种于含1.0mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)(Sigma公司)，2.0mg/L a-萘乙酸(NAA)(北京化学试剂公司)，5.0mg/L脱落酸(ABA)(Sigma公司)和50mg/L潮霉素B的NB0培养基上进行预分化，25℃培养箱内暗培养约15天后，再挑取白色致密的抗性愈伤组织接种于含2.0mg/L 6-BA，1.0mg/L 3-吲哚乙酸(IAA)(北京化学试剂公司)，1.0mg/L NAA，1.0mg/L 6-糠氨基嘌呤(KT)(Sigma公司)和50mg/L潮霉素B的NB0培养基上进行分化，25℃培养箱内光照培养(2000lux，光照16hr/黑暗8hr)约20天。将分化出芽的愈伤组织接种于含0.5mg/L NAA的1/2MS固体培养基上，25℃光照培养(4000lux，光照16hr/黑暗8hr)约30天后，将健壮植株移至网室栽培。
共获得了132个株系的突变株。
5、转基因植株的表型观察 待转基因植株结实后，播种T1代种子。在生长过程中，观察记录各转基因系的植株各器官形态、数量等的变化。
观察发现，突变株A846植株矮化，株高只有野生型的1/2，见图1。图1中，左边为日本晴(野生型)，右边为突变株A846。A846的T1代分离群中，野生表型与矮化表型的比例为25∶8，经x2检验，P＞0.5，表明分离比例符合3∶1，由此推测突变株A846的矮杆表型可能是由于T-DNA插入导致单基因突变引起的。
实施例2、突变株A846的遗传学分析 转基因水稻植株的突变表型并不都是由于T-DNA插入引起的(An et al.，2005)，所以必须通过遗传学分析确认突变体表型与T-DNA插入的相关性。
一、水稻基因组DNA的提取与定量 按Dellaporta等的方法(Malmberg et al.，1985)分别提取A846的T2代矮杆植株和日本晴的基因组DNA，具体步骤如下 (1)取3-5g新鲜水稻叶片，液氮速冻，在研钵中快速研磨成粉末状，转入50ml离心管中； (2)立即加入20ml预热至65℃的提取缓冲液(1M Tris-HCl(pH8.0)100ml/L，0.5M EDTA(pH8.0)100ml/L，5M NaCl 100ml/L，10％SDS 125ml/L，β-巯基乙醇1.5ml/L)中，65℃水浴30min； (3)加入7.5ml 5M醋酸钾，轻轻颠倒混匀，冰上放置20min，eppendorf 5810R离心机4000rpm离心20min，将上清转移到另一干净的50ml离心管中； (4)加入15ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒混匀，4000rpm离心20min，将上清转移到另一干净的50ml离心管中； (5)加入15ml冰预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min； (6)4000rpm离心20min，弃上清，用20ml 70％乙醇洗一次，倒置离心管于干净的滤纸上，室温晾干后，将沉淀重悬于700μl ddH2O中； (7)转入干净的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心15min，将上清转入一干净的2ml离心管中，加入70μl3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积冰预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min； (8)12000rpm离心15min，弃上清，1ml 70％乙醇洗一遍，12000rpm离心10min，弃上清，室温晾干沉淀后，溶于100μl ddH2O中；加入2μl RNase(10mg/ml)。
(9)DNA的定量用紫外测定法或凝胶电泳法确定。
二、Southern blotting分析 1、探针的制备 植物表达载体pCAMBIA 1301的T-DNA上有一个潮霉素B抗性基因。根据该基因序列设计一对探针引物Hyg-1和Hyg-2。以pCAMBIA 1301的质粒DNA为模板进行PCR扩增，得到一个长度为858bp的片段，即为制备的探针。
引物Hyg-1和Hyg-2的序列如下 Hyg-15′-TGCGCCCAAGCTGCATCAT-3′， Hyg-25′-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3′。
pCAMBIA 1301的质粒DNA的提取方法见《分子克隆实验指南》(Sambrook andRussell，2001)。
PCR扩增的反应条件94℃4min；94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃8min。
PCR扩增的反应体系1×PCR反应缓冲液，1U Taq DNA聚合酶(Takara公司)，20ng pCAMBIA 1301质粒DNA，0.2mM dNTP，0.2μM Hyg-1，0.2μM Hyg-2，ddH2O补充至20μl。
