一种提高m2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种提高M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制备方法，具体的说，针对PKM2蛋白的特性，在蛋白表达时设计两种不同形式的片段：A片段用于免疫，通过标签GST连接PKM2特异序列多肽抗原，不但可提高蛋白的表达量，而且易于纯化，明显提高免疫效果；B片段群用于筛选，包括PKM2的9个独特的氨基酸序列，减少非特异性抗体，提高筛选效率，可以用于筛选不同表位的抗体。通过这些不同特点的抗原，一方面提高蛋白的表达纯化及免疫效果，另一方面用于筛选特异的高亲和力抗体，提高单克隆抗体的制备效率。
【专利说明】一种提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备方法
[0001]【技术领域】本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及一种提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备及抗体筛选的方法。
[0002]【背景技术】近年来肿瘤生物学技术的进展，发现许多新型的肿瘤诊断生物标志物。M2型丙酮酸脱氢酶激酶(PKM2)是目前肿瘤研究领域最为热门的一个肿瘤生物标志物，它作为肿瘤细胞糖酵解代谢通路的关键酶，与肿瘤发生发展密切相关。它在正常组织中仅表达于肌肉和快速增生组织，在肿瘤组织显著高表达，是许多肿瘤细胞共性的特征。丙酮酸激酶有四种亚型:PKM1、PKM2、PKL及PKR。PKMl主要表达于分化成熟的组织如肌肉和神经组织，PKM2主要表达于快速增生的细胞，如胚胎干细胞、正常快速增生细胞及肿瘤细胞等，PKL主要表达于肝脏、肾脏及结肠，PKR表达于红细胞中。
[0003]结肠癌中PKM2的高表达，常随着肿瘤细胞的脱落，可在粪便中被检测到，因此可作为结肠癌的诊断生物标志物。以往对结肠癌的筛查和诊断，常通过粪便中的隐血试验，然而隐血试验由于取样的误差及饮食因素影响等，常导致较高的假阳性率和假阴性率。近几年的临床研究发现，粪便中的PKM2检测可显著提高结肠癌的诊断准确率，灵敏度达80 %，特异性达92%，因此将成为今后结肠癌的筛查和诊断的重要生物标志物。血液中PKM2的表达增加，提示有肿瘤的发生，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌等。此外，尿液中的PKM2增加，提示患有肾癌，这是第一个有希望作为肾癌的肿瘤生物标志物。综上所述，PKM2是一个重要的肿瘤生物标志物，粪便中的PKM2检测可帮助诊断结肠癌等胃肠道肿瘤，尿液中PKM2的检测可辅助诊断肾癌，血液中PKM2的检测可辅助诊断乳腺癌及肺癌等。
[0004]目前PKM2的检测试剂盒仅德国的ScheB0.Biotech AG公司有生产相关诊断产品，主要有用于结肠癌筛选的检测试剂盒及血清中PKM2的检测试剂盒，其产品“免疫层析法快速检测试剂盒”能在数分钟内检测粪便中的PKM2含量，现已用于各医院的临床检测。此产品由于价格比较昂贵，若进口到国内在医院中使用，其昂贵的价格普通病人难以承受，因此也不便在人群中推广。`其它如Abcam等科研试剂公司提供的PKM2抗体，仅限于科研使用，价格昂贵，且无亲和力、特异性和灵敏度较高的抗体用于临床检测。因此，我国必须开发具有自主知识产权的PKM2检测试剂盒，降低试剂盒的成本，以便能在国内进行推广和普及，使结肠癌等肿瘤能够早期发现早期治疗，提高肿瘤治疗的有效率，能够服务于人民群众的健康事业。目前，PKM2的检测试剂盒的开发主要有两种方法:一是常用的酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒，二是基于免疫层析法的快速检测试剂盒。其相关产品均可用于临床的检测。因此，本申请的研究也开发两种诊断试剂盒，分别为常规的酶联免疫法检测试剂盒和胶体金免疫层析法的快速检测试剂盒。两种类型的检测试剂盒，从价格和便利性方面满足临床上不同的实际需求。
[0005]由于PKM2仅在氨基酸序列的389-433位与PKMl存在差异(见说明书附图2)，因此需取这部分氨基酸进行作为抗原。而这特异的45个氨基酸序列，由于其片段较小，因此免疫原性较差。本申请的研究策略是将45个氨基酸的抗原序列连接在带有GST标签的pET24a载体上，促进蛋白的正确折叠，提供蛋白的得率及纯化，同时有利于提高抗体的免疫原性，并且可作为初步的抗体筛选所用。在抗体的筛选阶段，合成不同表位的肽段，用于筛选特异性和亲和力高的抗体，用于后续的试剂盒开发。这样的一种针对M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制备方法，即克服了蛋白免疫原性差的弱点，也有利于目的蛋白的获取和后续抗体的筛选，因此鉴于以上的技术背景，提出本发明方法。
