通过改进丙酮酸磷酸二激酶提高植物光合作用速度的方法

专利名称：通过改进丙酮酸磷酸二激酶提高植物光合作用速度的方法
技术领域：
本发明涉及C4植物的转化。它还涉及到外源基因在C4植物中的高水平表达。更具体地是，本发明涉及到在低温条件下仍保持良好光合作用能力的C4植物的培育，该C4植物获得了一个组成C4光合作用途径的高水平表达的酶。本发明在提高具有丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)的C4植物的生产上(特别是在低温条件下对玉米生产的提高)特别有用。
背景技术：
植物丙酮酸正磷酸二激酶(pyruvate，orthophosphate dikinase，PPDK；EC2.7.9.1)是组成C4循环的一种重要的酶。据报道，C4植物的PPDK活性与光合作用率有很高的相关性。此外，在组成C4循环的酶中，PPDK的酶活性最低；PPDK反应被认为是C4光合作用的限速步骤。除此之外，PPDK蛋白质是一个四聚体，由四个彼此之间结合力微弱的亚基组成。当被暴露在低温条件下(12℃或12℃)时，PPDK被认为解离成二聚体或单体，从而迅速失去活性。一般来说，在0℃条件下处理20分钟后，玉米的PPDK活性将丧失大约70％。同时，根据在各种温度下对玉米PPDK活性的测定而做的阿累尼乌斯曲线图(Arrhenius plot)显示，在11.7℃有一个弯曲点(inflectionpoint)，这一点和玉米生长的临界温度是一致的。考虑到这些点，PPDK活性的下降被认为是与C4植物在低温条件下光合作用减速相关的主要因素。
Flaveria brownii(F.brownii)是一种菊科(Asteraceae)植物，被归类为C3/C4中间型植物，它的PPDK被公认几乎不能被灭活(deactivated)，甚至在低至0℃这样的温度条件下处理也是如此(Burnell JN，A comparativesturdy of the cold-sensitivity of pyruvate，Pi dikinese in Flaveria species，PlantCell Physiol.，31295-297(1990))。因此，这种耐低温的PPDK基因有望能被用来培育出在低温条件下仍具有C4光合作用能力的C4植物，即，更能抵抗低温的C4植物。
在先前的研究中，本发明的发明者们通过分离和测定F.brownii的PPDK基因的DNA序列，成功地确定出PPDK基因中与耐低温作用相关的重要区域。他们还证明，通过将这个区域的序列与来自其它植物的低温敏感性PPDK基因DNA之间进行重组，这个区域的序列能被用来把低温敏感性PPDK转变成耐低温的形式(WO95/15385；Usami S，Ohta S，Komari T，BurnellJN，Cold stability of pyruvate，orthophosphate dikinase of Flaveria brownii，PlantMol Biol，27969-80(1995)；Ohta S，Usami S，Ueki J，Kumashiro T，Komari T，Burnell JN，Identification of the amino acid residues responsible for coldtolerance in Flaveria brownii pyruvate，orthophosphate dikinase，FEB S Lett，396152-6(1996))。
然而，通过对玉米转化体的许多研究，本发明的发明者们发现人工导入的PPDK(导入的PPDK)的效应被C4植物体内自然产生的PPDK(内源PPDK)所屏蔽。这可能是由于在C4植物体内可溶性的蛋白质中含有丰富的内源PPDK，内源PPDK占了很大的百分比。而且，本发明的发明者们发现导入的PPDK亚基会和内源PPDK的亚基形成杂合四聚体。
为了克服导入的PPDK的效果被内源PPDK所屏蔽的现象，有两种技术可被采用，其中一种涉及到提高导入的PPDK的表达水平，另外一种是抑制内源PPDK。前者涉及到将序列(例如，内含子)整合到用于转化的基因构建体中(在大多数情况下，内含子被整合到启动子和结构基因之间)，以增加导入的外源基因的表达水平(WO96/30510PLD内含子，WO97/47755双连接内含子(double-ligated introns))。后者则是利用一种反义技术抑制靶基因的表达水平，通过导入其mRNA具有与靶基因的mRNA序列互补的基因，达到抑制靶基因表达的目的(日本专利2651442和它的分案申请2694924)。本发明的发明者们已经尝试了这些技术。
在通过整合内含子等来增加导入的PPDK表达水平的过程中，用于转化的基因构建体用常规的方法通过把玉米PPDK启动子(Glackin CA，Grula JW，Organ-specific transcripts of different size and abundance derive from the samepyruvate，orthophosphate dikinase gene in maize，PNAS，873004-3008(1990))和来自F.brownii，F.bidentis(Usami S，Ohta S，Komari T，Burnell JN，Coldstability of pyruvate，orthophosphate dikinase of Flaveria brownii，Plant Mol Biol，27969-80(1995))或玉米(Matsuoka M，Structure，genetic mapping，andexpression of the gene for pyruvate，orthophosphate dikinase from maize，J.Biol.Chem，26516772-16777(1990))的PPDK基因的cDNA分子连接而被构建。同时，本发明的发明者们通过在启动子和结构基因之间插入下列内含子中的任何一种，来试图增加导入的PPDK的表达水平。这些内含子是蓖麻子过氧化氢酶基因的内含子1(Ohta S，Mita S，Hattori T，Nakamura K，Constructionand expression in tobacco of a β-glucuronidase(GUS)reporter gene containingan intron within the coding sequence，Plant Cell Physiol，31805-813(1990))；水稻磷脂酶D基因的内含子1((Ueki J，Morioka S，Komari T，Kumashiro T，Purification and characterization of phospholipase D from rice and maize(Zeamays L.)，Plant Cell Physiol，36903-914(1995))；玉米泛素的内含子1(Christensen et al.，(1992))以及玉米Shrunken-1的内含子1(Vasil V，Clancy M，Ferl RJ，Vasil IK，Hannah LC，Increased gene expression by the first intron ofmaize Shrunken-1 locus in grass species，Plant Physiol，911575-1579(1989))。此外，根据一份报告的建议，重复的内含子会导致表达水平的增加(Ueki J，OhtaS，Morioka S，Komari T，Kuwata S，Kubo T，Imaseki H，The synergistic effects oftwo-intron insertions on heterologous gene expression and advantages of the firstintron of a rice gene for phospholipase D，Plant Cell Physiol，40618-623(1999))，本发明的发明者们也尝试插入多个重复的内含子。

发明内容
