专利名称：生物活性粒细胞集落刺激因子的纯化和/或分离方法
技术领域：
本发明涉及一种通过使用固定化金属色谱亲合法(IMAC)纯化和/或分离生物活性的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的新方法。
G-CSF属于调节造血母体细胞的分化和增生以及嗜中性白细胞的活化的集落刺激因子族。G-CSF被用于血液学和肿瘤学领域的药物中。在临床上可以获得两种类型的G-CSF通过使用在哺乳动物细胞中的表达而被制造的糖基化形式(来格司亭)和通过使用在细菌——大肠杆菌(E.coli)中的表达而被制造的非糖基化形式(非格司亭)。
背景技术：
在EP 237545中对非糖基化形式的G-CSF(非格司亭)及其制备进行了描述，在EP 169566中对糖基化形式的G-CSF(来格司亭)及其制备进行了描述。
从该专利和科学文献中可以得知的G-CSF纯化和/或分离法包括离子色谱法、色谱聚焦、疏水作用色谱法、凝胶过滤法以及一些其它方法的不同组合。
一般而言，G-CSF纯化和/或分离法的第一步取决于G-CSF异种表达的主体生物。在其在大肠杆菌中进行表达的情况中，在不溶性包涵体中发现了G-CSF。因此，常规的方法包括从导致恰当折叠的生物活性形式的包涵体将G-CSF分离的另外的步骤。这些步骤通常包括用去污剂或离液物质进行洗涤、用强变性剂(例如盐酸胍(GndHCl)、脲)或者用高浓度的去污剂(例如N-月桂酰基-肌氨酸(十二烷基肌氨酸钠)或十二烷基硫酸钠(SDS))溶解、用凝胶过滤法、反相HPLC(RP-HPLC)对被溶解的变性蛋白进行部分纯化和通过使用稀变性剂或通过使用渗析来进行复性。在G-CSF在酵母菌或哺乳动物细胞中表达的情况中，很少发现包涵体或类似结构，并且在这些情况中在G-CSF分泌后直接开始纯化和/或分离过程。在下面的专利申请和专利中对用于对G-CSF进行分离和纯化的方法进行了描述EP 169566、EP 237545、EP 215126、EP 243153、US 5055555和WO 0104154。还在科学文献中对G-CSF的纯化和/或分离方法进行了描述Lu，H.S.等人，Protein Expr Purif 4，465-472(1993)；Kang，S.H.等人，Biotechnol.Lett.17，687-692(1995)；Wingfield，P等人，Biochem J 256，213-218(1988)；Kang，S.H.等人v Biotechnol.Lett.17，687-692(1995)；Yamasaki，M.等人，Biosci Biotechnol Biochem 62，1528-1534(1998)；Wingfield，P.等人，Biochem J 256，213-218(1988)；Bae，C.S.等人，Biotechnol.Bioeng.57，600-609(1998)。
在一些其它蛋白的情况中，还已经用IMAC来进行部分纯化和复性。Porath等人在Nature 258，598-599(1975)中第一次对IMAC进行了描述并且其是以蛋白与被螯合于各种IMAC支撑物的固定化金属离子的结合为基础的。该蛋白氨基酸序列中的电子供体负责与该支撑物协调结合，尤其是组氨酸残基中的咪唑环。Hochuli，E.等人在Bio/Technology1321-1325(1988)中，Chaga，G.等人在Biotechnol Appl Biochem 29(第1部分)，19-24(1999)中和Jeong，J.K.和Lee S.Y.在Protein Expr.Purif，23311-318(2001)中对通过使用IMAC来进行在蛋白的N-或C-末端上具有工程组氨酸亲合附属物的重组蛋白的分离进行了描述。Sulkowski在Trends Biotechnol 3，1-7(1985)中和Hemdan等人在ProcNatl Acad Sci USA 86，1811-1815(1989)中对用IMAC对蛋白分子中微小的局部差异进行研究的应用进行了描述。
在US 5932102中对用IMAC对包含组氨酸残基的一些其它蛋白进行纯化的方法进行了描述。