2、Southern blotting分析 取日本晴植株的基因组DNA和A846的T2代矮杆植株的基因组DNA各10μg，加1μl HindIII(Takara公司)和2.5μl 10×M缓冲液，ddH2O补充至25μl，37℃酶切过夜，在1％琼脂糖凝胶上以2V/cm电压电泳分离酶切后的DNA，时间约6hr。
DNA胶的转膜、探针标记及杂交反应均参照《分子克隆实验指南》(Sambrook andRussell，2001)进行，具体步骤如下 DNA胶在0.25M HCl中变性约15min，至溴酚蓝指示剂变成黄色，再在0.4M NaOH中变性约20min，至溴酚蓝指示剂再变为蓝色；用0.4M NaOH上行毛细管法将DNA转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham公司)上。α-32P-dCTP(北京福瑞生物工程公司)和Prime-a-Gene Labeling System标记试剂盒(Promega公司)标记探针后进行Southern杂交。
从Southern杂交结果见图2。图2中，PpCAMBIA 1301质粒；NB日本晴；A846突变株。由图可见，突变株有一条杂交带，对照日本晴无杂交带。这一结果表明，突变体A846基因组中的T-DNA为单拷贝插入。
实施例3、T-DNA插入位点分析 通过热不均一交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)方法(Liu et al.，1995)确定T-DNA的插入位点。
TAIL-PCR反应中的三个特异引物分别为 SP15′-GGTGACCAGCTCGAATTTCCC-3′， SP25′-TGAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′， SP35′-GCGCGCGGTGTCATCTATGT-3′。
随机引物为 AD45′-TG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(G/C)AGA-3′。
以A846的T2代纯合矮杆植株基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增程序参照文献(Liu et al.，1995)。第三步扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(申能博彩生物科技有限公司)回收特异扩增条带，连接到pGEM-T easy载体(Promega公司)后进行测序(三博远志生物有限责任公司)。
将TAIL-PCR扩增产物的序列在Genbank数据库(http://www.gramene.org/)中进行blastn分析，发现T-DNA插入在水稻基因组的第11号染色体上。用PCR方法克隆到T-DNA插入在水稻基因组位点上的另一侧序列，通过比对发现由于T-DNA插入的插入，引起水稻基因组上29个碱基的缺失。T-DNA插入在LOC_Os11g05110基因的启动子区域，T-DNA插入位点示意图见图3。
实施例4、突变性状与T-DNA的插入共分离的验证 TAIL-PCR扩增产物序列包括部分T-DNA及其插入位点侧翼的水稻基因组DNA，因此，以T-DNA序列和其插入位点侧翼的水稻基因组序列各设计一条引物组成引物组合，对突变体群体进行共分离验证具有更明显的优势。
一对引物的序列如下 T-DNA上的引物序列5’-TCCGAGGGCAAAGAAATA-3’； 水稻基因组上序列5’-GCCGGCCTTGAGGCAGGAGGAG-3’。
分别提取日本晴和A846的T2代纯合矮杆植株的基因组DNA，用上述引物进行PCR扩增。PCR检测结果如图4所示，图4中，MDL2000Marker；1-10A846的T2代纯合矮杆植株；C日本晴(NB)。由图可见，矮杆植株都有一条扩增带，而对照日本晴则没有扩增条带，证明矮杆性状与T-DNA的插入是共分离的。
实施例5、突变基因的功能分析 一、突变基因功能的生物信息学预测 LOC_Os11g05110的最长编码区编码一个含527个氨基酸的蛋白质。将其序列在http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam网站上进行功能结构域分析，发现其具有典型的PK-PK_C结构域，可能编码丙酮酸激酶。目前，在拟南芥中已鉴定的丙酮酸激酶家族基因成员有12个。氨基酸序列比对分析结果表明，突变株A846中由于T-DNA插入阻断功能的基因编码的蛋白质与拟南芥的一个丙酮酸激酶基因序列同源性(identity)高达(88％)。因此，将该阻断基因命名为OsPK1。
在粳稻的cDNA数据库(http://www.gramene.org/)中搜索，找到1个与OsPK1基因在氨基酸水平上同源性高达96％的序列(编号Os12g0145700)，暂将其命名为OsPK2。尽管两者间有如此高的同源性，单独OsPK1基因的功能缺失即可导致表型发生明显变化，说明OsPK2基因功能与OsPK1不同，彼此间不能形成功能互补。