本发明的发明者们的研究表明，这些内含子按下面的顺序导致基因表达水平的增加Shrunken-1基因的内含子1＜蓖麻子过氧化氢酶基因的内含子1＜水稻磷脂酶D基因的内含子1(Intron 1)，并且，当组合在一起插入时，这些内含子产生的表达水平增加量比单独插入时高。例如，当水稻磷脂酶D基因的内含子1和蓖麻子过氧化氢酶基因的内含子1或玉米泛素基因的内含子1结合在一起时导致表达水平增高。
然而，即使是导入的PPDK最高的转化表达量其水平也很低，表达水平在700μg/g新鲜绿叶左右，仅约是内源PPDK表达量的一半；导入PPDK没有引起显著的效应。尽管相对于其它人工导入的基因，PPDK的表达水平被认为比较高了，但是在存在大量内源基因产物的情况下(即在内源基因高表达的情况下)，除非内源基因被抑制，否则导入基因将不可能产生明确的效应。
相反，根据含有自5’-非翻译区中的SacI到内含子1的EcoRI的玉米PPDK基因395bp长的序列，这段序列的6个重复拷贝或者是涵盖了玉米PPDK成熟酶几乎全部片段的源自cDNA的PstI片段(2.4kb)，构建抑制内源PPDK基因的反义基因。构建好的反义基因被用于转化玉米。直接关注395 bp长序列的原因是因为这段序列和转运肽部分对应，并且在玉米PPDK和F.brownii的PPDK序列之间的同源性比较低，于是它将能够选择性地单独抑制玉米的PPDK基因。
结果，简单地导入针对395 bp序列的反义基因没有在表达水平上观察到抑制效应。在玉米被针对6个重复的395 bp序列拷贝的基因或来自cDNA的片段(2.4kb)转化的情况下，一些转化体发生改变而抑制它们的内源PPDK，但发生的频率低。然而，这些被修饰成抑制它们内源PPDK的转化体也降低了导入的PPDK的表达水平，所以没有获得只对内源PPKD基因的特异性抑制。此外，这样的转化体太脆弱了，以至不能正常生长发育，并且它们中的大多数在成熟前枯萎和死亡，因为抑制作用针对C4植物必需的PPDK，既包括内源的PPDK也包括导入的PPDK。同样，这些转化植株即使能够开花也看不到种子。由于反义技术本身的机理，通过反义技术选择性地控制具有非常相似序列的基因的表达在理论上是不可能的。这就表明，这样的技术不能满足目前这种情况的需要。
尝试将基因组基因，而不是cDNA导入C3植物，使对于构成C4光合作用途径的酶的基因获得高水平的表达(JP10-248419A)。然而，在这样的试验中，在C3植物中不存在的基因(或者，若有的话，表达水平也非常低)只是被从C4植物导入到C3植物。C4植物中天然存在的基因在C4植物中获得进一步表达，或者像光合作用相关的酶那样的在C4植物中已经表达丰度高的蛋白的编码基因要获得进一步高水平的表达，将比在C3植物中得到C4植物来源的基因表达更难。
先前各种生物化学研究估计，PPDK可能是C4光合作用的限速因素。然而，没有决定性的证据确定以前的那些研究是正确的，因为没有报道显示PPDK或人工导入的具有新性质的PPDK在C4植物中的确实高水平表达。
如上所述，基于cDNA的技术不能将导入基因的表达提高到满足需要的水平，即使结合一个或多个内含子等也是如此；而反义技术不能选择性的只抑制内源基因。基于这个原因，本发明的发明者们尝试导入基因组基因。
同时，本发明的发明者们的研究表明当耐低温的F.brownii的PPDK的cDNA被这样导入玉米时，导入的基因的表达水平非常低。这可能是因为F.brownii是一种C3/C4中间型植物，自然产生的PPDK的量比C4植物的少。此外，本发明的发明者发现C4植物中F.brownii PPDK的表达量可以通过构建介于纯的C4植物F.bidentis(或玉米)的和F.brownii的嵌合基因而得到提高。
反过来，本发明的发明者们根据玉米PPDK的基因组基因，而不是C3/C4中间型植物F.brownii PPDK的基因组基因对基因组基因的导入进行了多种研究。结果，他们发现通过简单地把玉米的PPDK基因组基因导入到玉米中，玉米PPDK的表达水平增加，并且通过在玉米PPDK基因组基因的某个区域进行突变将其修饰为耐低温的类型，导入这种修饰基因后，在低温条件下栽培的玉米PPDK的表达水平也增加。这些结果使本发明得以完成。
本发明提供了一个提高组成C4植物光合作用途径的酶表达水平的方法，该方法包括用表达盒转化C4植物，该表达盒包括启动子、在上述启动子控制下的编码酶的C4植物的基因组基因和终止子。它还提供通过这种方法获得的转基因C4植物。
附图简述

图1说明在实施例1中构建#2706的流程。
图2A显示用玉米基因组基因(#2706)修饰的转化体后代植株中的PPDK量，并将对于导入的PPDK基因纯合(homo)或杂合(hetero)的个体与不含该基因的个体(null)之间进行比较。纵轴表示每克(g)新鲜绿叶中PPDK的表达水平(ug/gfwt)，每个bar代表标准差(error)。在1％的显著性水平上，纯合或杂合的个体和不含外源基因的个体之间有显著差异。
图2B显示导入玉米基因组基因(#2706)修饰的转化体后代植株在不同叶表面温度下的光合作用率，并对纯合或杂合个体和不含(nun)外源基因的个体进行了比较。纵轴代表光合作用率(umol CO2·m-2·S-1)，每一个bar表示标准误。在叶表面温度8℃，显著性水平在5％时，纯合或杂合的个体和不含外源的个体间有显著差异。
图3说明将F.brownii类型的突变体导入PPDK基因组的流程。
图4说明在实施例2中构建#2838的流程。
图5A显示玉米PPDK的氨基酸序列。
图5B显示F.brownii PPDK的氨基酸序列。方框中的氨基酸序列位于C-端大约1/6区域，对耐低温性很重要。
图5C显示玉米PPDK和F.brownii PPDK C-端1/6区域的氨基酸序列之间的比较。它们之间不同的氨基酸序列用方框表示。
图6A显示导入突变玉米基因组基因(#2838)修饰的转化体后代植株中的PPDK的量，并对纯合(homo)或杂合(hetero)的个体与不含该基因(null)的个体之间进行比较。纵轴表示每克(g)新鲜绿叶中PPDK的表达水平(ug/gfwt)，每个bar代表标准误。
图6B显示#2838修饰的转化体后代植株在不同叶表面温度下光合作用率，对纯合或杂合个体同不含外源基因的个体进行比较。纵轴代表光合作用率(umol CO2·m-2·S-1)，每一个bar表示标准误。
图7A显示突变的玉米基因组基因(#2838)修饰的转化体后代植株在不同叶表面温度下的PPDK的量，对纯合或杂合个体同不含外源基因的个体进行了比较。纵轴表示每克(g)新鲜绿叶中所含PPDK的表达水平(ug/gfwt)，每个bar代表标准误。
图7B显示#2838修饰的转化体后代植株在不同叶表面温度下的光合作用率，对纯合或杂合个体同不含外源基因的个体进行了比较。纵轴代表光合作用率(umol CO2·m-2·S-1)，每一个bar表示标准误。在叶表面温度20℃和13℃，显著性水平在5％时，纯合或杂合的个体和不含外源的个体间有显著差异。在叶表面温度8℃，1％的显著性水平上，有显著差异。
图8显示在突变的玉米基因组基因的转化体中PPDK低温失活的方式。横轴代表在冰上处理的时间(min)，纵轴代表PPDK的活性(％)。空心三角(△)、空心方块(□)、实心三角(▲)、实心圆(●)和空心圆(○)分别代表PPDK含量为4152.3μg/gfwt、9122.4μg/gfwt、1390.6μg/gfwt、9802.8μg/gfwt和1292.1μg/gfwt的转化植株，相对于1g脱盐的新鲜绿叶。乘号(×)代表F.brownii，加号(+)代表玉米自交系A188(1495.2μg/gfwt)。具有高PPDK含量的转化体能保持它们的PPDK活性，甚至在冰上也保持在差不多和F.brownii在同样的水平上。
发明详述本文所用术语“组成C4光合作用途径的酶”的酶包括多种已知的酶。在这些酶中，本发明的方法被用来增加那些表达水平相对低、容易失活的，和/或涉及光合作用途径限速步骤的酶的表达水平。特别是，本发明的方法能被用来增加在低温条件下(例如，在约12℃或12℃以下)具有前面提到的性质的酶的表达水平。PPDK是公认的这样酶的例子。同样，本发明的方法也能被用来增强在低温时(例如，在约12℃或更低)生长受限制的C4植物在低温条件下的光合作用能力。