在WO 9012803中对具有能与金属离子结合的表面氨基酸的蛋白的纯化方法进行了描述。在这种方法中，在用几种其它的色谱法进行部分蛋白纯化后，用IMAC作为另外的步骤。描述了在自然条件下使用IMAC不能将未变性的或生物学活性的G-CSF分子与变性或无生物学活性的G-CSF分离或隔离开。
对通过与特异性的染料-金属离子复合体的亲合分配而进行相互作用的G-CSF——其Ser-17和(His)6-标记形式——的比较研究进行了描述(Zaveckas，M.等人，J Chromatogr A 904，145-169(2000)。以对菠萝蛋白酶和纯G-CSF在无金属和带有Hg(II)的IDA(亚氨酸二醋酸盐)柱上的色谱行为的评估为基础，Gelunaite，L.等人在J Chromatogr A904，131-143(2000)中试图对荷-Hg(II)的IMAC(琼脂糖IDA)在变性条件下从去污剂-溶解的包涵体中提取G-CSF的能力进行评估。
还用带有固定化Zn(II)或Ni(II)离子的IMAC作为GndHCl变性的白介素-3、G-CSF和粒细胞巨噬细胞集落因子(GM-CSF)复性的方法(Rozenaite，V.等人，Poster abstract，P-104.，Cordoba，Spain，19-22.April(1998))。变性的蛋白在变性的条件下被结合于IMAC支撑物上。
本发明的概述本发明的目的是改善G-CSF的纯化和/或分离，并提供高纯度的和活性形式的生物学活性G-CSF、以及包含其的药物组合物。
本发明提供了如权利要求1所述的生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法。本发明还提供了一种如权利要求27所述的生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法、如权利要求31所述的生物学活性的G-CSF、如权利要求33所述的药物组合物以及如权利要求35所述的生物学活性G-CSF的应用。在从属权利要求中对优选的实施方案进行了陈述。
根据本发明令人吃惊地发现用IMAC在天然条件下可以将恰当折叠和生物学活性的G-CSF分子与不恰当折叠或无生物学活性的G-CSF分子分离开。本发明生物学活性G-CSF的纯化和/或分离方法包括通过在自然条件下使用IMAC而将恰当折叠和生物学活性的G-CSF分子与不恰当折叠或无生物学活性的G-CSF分子分离开并还将其与大多数宿主蛋白分开。通过这种方法，恰当折叠和生物学活性的G-CSF分子与IMAC支撑物特异结合，而不恰当折叠的无生物学活性的G-CSF形式和大多数杂质仍然留在洗脱液中。本发明纯化和/或分离的方法还包括将生物学活性的单体G-CSF与基本留在洗脱液中的低聚的、聚合的和无生物学活性的单体G-CSF分开。生物学活性的G-CSF的单体形式特定地与IMAC支撑物结合，而低聚、多聚和无生物学活性的G-CSF的单体形式基本留在洗脱液中。
本发明的方法代表了恰当折叠的生物学活性的单体形式或G-CSF分子纯化和浓缩的有效步骤，并且可以用其作为整个G-CSF纯化和/或分离方法中的关键步骤。
本发明纯化和/或分离的方法可用于其中在表达后G-CSF通过分泌途径直接分泌到介质中的情况，或其中G-CSF在细胞质、周质或任何其它细胞细胞器中以包涵体的形式被形成的情况。其还可用于生物学活性的G-CSF直接从被溶解的包涵体纯化和/或分离以及其中之前已经对G-CSF变性然后使其复性的所有情况。本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法可以在整个过程中都被维持在天然条件下。
本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法使得可以制备纯度高于95％的生物学活性的G-CSF。仅仅可以进一步用两个另外的色谱步骤——阳离子交换色谱法和凝胶过滤(它们用在本发明的优选实施方案中)来除去剩余杂质中的痕量物质(精炼)。
因此，本发明的整个方法使得可以制备纯度高于99％的生物学活性的G-CSF。该方法适用于制备大量生物学活性的G-CSF并适用于生物学活性的G-CSF的工业生产。
在科学或专利文献中都没有发现在天然条件下用IMAC将生物学活性的恰当折叠的单体的G-CSF分子与寡聚的、聚合的或无生物学活性的单体形式或不恰当折叠的G-CSF分子分离开的说明。