二、OsPK1在水稻茎的生长发育中的作用 1、解剖观察 分别解剖日本晴和A846的T2代纯合矮杆植株，观察比较它们的解剖特征，解剖特征见图5。通过解剖发现，矮杆植株的株高只有日本晴的1/2，矮化主要发生在穗下第一节，穗和叶鞘的长度变化不明显，所以突变株A846株高矮化的原因主要是穗下第一节间明显变短， 2、电镜观察 为了验证节间变短的原因是细胞数目减少还是细胞长度减少导致，应用Quanta200扫描电子显微镜(FEI公司)观察比较A846的T2代纯合矮杆植株与日本晴的第一节间的成熟区的细胞。图6为突变体穗下第一节的居间分生组织显微镜解剖观察图。图6中，NB日本晴；A846突变株。由图可见，细胞的数目变化不明显。
电镜观察样品采用干燥法制备(Jenks et al.，1992)。A846的T2代纯合矮杆植株与日本晴在抽穗2周后，采集第一节的茎杆，室温下空气中干燥48-72hr。从各材料的中上部位取适当大小茎杆中分切开，两截面向上用导电胶粘至载样台上，喷金(30sec/次，5次)后，即可在扫描电镜下进行观察。电镜结果见图7。图7中，NB日本晴；A846突变株；上面的2张图是放大200倍的照片，下面的2张图是放大500倍的照片。
电镜观察显示，突变株的第一节的细胞长度明显变短，与日本晴相比较，在突变株中，细胞的长度只有日本晴中细胞长度的一半左右。由此推断OsPK1基因在水稻节间的伸长过程中起重要的作用，由于T-DNA插入减弱OsPK1基因的表达，使细胞的长度变短，因而产生植株矮化等表型。
实施例6、施加外源赤霉素(GA)对突变体幼苗生长的影响 为验证OsPK1突变体是GA敏感型还是钝感型突变，分别在1/2MS培养基中加入不同量的外源GA3，各培养基中GA3的终浓度分别为10-1、10-2、10-3、10-4ppm。分别用以上培养基培养日本晴植株和A846的T2代纯合矮杆植株，20天后，测量植株的高度。
结果见图8，由图可见，在低浓度(10-4ppm)条件下，突变株幼苗的株高能恢复到接近野生型的高度，表明OsPK1突变是GA敏感型的突变。敏感型的突变一般都是由GA的合成代谢途径的酶的功能受影响造成的，说明OsPK1突变影响GA合成的最初前体丙酮酸盐合成的重要酶-丙酮酸激酶的功能。
实施例7、体外表达突变基因蛋白OsPK1并检测其丙酮酸激酶活性 一、OsPK1编码基因的获得 根据序列分析的结果设计一对引物如下 OsPK1-F5’-GGGATCCATGCATTCGACGAATCTGCTG-3； OsPK1-R5’-CCTGCAGCTAATCGTCCAGCTCAATGATC-3’。
以日本晴水稻的全长cDNA为模板，用以上引物进行PCR扩增。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，采用得到了分子量约为1584bp的条带，与预期结果相符。将该PCR产物4℃保存，送上海Invitrogen Corporation测序，测序结果表明，扩增到的核苷酸序列见序列表的序列2，编码氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质OsPK1。
用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pMD-18T(大连TaKaRa；货号D103A)连接，构建克隆载体。将含有序列表中序列2的自5′末端第1-1584位脱氧核糖核苷酸的OsPK1基因的pMD-18T载体命名为pMD-18T-OsPK1。
二、OsPK1蛋白的表达和纯化 1、OsPK1蛋白的表达 用XhoI酶和BamHI酶酶切pMD-18T-OsPK1，得到OsPK1基因，将得到的OsPK1基因连入表达载体pET-23b(+)的多克隆位点XhoI和BamHI位点之间，使其与末端6个组氨酸处于同一个阅读框里，得到重组表达载体pET-23b-OsPK1。将重组表达载体pET-23b-OsPK1导入DH10B细胞中，培养12小时，用IPTG诱导一定时间后，分别取上清和沉淀进行电泳检测，电泳结果见图9A。图9A中，Mmarker；1未诱导上清；2未诱导沉淀；3诱导1h上清；4诱导1h沉淀；5诱导2h上清；6诱导2h沉淀。
由图可见，OsPK1基因蛋白几乎全部以包涵体形式表达出来，大部分都是非活性形式。
2、OsPK1蛋白的纯化 将得到的包涵体OsPK1蛋白用透析复性方法进行蛋白复性，具体步骤如下 (1)透析袋使用前的处理。
a)剪4段透析袋，在透析袋漂洗液中煮沸30min，其间要将透析袋完全打开，以充分煮透； b)用蒸馏水将透析袋彻底漂洗； c)将透析袋浸泡于水中，煮沸15min，冷却后置于4℃冰箱过夜； d)用4号手术缝线将透析袋一端结扎封闭，煮沸后室温保存。
(2)调整离子交换层析洗脱蛋白的浓度为0.1mg/ml，将稀释后的变性蛋白溶液分别装入预先处理好的透析袋(截留分子量为1.4×103)。
(3)将透析袋放入一只装有400ml透析液I的烧杯中，4℃条件下搅拌透析4h；更换新的透析液I(2M尿紊，20mM Tris，0.1mM GSSG，0.9mM GSH)，重复此步骤两次。