在本发明的方法被用来培育转基因C4植物的情况下，由下面任一DNA分子组成的基因能被用做“编码组成光合作用途径酶的C4植物的基因组基因”。使用这样基因的方法特别优选以获得在低温条件下被修饰的增强它们光合作用率的玉米植株(a)玉米PPDK基因组基因，即，由SEQ ID NO15的Nos.1732-8508核苷酸序列组成的DNA分子；(b)DNA分子，其由源自SEQ ID NO15的Nos.1732-8508的经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并能编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下能与下述的DNA杂交，该DNA分子互补于由来自SEQ ID NO15的Nos.1732-8508的核苷酸的核苷酸序列组成的DNA分子，并能编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，其由与来自SEQ ID NO15的Nos.1732-8508的核苷酸序列具有至少50％(优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％)的同源性的核苷酸序列组成，并编码具有PPDK活性的蛋白质，利用商业的软件包来计算核苷酸序列之间的同源性。在这里，术语“严紧条件”是指杂交条件温度至少在约40℃、盐浓度约6×SSC(1×SSC＝15mM柠檬酸钠缓冲液；pH7.0；0.15M氯化钠)和0.1％SDS，温度优选在至少约50℃，更优选至少约65℃。
或者，编码下列的任一蛋白质的基因可被使用(a)由SEQ ID NO17的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)一种蛋白质，其由源自SEQ ID NO17的氨基酸序列经缺失、取代、添加或插入一个或多个氨基酸而成的氨基酸序列组成，并具有PPDK活性；
(c)源自C4植物的PPDK；以及(d)一种蛋白质，其由至少与SEQ ID NO17的氨基酸序列有50％的同源性(优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％)的氨基酸序列组成，并具有PPDK活性。在这里使用的术语“同源性”在针对氨基酸时，通常意思是指组成被比较的各个序列的氨基酸残基之间的相似性程度。就这种意义来说，缺口(gaps)的存在和氨基酸的本身性质应被考虑。可以使用商业购得的软件包。
在这里，除非特别说明，术语“基因组基因”包括源自基因组的基因本身和其修饰形式。同样，在这里，术语“编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因”包括源自C4植物基因组的基因本身和其修饰形式。这样的修饰基因优选修饰成具有一个或多个核苷酸的取代，使得由该基因编码的酶的氨基酸序列等同于具有要求特征(例如，耐低温性)的植物中相应酶的氨基酸序列，优选在C4植物中或C3和C4中间型植物中，更优选属于Flaveria的植物，甚至更优选F.brownii或F.bidentis。优选的是，这样的取代允许专一地发生在外显子片段中，尽可能多的内含子片段要被保持完整。对被取代的碱基数目没有特殊的限制，但是，在组成光合作用途径的酶是PPDK时，它优选大约1到50，更优选大约1到40，最优选大约1到30(例如，29)。同样，当组成光合作用途径的酶是PPDK时，被取代的氨基酸优选约1到40个，更优选约1到30个，最优选约1到20(例如，像图5所示的17个)。
在本发明培育耐低温的C4植物的一个优选地实施方案中，被修饰成耐低温类型并在靶植物里有高水平表达能力的PPDK基因用作编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因。
例如，通过确定在要表达的PPDK的氨基酸序列和在表达耐低温(优选是高表达)PPDK植物中相应的PPDK氨基酸序列的“等价(equivalence)”，完成这样的耐低温修饰。特别地，例如，通过导入突变以使得与F.brownii PPDK的氨基酸序列等价来完成这种修饰作用。更具体地，通过下述得以完成，例如，通过将17个点突变导入或衍生于玉米PPDK基因组基因的外显子15(Exon 15)的下游，使得涵盖玉米PPDKC-末端大约1/6区域的氨基酸序列(所述氨基酸序列对应于SEQ ID NO15的No.7682序列下游)，与涵盖自F.brownii PPDK的C-末端大约1/6区域的氨基酸序列相同，所述氨基酸序列对于耐低温是重要的(所述氨基酸序列与SEQ ID NO16的No.7682下游序列对应)。为了这个目的，期望使用在玉米中存在频率高的密码子。对于本领域的技术人员来说，导入点突变可能是常规技术，例如，通过用携带突变的引物对或引物组进行PCR。
这里，在针对氨基酸序列时，术语“等价的”或“等价”的含义既包括氨基酸序列和靶序列“相同”的意思，也包括考虑到氨基酸的性质被其他性质类似的氨基酸取代的经修饰的氨基酸序列。同样，在某种酶的氨基酸序列“与具有期望特征的植物的相应酶的氨基酸序列等价”的意思包括前者与后者的氨基酸序列严格完全相同，和前者与后者的氨基酸序列不严格完全相同，而修饰成包括替代一个或多个(优选1到40，更优选1到30，最优选1到20个)氨基酸而和后者不同的氨基酸来确定等价体。
例如，为了获得经修饰的耐低温类型和在靶植物中有高水平表达能力的PPDK基因，上面提到的突变允许专一性地发生在外显子片段中，C4植物来源的PPDK基因的内含子片段应尽可能多地保持完整。
作为突变的“编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因”的基因由下列可用的DNA分子组成。这样的基因特别优选那些使修饰的玉米植株在低温条件下光合作用率获得增强的基因(a)源自玉米PPDK基因组基因外显子15下游区域的核苷酸序列，其中氨基酸序列被突变为等价于F.brownii的PPDK的氨基酸序列，即，由SEQ ID NO16的Nos.1732-8508的核苷酸序列组成的DNA分子；(b)DNA分子，由来自SEQ ID NO16的Nos.1732-8508的经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下能与来自SEQ ID NO16的Nos.1732-8508的经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成的DNA分子互补的DNA分子杂交，编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO16的Nos.1732-8508核苷酸序列具有至少50％同源性(优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％)的核苷酸序列组成具有PPDK活性。
或者，编码下列任何一种蛋白质的基因可以被使用
(a)F.brownii PPDK，即，由SEQ ID NO18氨基酸序列组成的蛋白质；(b)一种蛋白质，由来自SEQ ID NO18的经缺失、取代、添加或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有PPDK活性；(c)源自一种耐低温的C4植物的PPDK或源自一种耐低温的C3/C4中间型植物(优选是Flaveria brownii)的PPDK；以及(d)一种蛋白质，由与SEQ ID NO18的氨基酸序列具有至少50％的同源性(优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％)的氨基酸序列组成，并具有PPDK活性。
本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括表达调控区，如启动子；在上述区域控制下的编码一种组成光合作用途径的酶的下游C4植物基因组基因(源自基因组的类型或修饰类型)；和终止子。