[0006]
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种能简便、高效地进行PKM2蛋白在原核系统中的制备工艺。该发明使得PKM2蛋白的免疫原性增强，增加了抗PKM2蛋白抗体的多样性。该发明简单易行，适用于低分子量蛋白的表达、纯化和抗体制备。同时，本发明合成PKM2的多种独特的多肽序列，用于高特异性和高亲和力抗体的筛选，减少非特异性抗体，提高抗体的筛选效率。
[0007]本发明的内容主要由两部分组成:
[0008]1.构建pET24a-GST-PKM2_A的重组蛋白，用于动物的抗原免疫。本申请使用的pET24a载体，已经构建有带有GST的标签。PKM2-A片段的序列为:IYHLQLFEELRRLAPITSDPTEATAVGAVEASFKCCS GAIIVLTK。特异序列见说明书附图1。
[0009]2.合成PKM2的表位筛选多肽组，序列分别为:l)Biotin-1YHLQLFEEL，2)Biotin-RRLAPITSDP,3)Biotin-TE ATAVGAVE,4)Biotin-ASFKCCSG,5)Biotin-AIIVLTK,6)Biotin-LFEELRRLAP,7)Biotin-1TSDPTEATA,8)Biotin-VGAVEASFKC,9)Biotin-CSGAIIVLTK。
[0010]【具体实施方式】运用基因克隆的方法构建原核重组表达质粒，纯化蛋白，制备抗体，同时合成筛选多肽，进行单抗筛选。
[0011]1:pET24a-G ST-PKM2-A重组蛋白的构建及蛋白表达纯化
[0012]1.1原核表达载体pET24a—GST-PKM2-A的构建
[0013]1.1.1PCR扩增:PKM2-A基因的PCR扩增，以人结肠癌细胞株HCT116cDNA为模板，进行PCR扩增。总反应体系为80ul，其中含有模板8ul，IOXPCR buffer (Mg+) 8.0 μ 1，2mM dNTP8.Ομ?，正向引物 4.Ομ? (250uM)，反向引物 4.0 μ I (250uM)，Ex-Taq DNA 聚合酶0.8μ 1，补水至80ul。反应条件:预变性94°C 5min ;变性94°C 50sec，退火56°C 50sec，复性延伸72°C Imin ;变性一复性延伸循环30次；延伸72°C IOmin0 PCR产物经电泳验证后用PCR、酶切产物回收纯化试剂盒回收纯化，测其浓度。
[0014]1.1.2酶切和连接:回收纯化了的PKM2-A基因和质粒pET24a各取约800ng，分别用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切。反应总体系30ul，其中含有模板20ul，BamH Ilul, Xho I I μ I, IOXbuffer 3 μ I,补去离子水 30ul ;于 0.5mlEppendorf 管中，37°C水浴
3小时。酶切后的PKM2-A基因和质粒pET24a，用PCR、酶切产物回收纯化试剂盒回收纯化；纯化后的目的基因片段和载体酶切片段，测定260nm处吸光度值(0D260值)，计算片段和载体浓度，目的片段和载体片段按6: I摩尔比进行连接。连接体系:T4 DNA连接酶?μ?，IOX连接缓冲液1μ l，pET24a lOOng，PKM2-A基因70ng，去离子水补至10 μ I ;16°C连接过夜。
[0015]1.1.3连接产物的转化
[0016]通过钙转法将连接产物转化大肠杆菌TGl感受态细胞:10 μ I连接产物加至80 μ I感受态细胞中，缓缓转动混匀，冰上放置30min，42°C热激90sec，冰上放置3min。转化后的菌体加入Iml无抗生素的LB培养液，轻轻混匀，37°C，250rpm振荡培养Ihr后，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37°C培养过夜。[0017]1.1.4 表达载体 pET24a-GST-PKM2-A 的鉴定
[0018]随机挑取上述平板上的单个菌落至10 μ I蒸馏水中混匀，作为模板用于PCR鉴定。反应体系:模板(菌落混悬液)2μ 1，10XPCR buffer (Mg+) 2 μ I, 2mM dNTP 2μ I,T7promoter primer I μ I, T7terminator primer I μ I, Ex-Taq DNA 聚合酶 0.1 μ I, ddH20补至20 μ I。
[0019]反应条件:预变性94 °C 5min ；变性94 °C 50sec ;退火56 °C 50sec ;复性延伸72°C Imin ;变性一复性延伸循环30次；延伸72°C IOmin。