(4)将透析袋放入装有400ml透析液II的烧杯中，4℃条件下搅拌透析4h；更换新的透析液II(0.5M尿素，20mM Tris，0.1mM GSSG，0.9mM GSH)，重复此步骤两次。
(5)将透析袋放入装有400ml 0.01M磷酸盐缓冲液的烧杯中，4℃条件下搅拌透析4h。
(6)将透析袋放入装有400ml灭菌去离子水的烧杯中，4℃条件下搅伴透析4h。
(7)将透析袋中溶液合并，放入冷冻干燥仪进行冷冻干燥，-70℃保存。
将复性后的蛋白用Ni离子柱纯化，纯化后的蛋白进行电泳检测，见图9B。图9B中，Mmarker；1纯化后的OsPK1蛋白。
得到活性状态的OsPK1蛋白。
三、OsPK1蛋白的丙酮酸激酶活性 参照Velentine Tanaka方法检测表达的OsPK1蛋白的丙酮酸激酶活性，丙酮酸激酶能催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEPI)转变为丙酮酸，丙酮酸在乳酸脱氢酶存在时还原为乳酸并使还原型辅酶I(NADH)转变为氧化型辅酶I(NAD+)。NADH在340nm波长处有特异吸收峰。观察此波长的光密度变化，即可测定丙酮酸激酶活性。
用购买的Sigma公司的丙酮酸激酶作为标样，检测步骤二得到的纯化的OsPK1蛋白的丙酮酸激酶活性。结果见图10，图10中，CK1ddH2O(空白对照)；CK2丙酮酸激酶+乳酸脱氢酶+NADH；CK3磷酸烯醇式丙酮酸+乳酸脱氢酶+NADH；CK4丙酮酸激酶+磷酸烯醇式丙酮酸+乳酸脱氢酶；标样丙酮酸激酶+磷酸烯醇式丙酮酸+乳酸脱氢酶+NADH(阳性对照)；纯化蛋白OsPK1蛋白+磷酸烯醇式丙酮酸+乳酸脱氢酶+NADH。
由图可见，OsPK1蛋白酶活性为标样丙酮酸激酶活性的1/2。
序列表
<110>清华大学深圳研究生院
<120>一种水稻丙酮酸激酶及其编码基因与应用
<130>CGGNARY81381
<160>2
<210>1
<211>527
<212>PRT
<213>日本晴水稻(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)
<400>1
Met His Ser Thr Asn Leu Leu Leu Glu Glu Pro Ile Arg Met Ala Ser
1 5 10 15
Ile Leu Glu Pro Ser Lys Pro Ser Phe Phe Pro Ala Met Thr Lys Ile
20 25 30
Val Gly Thr Leu Gly Pro Lys Ser Arg Ala Val Asp Thr Ile Ser Ser
35 40 45
Cys Leu Lys Ala Gly Met Ser Val Ala Arg Phe Asp Phe Ser Trp Gly
50 55 60
Asp Ala Glu Tyr His Gln Glu Thr Leu Glu Asn Leu Lys Leu Ala Ile
65 70 75 80
Lys Ser Thr Lys Lys Leu Cys Ala Val Met Leu Asp Thr Val Gly Pro
85 90 95
Glu Leu Gln Val Val Asn Lys Ser Glu Ala Ala Ile Ser Leu Glu Ala
100 105 110
Asn Gly Thr Val Val Leu Thr Pro Asp Gln Gly Gln Glu Ala Ser Ser
115 120 125
Glu Leu Leu Pro Ile Asn Phe Ser Gly Leu Ala Lys Ala Leu Lys Pro
130 135 140
Gly Ala Thr Ile Phe Val Gly Gln Tyr Leu Phe Thr Gly Ser Glu Thr
145 150 155 160
Thr Ser Val Trp Leu Glu Val Ser Glu Val Lys Gly Asp Asp Val Val
165 170 175
Cys Val Ile Lys Asn Ser Ala Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr Leu
180 185 190
His Cys Ser Gln Ile His Ile Asp Leu Pro Thr Leu Ser Asp Glu Asp
195 200 205
Lys Glu Val Ile Arg Arg Trp Gly Ala Pro Asn Lys Ile Asp Phe Leu
210 215 220
Ser Leu Ser Tyr Thr Arg His Ala Glu Asp Val Arg Gln Ala Arg Glu
225 230 235 240
Phe Leu Ser Lys Leu Gly Asp Leu Ser Gln Thr Gln Ile Phe Ala Lys