只要可以在转化的植物中能发挥作用，任何启动子都可能被用在本发明的表达盒里。可利用的启动子的例子包括引起光合作用相关的基因在绿色组织高水平表达的启动子；光合作用相关的基因包括PPDK(Matsuoka et al.，Proc Natl Acad Sci USA，909586-9590(1993))，PEPC(Yanagisawa and Izui，JBiochem，106982-987(1989)and Matsuoka et al.，Plant J，6311-319(1994))和Rubisco(Matsuoka et al.，Plant J，6311-319(1994))；花椰菜花叶病毒35S启动子；泛素启动子(Cornejo et al.，Plant Mol Biol，23567-581(1993))；肌动蛋白启动子(McElroy et al.，Plant Cell，2163-171(1990))；α-微管蛋白启动子(Carpenter et al.，Plant Mol Biol，21937-942(1993))；Sc启动子(Schenk et al.，Plant Mol Biol，391221-1230(1999))；豌豆(Pea)PAL启动子；Prp1启动子(JP 10-500312 A)；hsr203J启动子(Pontier et al.，Plant J，5507-521(1994))；EAS4启动子(Yin et al.，Plant Physiol，115437-451(1997))；PR1b1启动子(Tornero et al.，Mol Plant Microbe Interact，10624-634(1997))；tap1启动子(Mohan et al.，Plant Mol Biol，22475-490(1993))；和AoPR1启动子(Warneret al.，Plant J，3191-201(1993))。
只要可以在转化的植物中能发挥作用，任何终止子都可能被用在表达盒里。提供的终止子的例子包括nos终止子，CaMV 35S终止子，基因7终止子和蛋白酶抑制剂II终止子。
本发明通过举例子的方式展示包括下列DNA分子本发明的表达盒
(a)DNA分子，由SEQ ID NO15的核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由SEQ ID NO15的经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的而成的核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下能与由SEQ ID NO15核苷酸序列组成的DNA分子互补的DNA分子杂交，并编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO15的核苷酸序列具有至少50％(优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％)同源性的核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质；或者(a)DNA分子，由SEQ ID NO16的核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由来自SEQ ID NO16的经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下能与由SEQ ID NO16的核苷酸序列组成的DNA分子互补的DNA分子杂交，并编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO16的核苷酸序列具有至少50％(优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，特别优选至少95％，最优选至少98％)同源性的核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质。
本发明的表达盒对培育修饰的C4植物以在低温条件下增强光合作用速率特别有用。本发明还提供了包含这样表达盒的重组载体。
本发明中用于亚克隆每一个DNA片段的载体可以很方便地用本领域常规的方法将目的基因连接到重组载体(质粒DNA)上。特别的可用载体例子包括pCR2.1、pBluescript、pUC18、pUC19和pBR322，针对源自大肠杆菌(E.coli)的质粒的例子。
在本发明把表达盒导入靶植物的过程中植物转化载体有用。只要可以在植物细胞中能表达目的基因，并能产生目的蛋白质，任何植物转化载体都可能被使用。例子包括pBI221，pBI121(二者都由Clontech公司获得)以及由它们衍生的载体。
特别对于单子叶植物的转化来说，下面的载体可以例证pIG121Hm和pTOK233(二者都可在文献中找到Hiei et al.，Plant J.，6271-282(1994))、pSB424(Komari et al.，Plant J.，10165-174(1996))、pSB11、pSB21以及由它们衍生的载体。
优选地，植物转化载体至少包括启动子，起始密码子，一种编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因(源自基因组的类型或修饰类型)；终止密码子和终止子。合适地，它还可包括编码信号肽的DNA序列、增强子序列、靶基因5’-和3’-端的非翻译区、选择性标记区，等等。标记基因的例子包括抗生素抗性基因，诸如抗四环素、氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、潮霉素和壮观霉素的基因，还有荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，绿色荧光蛋白(GFP)基因，β-内酰胺酶基因和氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。
植物转化的技术已被建立，其中可采用农杆菌转化的方法。这个方法众所周知，能用来转化双子叶和单子叶植物(WO94/00977，WO95/06722)。基因导入也能通过例如对于原生质体的标准技术电穿孔或粒子枪等以常规方式完成。对于在这里使用的基因来说，术语“导入”或“导入”除非特殊说明，意思都是基因被从外部转入靶植物(通常是植物细胞)中。导入的基因优选是被整合到靶植物的基因组中。
通过用适当的标记作为指示选择转化的细胞。用常规技术可以将转化的细胞分化形成目的转基因植物。
采用本领域的技术人员熟知的各种方法对转化体进行分析。例如根据导入基因的DNA序列合成寡核苷酸引物，然后用于PCR以分析转基因植物的染色体DNA。或者，通过确定与导入基因相关的mRNA或蛋白质表达的有或无来完成分析。进一步，可以通过检测得到的植物的特性，包括耐低温性。在PPDK的基因组基因被导入的情况下，通过分析PPDK的表达水平分析转化体。为了确定转化体是否具有耐低温性，转化体本身或从转化体身上收集的PPDK被用来分析在低温条件下处理时PPDK活性的下降。本领域的技术人员都熟知这些程序。
与非转基因的植物相比，本发明的转基因植物使组成光合作用途径的酶表达的更多。表达水平优选是有效量的以促进转基因植物光合作用率。“促进光合作用率有效量”意思是在某种温度，优选是低温(例如，在约12℃和约0℃)下，与非转基因植物相比，转基因植物使组成光合作用途径的酶表达的更多，以至于转基因植物有更高的光合作用率和/或生长的更好或培育出高产量的目的植物。
此外，当与非转基因的植物比较时，在本发明用修饰的基因组基因培育的转基因植物中，组成光合作用途径的酶被更高的表达和/或对失活作用有更高的抗性。在这种情况下，转基因植物中表达/失活的水平优选是有效量以增强光合作用率。“提高光合作用率的有效量”的含义如前文所述。“提高光合作用率的有效量”用以针对失活作用的意思是指在某种温度，优选低温(例如，在约12℃和约0℃)下，与非转基因的植物相比，转基因植物对失活作用的抗性的增强，以至于转基因植物有更高的光合作用率和/或生长的更好或高产量地产生目的产物。
除了下面显示的玉米的实例外，本发明还能应用于其他C4植物，包括甘蔗、绿苋(green amaranth)、粟(Japanese millet)、谷子(foxtail millet)、高粱、黍(millet)和稷(proso millet)。
在这里，术语“转基因植物”的范围，不仅包括根据本发明的方法制备的由重组植物细胞再生得到的转基因植物(T0代)，只要植物的后代保留导入特征，还包括由这些植物获得的后代植物(例如，T1代)。同样，除非有特殊说明，在这里用到的术语“植物”范围包括植物个体还有种子(包括萌发的种子和未成熟的种子)、器官或其部分(包括叶、根、茎、花、雄蕊、雌蕊或其部分)、培养的植物细胞、愈伤组织和原生质体。