在现有技术中也没有通过恰当折叠的生物学活性的单体G-CSF(即在溶液或混合物中早已发现的这些分子)在自然条件下与IMAC支撑物相结合而将生物学活性的G-CSF从包含生物学活性的G-CSF分子和杂质的粗溶液或混合物分离开的描述。此外，也一直没有通过使用IMAC而将G-CSF分子根据其构象进行分离的描述。
在现有技术中找到的用于G-CSF的纯化和/或分离的所有方法都包括几个步骤。在现有技术中一直没有描述对于根据其生物学活性和恰当的折叠而进行的G-CSF的分离以及对于其与存在于溶液或混合物中的杂质的分离以及作为G-CSF浓缩和纯度高于95％的生物学活性的G-CSF的制备的有效方法而言可以仅使用一个色谱步骤，从而仅必需进行另外的精炼。
本发明及其优选实施方案的详细说明本发明涉及IMAC在生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法中作为有效的色谱法的应用。该恰当折叠的生物学活性的G-CSF单体形式或分子在自然条件下选择性地结合于一种IMAC支撑物，而不恰当折叠的或聚集的G-CSF分子以及大多数其它杂质，特别是在由例如大肠杆菌表达后得自包涵体的被溶解的蛋白基本不与这些支撑物相结合，并且被不保留地洗脱下来。其应该是由于天然组氨酸残基的特异性分布而产生了这种特性。
这里所用的术语‘天然条件’指的是分子(G-CSF蛋白)保留自然构象和生物学活性的条件。
术语‘变性条件’指的是不保留G-CSF的天然构象、改变和不保留生物学活性的条件。
这里所用的术语‘聚集的分子’指的是通过疏水性或还有一些其它相互作用(例如二硫化物键)而被聚集在一起形成分子簇的分子。这些分子是没有生物学活性的。
这里所用的术语‘洗脱’指的是将被吸附的物质从色谱柱洗涤或提取下来。
这里所用的术语‘洗脱液’指的是通过对色谱柱进行洗涤和提取而获得的溶液。
这里所用的术语‘包涵体’指的是不溶性的不恰当折叠或部分恰当折叠的蛋白的致密的聚集体。
这里所用的术语‘包涵体溶液’指的是包含包涵体的溶液。
这里所用的术语‘生物学活性的G-CSF’指的是能促进造血母细胞的分化和增生以及造血系统成熟细胞的活化的G-CSF形式或分子。
这里所用的术语‘G-CSF的生物学活性形式(或分子)’指的是为单体和未变性状态并且能提供上述生物学活性的G-CSF形式或分子。
这里所用的术语‘杂质’指的是与该G-CSF的生物活性分子不同从而使得该G-CSF的生物活性分子不纯的物质。所说的杂质可包括至少一种得自G-CSF的无生物学活性的单体形式和不恰当折叠的分子、G-CSF的寡聚和聚合形式、G-CSF的变性形式和宿主细胞蛋白的物质组成的组。所说的杂质还可进一步包括宿主细胞物质如DNAs、(脂)多糖等等、以及在G-CSF的制造和处理中所使用的添加剂。
这里所指出的纯度指的是HPLC纯度。
本发明用于生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离的方法特别是被定义为包含下面的步骤a)将包含G-CSF的生物学活性形式和杂质的溶液或混合物装填到IMAC支撑物上；b)G-CSF的生物学活性形式与该IMAC支撑物选择性结合，对该IMAC柱进行洗涤或不进行洗涤；和c)将该G-CSF的生物学活性形式从该柱上洗脱下来本发明的方法可以有利地在自然条件下进行。
本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离还可另外包括生物学活性的G-CSF的进一步纯化并且优选地包含在用IMAC对该生物活性的G-CSF进行纯化和/或分离后进行的下面的步骤d)阳离子交换色谱法和/或e)凝胶过滤。
本发明的全部方法使得可以制备适于医学临床应用的生物学活性的G-CSF。
通过应用其中在自然条件下将包含G-CSF的不纯的混合物用仅由IMAC和任选的至少一种选自离子交换和凝胶过滤技术的方法所组成的色谱步骤进行处理而进行纯化和/或分离处理的方式已经以有效且优选的方式获得了适用于医学临床应用的生物学活性的G-CSF。本发明的方法还可以用于对G-CSF衍生物如甲二磺酰基G-CSF(Met-G-CSF)、糖基化、酶或化学改性的(例如pegylated)G-CSF、G-CSF类似物和包含G-CSF的融合蛋白进行纯化和/或分离的情况。
本发明的纯化和/或分离方法的显著优点包括1.根据其构象状态并从而根据其生物学活性将G-CSF的分子分离开。