245 250 255
Ile Glu Asn Val Glu Gly Leu Asn His Phe Asp Glu Ile Leu Gln Glu
260 265 270
Ala Asp Gly Ile Ile Leu Ser Arg Gly Asn Leu Gly Ile Asp Leu Pro
275 280 285
Pro Glu Lys Val Phe Leu Phe Gln Lys Ser Ala Leu His Lys Cys Asn
290 295 300
Met Ala Gly Lys Pro Ala Val Val Thr Arg Val Val Asp Ser Met Thr
305 310 315 320
Asp Asn Leu Arg Pro Thr Arg Ala Glu Ala Thr Asp Val Ala Asn Ala
325 330 335
Val Leu Asp Gly Ser Asp Ala Ile Leu Leu Gly Ala Glu Thr Leu Arg
340 345 350
Gly Leu Tyr Pro Val Glu Thr Ile Ser Ile Val Gly Lys Ile Cys Ala
355 360 365
Glu Ala Glu Lys Val Phe Asn Gln Asp Leu Tyr Phe Lys Arg Thr Val
370 375 380
Lys Tyr Val Gly Glu Pro Met Thr His Leu Glu Ser Ile Ala Ser Ser
385 390 395 400
Ala Val Arg Ala Ala Ile Lys Val Lys Ala Ser Val Ile Ile Cys Phe
405 410 415
Thr Ser Ser Gly Arg Ala Ala Arg Leu Ile Ala Lys Tyr Arg Pro Thr
420 425 430
Met Pro Val Leu Ser Val Val Ile Pro Arg Leu Lys Thr Asn Gln Leu
435 440 445
Arg Trp Ser Phe Thr Gly Ala Phe Glu Ala Arg Gln Ser Leu Ile Val
450 455 460
Arg Gly Leu Phe Pro Met Leu Ala Asp Pro Arg His Pro Ala Glu Ser
465 470 475 480
Thr Ser Ala Thr Asn Glu Ser Val Leu Lys Val Ala Leu Asp His Gly
485 490 495
Lys Ala Ser Gly Val Ile Lys Ser His Asp Arg Val Val Val Cys Gln
500 505 510
Lys Val Gly Asp Ser Ser Val Val Lys Ile Ile Glu Leu Asp Asp
515 520 525
<210>2
<211>1584
<212>DNA
<213>日本晴水稻(Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare)
<400>2
atgcattcga cgaatctgct gctggaggag cccatcagga tggcatccat cctggagcca60
tccaagccga gctttttccc ggcgatgacc aagatcgtgg ggacgctggg tcccaagtcg 120
cgcgccgtcg acaccatctc ctcctgcctc aaggccggca tgtcggttgc caggttcgat 180
ttctcgtggg gagacgctga gtaccaccag gaaaccctcg aaaacctcaa gctcgccatc 240
aagtccacca agaagctctg tgctgtcatg ctcgacactg tcggcccgga gttgcaggtg 300
gtgaacaaga gtgaggctgc aatctccctt gaagcgaatg gcactgttgt tctcacccct 360
gaccaggggc aggaggcctc ctccgaattg ctgcccatca acttctccgg gcttgctaag 420
gctctgaaac caggtgctac aatttttgtg gggcaatact tgttcactgg cagtgagact 480
acttcagttt ggttagaggt ttctgaagtt aaaggagatg atgtggtttg tgtgataaaa 540
aattcggcta ctctggctgg ttcactgttc accctgcatt gttctcagat tcatatcgac 600
ttacctacac tgtctgatga ggacaaggag gttatcagaa gatggggagc tccaaacaag 660