本发明的方法在C4植物中使组成光合作用途径的酶(例如，作为C4循环中重要酶的PPDK或其修饰形式)获得更多的表达。本发明的方法进一步增强了C4植物的光合作用速率，使得C4植物能够获得耐低温性。这反过来增加了具有PPDK的C4植物产量，特别是增加了玉米等在低温条件下的产量。
到目前为止，有一些C4植物基因组基因在C3植物中表达的例子，但是还没有C4植物基因组基因导进C4植物中以获得高水平基因表达的实例。因为C3植物基本上不含有C4光合作用涉及到的基因(或者，如果可能，其量也很低)，C3植物容易表现出所导入基因引起的效应。根据本发明，C4植物的基因组基因能在C4植物中得到高水平表达，并且能获得不被相关内源基因屏蔽住的导入基因产生的效果。同样，本发明的另外一个实施方案，应用点突变的方法，修饰基因的性质，以在特定的条件下(例如，低温条件)产生更大的效果，而不是简单地提高表达水平。本发明使C4光合作用涉及到的PPDK基因在C4植物中高水平地表达，于是第一次在C4植物里获得了光合作用率的增强，这是过去所不曾实现的。
尽管，如上所述，本发明的方法可用在转化组成C4光合作用途径的酶，相同的方法也可采用以提供其它所需特性的C4植物。也就是，本发明还提供了用一种表达盒在植物中高效表达目的蛋白质的方法；该表达盒包括启动子，在上述启动子控制下的编码目的蛋白质的植物的基因组基因，和终止子。这里用的基因组基因优选包括的核苷酸序列衍生自编码目的蛋白的源自植物基因组的基因的核苷酸序列，通过在基因的外显子区域缺失、取代或插入一个或多个核苷酸，并保持基因的内含子。尽管本发明的方法对转化C4植物有用，相同的方法也可适用于转化其他植物。
实施例<实施例1>
(构建#2706)为了向玉米导入未经修饰的玉米PPDK基因组基因，用于转化的基因(#2706)按以下方法构建。
将包含从内含子1的后半部分到内含子6的前(first)半部分的4.5kb长的BamHI片段从λongC中克隆的玉米PPDK基因组切下(Matsuoka M，1990)；然后，将之插进pSB11的BamHI位点(Komari T，Hiei Y，Saito Y，MuraiN，Kumashiro T，Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation ofhigher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation oftransformants free from selection marker，Plant J，10165-175，1996)。该质粒被XbaI消化以除去λ臂的片段，然后用Klenow酶钝端化(blunt-ended)。产生的片段被连到相似的钝端化的2kb EcoRI片段上(该片段包括从启动子区域到内含子1的中部)，该片段切自λEMBL3克隆的PPDK基因组基因(Matsuoka M，1990)。随后，3.3kb BamHI的片段从λongC克隆中切下，该片段包括从内含子6的后半部分到转录的终止区域，然后插进前面制备好的载体的BamHI位点，覆盖从启动子到内含子6的前半部分。最后，bar基因与玉米泛素启动子连接，玉米内含子和nos终止子被插进KpnI位点(图1)。最后构建完成的克隆#2706的DNA序列(启动子到终止子)显示在SEQ ID NO15。
(转基因植物的制备和评价)根据农杆菌转化的方法，用于转化的基因(#2706)被导入到玉米自交系(A188)中，以制备转基因植物。在那时，抗除草剂Basta基因被用来作为选择标记。产生的转基因植物经自交产生下一代，后代被种植。在幼苗期剪取叶片作为样品，放置在含Basta的培养基上，以在对于导入的PPDK基因是纯合或杂合的(homo or hetero)个体和不含外源基因(null)的个体间区分后代植株(Ming-Bo Wang，Peter M.Waterhouse，A rapid and simple method ofassaying plants transformed with hygromycin or PPT resistance，Plant MolecularBiology Reporter，15209-215(1997))。
随后，自每种植物叶片收集绿叶的提取物进行Western分析，评价每一后代植株中含有的PPDK的量。
进一步，从膝高(knee-height)期到去雄期(de-tasselling)期，使用光合作用测定设备(型号LI-6400和LI-COR)确定光合作用率。两种设备总是被同时用来测量一对相同转化体来源的纯合或杂合的(homo or hetero)或是不含外源基因(null)的个体(25对)。确定光合作用率的条件被设置如下室内(chamber)光照水平保持在1000μmol·m-2·s-1(来自人工光源LED)；室内的CO2水平保持在350μmol·CO2mol恒定；室内的湿度原则上不受限制(在宽松的范围内对测量没有影响)；和室内的气流(流率)保持在500μmol·s-1。光合作用率在叶表面温度30℃、20℃、13℃和8℃被测定。为了在低温条件下测量，光合作用测定设备和植物(只是叶)被转移到冷室中进行测定。数据分析经由配对t-检验(paired t-test)。
(结果)每克(g)新鲜的绿叶含有的PPDK的平均量在纯合或杂合(homo or hetero)组中是2484.0μg/gfwt，在null组中是1179.6μg/gfwt。当进行配对t-检验分析时，在1％的显著性水平上它们之间有显著差异。这表明玉米PPDK基因组基因的导入导致PPDK表达水平的增加(图2A)。
PPDK在表达水平上的这种增加也有效地证明导入基因的效应。在叶表面温度8℃时，和不含的个体相比，在纯合或杂合个体中光合作用率提高了(显著性水平5％)(图2B)。
<实施例2>
接着，本发明的发明者们尝试将玉米的PPDK基因组基因修饰成耐低温的形式。在先前的研究中，本发明的发明者们已经通过构建cDNA(WO95/15385)之间的嵌合基因，成功地人工制备了耐低温的PPDK基因。他们反过来制备了修饰的玉米PPDK基因组基因，它的部分序列用F.brownii PPDK cDNA序列替代，以便产生的拼接mRNA和由cDNA间耐低温的嵌合基因制备的mRNA相同，然后，这种嵌合基因被导入玉米，但结果表达水平很低。由于基因组基因被cDNA部分取代，消除了基因组基因中天然存在的内含子而导致了该结果的出现。
由于这个原因，本发明改造玉米PPDK基因组基因成为耐低温类型，同时使它的结构尽可能的保持完整。将点突变导入以构建耐低温的修饰的玉米PPDK基因组基因(#2838)如下。
(构建#2838)通过PCR技术将这些突变引入到基因组克隆中(Ho SN，Hunt HD，Horton RM，Pullen JK，Pease LR，Site-directed mutagenesis by overlap extensionusing the polymerase chain reaction，Gene 7751-59(1989))。为了将扩增错误减至最小，而使用PCR聚合酶，ExTaq或Pyrobest(都由Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)，并且每步中将每个片段亚克隆进质粒载体pCR2.1或pUC19中，以确定在它的核苷酸序列中没有错误。引入突变以使氨基酸序列等价于F.brownii PPDK的序列，选用在玉米PPDK基因中经常存在(occurred frequently)的密码子来实现这一目的。首先，对耐低温性重要的PPDK的C-末端大约1/6区域(Ohta S et al.，(1996)；相应于外显子15和它的下游区域)被分成6个片段，用带有突变的引物对扩增这些分开的片段F1&R1、F2&R2、F3&R3、F4&R4、F5&R5和F6&R6(SEQ ID NOs1到6和8到13)。通过PCR邻侧的(flanking)两个片段被相继连在一起，片段1到4被连接成一个片段。最后，所有的片段被连在一起形成XhoI-BamHI片段(图3)。