[0020]挑取经PCR鉴定的阳性单克隆菌落于5ml LB培养基(含氨苄青霉素)中，37°C，250rpm振荡培养过夜；将培养的菌液留出500 μ I保种，其余用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，质粒再用PCR、限制性内切酶BamH I和Xho I酶切验证；经验证的质粒用核酸测序的方法验证插入片段序列的正确性。
[0021]1.1.5pET24a-GST-PKM2-A重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达
[0022]I)转化:通过钙转法将以上抽提的pET24a-GST-PKM2_A重组质粒转化入感受态大肠杆菌BL21:内含8(^181^21钙转感受态细胞的1.5111把--611(10忖管中加入重组质粒14 1，缓缓转动混匀，冰上放置30min，42°C热激90sec，冰上放置3min。转化后的菌体加入ImlLB培养液，370C，250rpm振荡培养Ihr后，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，培养皿倒置于37 °C培养过夜。
[0023]2)诱导:随机挑取PKM2-A阳性克隆接种于3ml含60 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，250rpm摇至0D600约为0.6 ;取出Iml未加诱导剂的菌液，4°C暂存作为诱导前对照，余下2ml菌液加入0.8M异丙基硫代半乳糖(IPTG) 2 μ I至终浓度0.8mM, 30°C，250rpm,诱导培养4hr。`
[0024]3) SDS-PAGE 电泳验证
[0025]A.样品:诱导前后菌液经4°C, 1000Og离心5min,弃去上清,保留菌体沉淀；诱导管加入300 μ I预冷的PBS，冰上超声裂解细菌(每次超声5sec，间隔lOsec，如此循环5次)；诱导管超声结束后，41:，13200印111离心301^11，取上清液28111并保留沉淀。上清加入5 X SDS-PAGE样品缓冲液7 μ I，沉淀中加入I X SDS-PAGE样品缓冲液30 μ I ;对照管则在菌体沉淀中加入I X SDS-PAGE样品缓冲液50 μ 1，混匀菌体沉淀。
[0026]B.将样品管置于100°C水浴中煮5min，然后13200g离心lOmin，分别取10 μ I上清作SDS-PAGE电泳，浓缩胶5 %，分离胶12 %。
[0027]C.电泳条件:浓缩胶部分恒压80V，分离胶部分恒压120V。
[0028]D.电泳结束后，凝胶于考马斯亮蓝R250染液中固定、染色，室温2hr。
[0029]E.弃去染色液，蒸馏水洗去残留染色液后加脱色液脱色。
[0030]1.1.6重组蛋白GST-PKM2-A的大规模制备
[0031]质粒pET24a含有一个GST标签，诱导表达的融合蛋白比目的蛋白大26KD。
[0032]选取可表达融合蛋白的细菌克隆接种于IOml含60μ g/nl氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜。第2天分别将其接种到800ml (1000ml三角烧瓶每瓶200ml)含60 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中(培养基体积不超过三角烧瓶容积的1/4)。37°C，250rpm,振荡培养至OD6tltl约0.6后，每瓶加入IPTG至终浓度为0.8mM, 30°C继续培养4hr。4°C, 1000Orpm离心IOmin收获细菌存于-20°C。[0033]1.1.7重组蛋白的纯化
[0034]1)每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS缓冲液；加入溶菌酶至最终浓度Img/ml,冰上或冷藏放置30min ；
[0035]2)用针筒将IOml0.2% TritonX-1OO强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀，加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4°C震动并温育IOmin ；
[0036]3) 40C 3000g(5000r/min)离心30min ;上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为 Immol/I,；
[0037]4)细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml细胞培养物加2ml树脂，于室温下轻摇30min ；
[0038]5)混合物于4°C以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE ；
[0039]6)沉淀中加入10倍标准体积的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白；洗涤3次。