attgacttcc tctctctgtc ttatacaaga cacgcggaag atgtgcgaca ggcacgtgag 720
ttcctctcaa agttaggcga ccttagccaa actcagattt ttgccaaaat tgagaatgtt 780
gagggtttga atcattttga tgaaatcctg caagaggcgg atggtatcat tctgtcaaga 840
ggaaaccttg gaattgatct tccacctgaa aaggtgtttt tgtttcaaaa gtctgctctg 900
cacaagtgca acatggctgg aaagcctgct gttgttactc gtgttgtgga cagtatgact 960
gacaacctca ggcctactcg tgcggaggct actgatgtgg caaatgctgt acttgacggg1020
agtgatgcca ttctccttgg tgctgagact ctccgtggtc tgtacccagt tgagactatc1080
tcaattgtgg gcaaaatttg cgctgaggca gagaaggtat tcaaccaaga tttatacttc1140
aagcggactg tgaaatatgt tggggagccc atgacccact tggagtctat cgcttcttct1200
gcggtgcgag ctgctatcaa agtgaaggct tctgtcatta tttgcttcac atcatctgga1260
cgcgctgcaa gactaattgc caagtacagg cccaccatgc ctgttctatc tgttgtcatt1320
cctcgtctga aaacaaacca actgaggtgg agtttcactg gcgcatttga agcaagacaa1380
tcactcatag ttagaggtct ctttccgatg cttgctgatc ctcgccatcc agctgaatcg1440
accagcgcta ccaatgagtc agttttgaag gttgctcttg accatggcaa agcttccggt1500
gtgatcaagt cgcatgatcg cgttgttgtc tgccagaaag tgggtgattc ctcggttgtg1560
aagatcattg agctggacga ttag 158权利要求
1、一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丙酮酸激酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
2、权利要求1所述蛋白的编码基因。
3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子
1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
4、含有权利要求2或3所述基因的表达盒或重组表达载体。
5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为pET-23b-0sPK1；所述pET-23b-0sPK1是将权利要求2或3所述基因插入pET-23b的多克隆位点得到的重组载体。
6、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。
7、如权利要求6所述的重组菌，其特征在于所述重组菌为DH10B/pET-23b-0sPK1；所述DH10B/pET-23b-0sPK1是将所述pET-23b-0sPK1导入DH10B得到的。
8、一种表达权利要求1所述的蛋白的方法，是培养权利要求6或7所述的重组菌，得到权利要求1所述的蛋白。
9、权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因在培育矮杆水稻中的应用。
10、一种培育矮杆水稻的方法，是通过沉默水稻中的权利要求2或3所述基因来培育矮杆水稻。
全文摘要
本发明公开了一种水稻丙酮酸激酶及其编码基因与应用。本发明公开的水稻丙酮酸激酶，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有丙酮酸激酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明还公开了所述蛋白的编码基因和含有该基因的重组表达载体和重组菌。通过沉默本发明公开的蛋白，可以培育矮杆水稻。本发明能够促进水稻茎生长发育的理论研究，有助于加快水稻或其它单子叶作物的株高选育种进程，因而具有重要的理论与实践意义。
文档编号C12N9/12GK101603036SQ20081011482
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者何朝族, 肖文开 申请人:清华大学深圳研究生院