同时，包含从玉米PPDK基因组克隆外显子14后半部分到外显子16前半部分的SmaI-EcoRI片段被亚克隆进pUC18，接着用引物对M4(SEQ IDNO7)和mXho(SEQ ID NO14)通过PCR把XhoI位点导入外显子15中。这个片段被连在上面制备的XhoI-BamHI片段，替代相应的3.3kb BamHI片段中相应区域。该片段被插进载体的BamHI位点，所述载体包括从启动子到内含子6的前半部分。最后，bar基因被连接到玉米泛素启动子，玉米内含子和nos终止子被插进KpnI位点(图4)。最后构建完成的克隆#2838的DNA序列(启动子到终止子)被显示在SEQ ID NO16。
图5显示F.brownii PPDK对耐低温性重要的自C-末端大约1/6区域(上述氨基酸序列与SEQ ID NO16的No.7682下游的序列对应)和涵盖玉米PPDK基因相同区域的氨基酸序列(上述氨基酸序列与SEQ ID NO15的No.7682序列下游的对应)。
(转基因植物的制备和评价)用与实施例1相同的方式，点突变的耐低温玉米PPDK基因组基因(#2838)被导入玉米自交系(A188)中以制备转基因植物。
其次，用与实施例1相同的方式，在纯合或杂合的(homo or hetero)个体或不含外源基因(null)的个体间分类后代植株。接着用Western分析以评估PPDK的量和确定光合作用率。和在实施例1中一样，两种设备总是被用来测定光合作用率以在一对相同转化体来源的纯合或杂合的(homo or hetero)个体或是不含外源基因(null)的个体上同时实施测定。数据分析也进行配对t-检验。
(结果1)PPDK的量平均而言在纯合或杂合组中是2742.2μg/gfwt，在null组中是1471.8μg/gfwt(图6A)。这表明导入点突变的耐低温的玉米PPDK基因组基因导致PPDK表达水平增加。
同样，当与null个体比较时，发现纯合或杂合的个体的光合作用率得以改进(分析15对)(图6B)。
(结果2)确定光合作用率所用的植物数目分别是在30℃下，15对；在20℃下19对和在8℃下21对。各自温度下的PPDK的量被显示在图7A上(图7A)。纯合或杂合的个体远超过null个体(显著性水平1％)。
同样，当与null个体比较时，发现纯合或杂合的个体中光合作用率改善(图7B)。
这些结果表明与单纯导入未修饰的基因组PPDK相比，导入点突变的耐低温的玉米PPDK基因组基因导致PPDK表达水平的显著增加，并且进一步提高光合作用率。也就是，本发明的发明者们发现甚至在没有观察到差异的温度范围内简单改进表达水平，也改善光合作用率。
<实施例3>
进一步，本发明的发明者们检查了具有转入能改进耐低温性的基因组基因的转基因玉米中的PPDK活性。在实验中，使用了数种具有不同表达水平PPDK的玉米植株，并且用F.brownii和玉米自交系(A188)作为对照。收集自每个植株叶片的绿叶提取物，通过在Sephadex G25柱上进行脱盐，然后0℃放置(冰上)，接着通过周期性地确定PPDK活性。以监测在低温条件下PPDK活性变化的时期。PPDK的活性用常规方法确定(Jenkins CL，Hatch MD，Properties and reaction mechanism of C4 leaf pyruvate，Pi dikinase，ArchBiochem Biophys，23953-62，1985)。
图8显示了以上结果。它进一步证明具有高PPDK表达水平的转化体，如同在F.brownii的实例里，甚至在冰上也能抵抗失活作用。
序列表<110>日本烟草产业株式会社(JAPAN TOBACCO INC.)欣根塔有限公司(Syngenta Limited)<120>通过改进丙酮酸磷酸二激酶提高植物光合作用速度的方法<130>YCT-738<150>JP 2001-324899<151>2001-10-23<160>19<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物(F1)<400>1ctcgagcagc tctgatcgct gatgagg<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>正向引物(F2)<400>2
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<211>947<212>prt<213>玉米<223>PPDK<400>17Met Thr Ala Ser Val Ser Arg Ala Ile Cys Val Gln Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Lys Cys Thr Arg Asp Arg Glu Ala Thr Ser Phe Ala Arg Arg Ser Val20 25 30Ala Ala Pro Arg Pro Pro His Ala Lys Ala Ala Gly Val Ile Arg Ser35 40 45Asp Ser Gly Ala Gly Arg Gly Gln His Cys Ser Pro Leu Arg Ala Val50 55 60Val Asp Ala Ala Pro Ile Gln Thr Thr Lys Lys Arg Val Phe His Phe65 70 75 80Gly Lys Gly Lys Ser Glu Gly Asn Lys Thr Met Lys Glu Leu Leu Gly85 90 95Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Ala Ser Ile Gly Leu Ser Val100 105 110Pro Pro Gly Phe Thr Val Ser Thr Glu Ala Cys Gln Gln Tyr Gln Asp115 120 125Ala Gly Cys Ala Leu Pro Ala Gly Leu Trp Ala Glu Ile Val Asp Gly130 135 140Leu Gln Trp Val Glu Glu Tyr Met Gly Ala Thr Leu Gly Asp Pro Gln145 150 155 160Arg Pro Leu Leu Leu Ser Val Arg Ser Gly Ala Ala Val Ser Met Pro165 170 175
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Phe Ala Ser Asp Glu Arg Ile Lys Ala Val Arg Gln Met Ile Met Ala645 650 655Pro Thr Leu Glu Leu Arg Gln Gln Ala Leu Asp Arg Leu Leu Pro Tyr660 665 670Gln Arg Ser Asp Phe Glu Gly Ile Phe Arg Ala Met Asp Gly Leu Pro675 680 685Val Thr Ile Arg Leu Leu Asp Pro Pro Leu His Glu Phe Leu Pro Glu690 695 700Gly Asn Ile Glu Asp Ile Val Ser Glu Leu Cys Ala Glu Thr Gly Ala705 710 715 720Asn Gln Glu Asp Ala Leu Ala Arg Ile Glu Lys Leu Ser Glu Val Asn725 730 735Pro Met Leu Gly Phe Arg Gly Cys Arg Leu Gly Ile Ser Tyr Pro Glu740 745 750Leu Thr Glu Met Gln Ala Arg Ala Ile Phe Glu Ala Ala Ile Ala Met755 760 765Thr Asn Gln Gly Val Gln Val Phe Pro Glu Ile Met Val Pro Leu Val770 775 780Gly Thr Pro Gln Glu Leu Gly His Gln Val Thr Leu Ile Arg Gln Val785 790 795 800Ala Glu Lys Val Phe Ala Asn Val Gly Lys Thr Ile Gly Tyr Lys Val805 810 815Gly Thr Met Ile Glu Ile Pro Arg Ala Ala Leu Val Ala Asp Glu Ile820 825 830Ala Glu Gln Ala Glu Phe Phe Ser Phe Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln835 840 845Met Thr Phe Gly Tyr Ser Arg Asp Asp Val Gly Lys Phe Ile Pro Val850 855 860Tyr Leu Ala Gln Gly Ile Leu Gln His Asp Pro Phe Glu Val Leu Asp