[0040]7)沉淀中加入I倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动lOmin，洗脱树脂上结合的蛋白；
[0041]8)用Western blot方法鉴定蛋白(说明书附图2)。
[0042]2:合成PKM2的表位筛选多肽组
[0043]采用多肽合成仪进行多肽片段的合成，多肽合成仪为:ABI 433型多肽合成系，合成的序列进行biotin的标记，以利于肽片段固定于带有strepavidin的酶标版上，B片段组的序列如下:I) Biotin-1YHLQLFEEL, 2) Biotin-RRLAPITSDP, 3) Biotin-TE ATAVGAVE, 4)Biotin-ASFKCCSG,5)Biotin-AIIV LTK, 6)Biotin-LFEELRRLAP,7)Biotin-1TSDPTEATA, 8)Biotin-VGAVEASFKC，9)Biotin-CSGAIIVLTK。
[0044]3:PKM2的A、B片段的筛选及结果判定和分析
[0045]3.1 PKM2-A片段的筛选
[0046]PKM2-A片段偶联有GST序列，因此此序列仅用于抗体的初步筛选。按照常规单克隆制备方法免疫Balb/c小鼠，制备杂合瘤单克隆细胞。筛选时，在96孔的酶标板上用固定液(碳酸盐固定液)直接固定GST-PKM2-A抗原，同时固定GST作为对照。选择对GST-PKM2-A片段强阳性(0D值大于1.5)的而对GST阴性的抗体，排除针对GST的抗体，初步筛选到针对PKM2-A片段的特异性抗体。同时，采用合成PKMl的同源序列(MF HRKLFEELVR ASSHSTDLMEAMAMGSVEASYKCLAAALIV LTE)进行反应，排除对PKMl有结合的抗体，提高PKM2抗体的特异性。
[0047]3.2PKM2-B片段群多肽的筛选及结果判定和分析
[0048]通过PKM2-A片段的初步筛选，获取针对PKM2的特异性抗体。对这部分特异性的PKM2抗体，用合成的多肽分别进行筛选，选择各个片段相应的高亲和力抗体。对于针对每种独特片段的高亲和力抗体(0D值大于2.0)，进行多轮的筛选，最后筛选到各自相应的单克隆抗体，其应具备高亲和力和高特异性。不同表位的抗体进行组合及优化，用于开发后续的试剂盒。
[0049]【专利附图】
【附图说明】图1 PKM2-A的特异序列。在PKM2的389-433位的氨基酸序列为PKM2的独特序列A (黄色标记部分)，PKMl的特异序列为绿色标记部分。为了克服PKM2对PKMl的交叉反应，必须选择这段独特氨基酸序列作为抗原进行免疫。
[0050]图2 GST-PKM2A重组蛋白Western Blot鉴定图。Non-1nduced为无诱导的样本；Induced为诱导的GST-PKM2`重组蛋白，大小为31kD。
【权利要求】
1.一种提高M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白的制备方法，其特征在于: (1)通过GST标签连接PKM2特异序列多肽抗原，提高免疫效果。 (2)多种PKM2的多肽序列，偶联至生物素，减少非特异性抗体结合，提高筛选效率。 (3)9个多肽中独特的氨基酸序列，可以用于筛选不同表位的抗体。
2.如权利要求书I(I)所述，其特征在于将PKM2的独特序列(IY HLQLFEELRRLAPITSDPTE ATAVGAVEASFKCCSGAIIV LTK)连接至带有标签谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的pET24a载体上，通过GST标签与PKM2特异序列的连接，增加免疫原的特异性及分子量，提高免疫效果。
3.如权利要求书1(2)所述，其特征在于将PKM2的多肽序列偶联至生物素上，与固定有链唑霉素(strepavidin)的酶标板结合，由于多肽序列的片段较小，具有高特异性和亲和力的抗体才能有较强的结合，因此可以减少非特异性抗体的结合，提高免疫效果。
4.如权利要求书1(3)所述，其特征在于合成PKM2的9个多肽的独特氨基酸序列，序列如下:l)Biotin-1YHLQLFEEL，2)Biotin-RRLAPITSDP，3)Biotin-TE ATAVGAVE，4)Biotin-ASFKCCSG,5)Biotin-AIIV LTK，6)Biotin-LFEELRRLAP，7)Biotin-1TSDPTEATA，8)Biotin-VGAVEASFKC,9)Biotin-CSGAIIVLTK0这些具不同特异性的抗原，可用于筛选不同表位的抗体。
【文档编号】C12N15/54GK103667321SQ201210106866
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年4月12日 优先权日:2012年4月12日
【发明者】邹国源, 陈琍, 高文霞 申请人:上海铂嵋生物科技有限公司