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65 70 75 80Thr Lys Lys Arg Val Phe Thr Phe Gly Lys Gly Asn Ser Glu Gly Asn85 90 95Lys Asp Met Lys Ser Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu100 105 110Met Ala Ser Ile Gly Leu Ser Val Pro Pro Gly Leu Thr Ile Ser Thr115 120 125Glu Ala Cys Glu Glu Tyr Gln Gln Asn Gly Lys Lys Leu Pro Pro Gly130 135 140Leu Trp Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Gln Tyr Val Gln Lys Glu Met145 150 155 160Ser Ala Ser Leu Gly Asp Pro Ser Lys Ala Leu Leu Leu Ser Val Arg165 170 175Ser Gly Ala Ala Ile Ser Met Pro Gly Met Met Asp Thr Val Leu Asn180 185 190Leu Gly Leu Asn Asp Glu Val Val Asp Gly Leu Ala Ala Lys Ser Gly195 200 205Ala Arg Phe Ala Tyr Asp Ser Tyr Arg Arg Phe Leu Asp Met Phe Gly210 215 220Asn Val Val Met Gly Ile Pro His Ser Leu Phe Asp Glu Lys Leu Glu225 230 235 240Gln Met Lys Ala Glu Lys Gly Ile His Leu Asp Thr Asp Leu Thr Ala245 250 255Ala Asp Leu Lys Asp Leu Ala Glu Gln Tyr Lys Asn Val Tyr Val Glu260 265 270Ala Lys Gly Glu Lys Phe Pro Thr Asp Pro Lys Lys Gln Leu Glu Leu275 280 285Ala Val Asn Ala Val Phe Asp Ser Trp Asp Ser Pro Arg Ala Asn Lys290 295 300
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<223>由与氨基酸取代的PPDK(SEQ ID NO16的7682-8508)的1/6区对应的核苷酸序列组成的DNA<400>19agactatcgg gtacaaagtt ggaacaatga ttgagatccc tcgagcagct ctgatcgctg 60atgaggtagg gaaaactacc aagttcagaa tcgcccagaa ctttgccaac aagtttgttt 120atctgtgcat tcctacgctg gtctgaaatc tgtggctgtt gttgttgttt ttttggtttc 180gtcaacctgg cagatagcga aggaggctga attcttctcc ttcggaacga acgacctgac 240gcagatgacc tttgggtaca gcagggatga tgtgggaaag ttccttccca tctatctttc 300ccagggcatt ctccaacatg accccttcga ggtaactgtt gcaactctgc ctgccaccct 360cgcatgtcgc atctgatgtg acatgagcat ctcatgtcgc gatcgccttt catttggatg 420cccgtacacc taccaggtcc tggaccagaa gggagtgggc cagctgatca agatggctac 480agagaagggc cgcgccgcta accctaactt gaaggttggt tttgggacac tgcttcgtac 540gtctccttag aaaaccacgg tttgattgtt gtttggtttt gtgtgcaaac aggtgggcat 600ttgtggagaa cacggtggag agccttcctc tgtggccttc ttcgacgggg ttgggctgga 660ttacgtttct tgctcccctt tcaggtcggt tcagtcactg ataaactcgt gattgaatcc 720aataagcgta tcctcttatg ttaacggtag caaaatgttc actgttttct ttgaatgctt 780tctgcagggt tccgattgct aggctagctg cagctcaggt ggttgtc
权利要求
1.一种提高C4植物中目的蛋白质表达水平的方法，包括使用表达盒转化C4植物的步骤，该表达盒包括启动子，在上述启动子控制下的编码目的蛋白质的C4植物基因组基因，和终止子。
2.根据权利要求1的方法，其中C4植物基因组基因包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列由编码目的蛋白质的源于基因组基因的核苷酸序列通过在基因的外显子中缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸，并保留基因的内含子的核苷酸序列衍生来的。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述目的蛋白质是一种组成光合作用途径的酶。
4.用表达盒转化的转基因C4植物，其能表达有效量的酶从而增加光合作用率，该表达盒包括启动子，在上述启动子控制下的编码组成光合作用途径酶的C4植物基因组基因，和终止子。
5.根据权利要求4的转基因C4植物，其中编码组成光合作用途径酶的C4植物基因组基因包括在外显子中被取代一个或多个核苷酸的核苷酸序列，通过这种方式该基因编码的组成光合作用途径酶的氨基酸序列等价于耐低温植物中相应光合作用的酶的氨基酸序列。
6.根据权利要求5的转基因C4植物，其中编码组成光合作用途径的酶的C4植物的基因组基因编码丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)。
7.根据权利要求6的转基因C4植物，其中PPDK是玉米PPDK，并且所述C4植物是玉米。
8.根据权利要求7的转基因C4植物，其中取代发生在第15外显子中或其下游。
9.根据权利要求4的转基因C4植物，其中编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因由选自下述的任何DNA组成(a)DNA分子，由SEQ ID NO15的Nos.1732-8508的核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由源自SEQ ID NO15的Nos.1732-8508经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下与由SEQ ID NO15的Nos.1732-8508的核苷酸序列组成的DNA分子互补之DNA分子杂交，并编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO15的Nos.1732-8508的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列组成，并编码具有PPDK活性的蛋白质。
10.根据权利要求4的转基因C4植物，其中编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因编码选自下列任何的蛋白质(a)由SEQ ID NO17的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由源自SEQ ID NO17的经缺失、取代、添加或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并具有PPDK活性的蛋白质；(c)源自C4植物的PPDK；和(d)由与SEQ ID NO17的氨基酸序列具有至少50％的同源性氨基酸序列组成，并具有PPDK活性的蛋白质。
11.一种表达盒，包括启动子，在上述启动子控制下的编码组成光合作用途径酶的C4植物基因组基因，和终止子；包括选自下列的任何DNA(a)DNA分子，由SEQ ID NO15的核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由源自SEQ ID NO15的经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它与SEQ ID NO15的核苷酸序列组成的DNA分子互补之DNA分子在严紧条件下杂交，并编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO15的核苷酸序列具有至少50％同源性核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质。
12.根据权利要求5的转基因C4植物，其中编码组成光合作用途径酶的C4植物基因组基因由选自下列的任何DNA构成(a)DNA分子，由SEQ ID NO16的Nos.1732-8508的核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由源于SEQ ID NO16的Nos.1732-8508经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下与SEQ ID NO16的Nos.1732-8508的核苷酸序列组成的DNA分子互补之DNA分子杂交，并编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO16的Nos.1732-8508位的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列组成，并编码具有PPDK活性的蛋白质。
13.根据权利要求5的转基因C4植物，其中编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因由选自下述任何的DNA构成(a)DNA分子，由SEQ ID NO19的核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由源于SEQ ID NO19经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并编码具有提高C4植物中PPDK表达水平活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下与由SEQ ID NO19的核苷酸序列组成的DNA分子之互补DNA分子杂交，并编码具有提高C4植物中PPDK表达水平活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO19的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列组成，并编码具有提高C4植物中PPDK表达水平活性的蛋白质。
14.根据权利要求5的转基因C4植物，其中编码组成光合作用途径的酶的C4植物基因组基因编码选自下列的任何蛋白质(a)由SEQ ID NO18的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由源于SEQ ID NO18的氨基酸序列经缺失、取代、添加或插入一个或多个氨基酸序列组成的蛋白质，并具有PPDK活性；(c)源自耐低温的C4植物的PPDK或源自耐低温的C3/C4中间型植物的PPDK，优选是Flaveria brownii；以及(d)由与SEQ ID NO18的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列组成的蛋白质，并具有PPDK活性。
15.一种表达盒，包括启动子，在上述启动子控制下的编码组成光合作用途径的酶的C4植物的基因组基因，和终止子；包括选自下列任何DNA(a)DNA分子，由SEQ ID NO16的核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由源自SEQ ID NO16的核苷酸序列经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下与由SEQ ID NO16的核苷酸序列组成的DNA分子之互补的DNA分子杂交，并编码具有PPDK活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由与SEQ ID NO16的核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列组成，并且编码具有PPDK活性的蛋白质。
16.一种表达盒，包括启动子，在上述启动子控制下的C4植物的基因组基因，和终止子，其中C4植物的基因组基因由选自下列任何的DNA构成(a)DNA分子，由对应于PPDK C-末端1/6区域的SEQ ID NO16的部分核苷酸序列组成；(b)DNA分子，由源自对应于PPDK C-末端1/6区域的SEQ ID NO16的部分核苷酸序列经缺失、取代、添加或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并编码具有提高C4植物中PPDK表达水平活性的蛋白质；(c)DNA分子，它在严紧条件下与对应于PPDK的C-末端1/6区域的SEQ ID NO16部分核苷酸序列组成的DNA分子互补之DNA分子杂交，并编码具有提高C4植物中PPDK表达水平活性的蛋白质；以及(d)DNA分子，由来自对应于PPDK的C-末端1/6区域的SEQ ID NO16部分核苷酸序列具有至少50％同源性的核苷酸序列组成，并编码具有提高C4植物中PPDK表达水平活性的蛋白质。
17.根据权利要求11、15或16的表达盒，用于促进在低温条件下C4植物中的光合作用率。
18.根据权利要求11、15或16的表达盒，其中PPDK的活性是耐低温的PPDK活性。
19.包含权利要求11、15、16、17或18所述表达盒的重组载体。
全文摘要
本发明涉及C4植物的转化方法。它还涉及外源基因在C4植物中过表达的方法。更具体地，本发明涉及到在低温条件下仍保持良好光合作用能力的C4植物的制备，其是通过组成C4光合作用途径酶的高水平表达而实现。在本发明中，使用了一种表达盒，它包括启动子、在上述启动子控制下的编码组成光合作用途径酶的C4植物基因组基因和终止子。编码组成光合作用途径酶的C4植物基因组基因优选地是C4植物基因组来源的PPDK基因或其经过修饰的形式。本发明在提高具有PPDK的C4植物产量(特别是在低温条件下对玉米产量的提高)上特别有用。
文档编号C12N15/29GK1608132SQ02825970
公开日2005年4月20日 申请日期2002年10月23日 优先权日2001年10月23日
发明者宇佐美悟, 太田象三, 石田佑二 申请人:日本烟草产业株式会社, 欣根塔有限公司