2.该方法使得G-CSF的生物学活性的分子可以在自然条件下结合到IMAC支撑物上并使得可以在自然条件下连续地进行G-CSF的生物学活性的分子与G-CSF的无生物学活性的分子的分离，3.该方法使得恰当折叠的G-CSF分子可以在自然条件下结合到IMAC支撑物上并使得可以在自然条件下连续地进行恰当折叠的G-CSF分子与不恰当折叠的G-CSF分子的分离，4.该方法使得生物学活性的G-CSF的单体形式可以在自然条件下结合到IMAC支撑物上并使得可以在连续地完成生物学活性的G-CSF的单体形式与无生物学活性的G-CSF的单体形式的分离，5.该方法使得G-CSF的单体形式可以结合到IMAC支撑物上并使得可以在自然条件下连续地进行G-CSF的单体形式与G-CSF的寡-和多-聚形式的G-CSF的分离，6.该方法使得可以在自然条件下进行恰当折叠的生物学活性的单体G-CSF分子与存在于溶液、混合物或介质中的其它蛋白和杂质的分离，7.对于本发明的方法而言，其可显著增加被纯化的G-CSF的特异活性，例如将其活性增加至至少1×107IU/mg的特异活性范围，更优选地将其增加至7-8×107IU/mg的特异活性范围，最优选地将其增至约1×108IU/mg的特异活性范围，其中所说的特异活性是通过如实施例5所述的以细胞增生的刺激为基础的方法来进行测量的。
8.对于本发明的方法而言，其可以以高收率来制备具有至少95％的纯度G-CSF，或者，当进一步包括用根据优选实施方案的阳离子交换色谱法和凝胶过滤法进行的纯化时，其纯度为至少99％，因此，该方法适用于生物学活性的G-CSF的工业生产，9.包含用阳离子交换色谱法和凝胶过滤法进行的进一步的纯化的对生物活性的G-CSF进行纯化和/或分离的优选实施方案的整个过程不需要任何另外的G-CSF纯化步骤并且可以有利地被一直维持在自然条件下。
本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离的全过程最优选地被维持在自然条件下。
本发明的方法并不是不恰当折叠的G-CSF分子的复性方法，而是一种包含已经存在于包含未被纯化的G-CSF的溶液、混合物或介质中的未变性的或恰当折叠的生物学活性的G-CSF单体分子与IMAC支撑物特异结合的方法。
G-CSF的单体形式与寡-和多聚形式的分离以一种使得生物学活性的单体G-CSF结合到IMAC支撑物上，而寡-和多聚形式基本留在洗脱液中的方式发生，其中所述的寡-和多聚形式也可以以聚集形式存在。
可以用凝胶过滤法代替IMAC来进行单体形式的G-CSF与寡-和多聚形式的G-CSF的分离。IMAC比凝胶过滤法优越之处在于其浓缩能力、较高的结合能力和将恰当折叠的单体形式的G-CSF与不恰当折叠的单体形式的G-CSF分离的能力。凝胶过滤不能将恰当折叠的单体形式的G-CSF与不恰当折叠的单体形式的G-CSF分开。因此，通过使用IMAC可以获得更好的收率。
本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离另一个优于现有技术中其它已知方法的优点是使得可以进行(整个过程被维持在自然条件下的)恰当折叠的G-CSF分子与不同蛋白的混合物的分离以及与以不同构象状态存在的G-CSF分子混合物的分离。因此，可以在自然条件下将G-CSF直接从(优选地被稀释的)培养介质或特别是从包涵体中分离出来。
本发明的方法优于常规方法的另外的优点还有可降低去污剂的使用或可以不使用去污剂、可以在没有有毒或者对环境不利的变性剂(例如GndHCl或脲)的情况下进行、以及可以降低或省略缓冲剂和其它溶液的使用。
本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法优于使用强变性剂的方法的优点在于不需要使用活性还原剂如二硫苏糖醇或β-巯基乙醇。
在G-CSF直接分泌到介质的情况中，本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离的方法使得可以从被稀释的基质中有效和直接浓缩生物学活性的G-CSF。在得自IMAC柱的洗脱液中获得了高纯度的生物学活性的G-CSF。
因为通过将生物学活性的G-CSF分子从包涵体中分离出来和/或通过将生物学活性的G-CSF分子直接从包含其的溶液或混合物中分离出来可以获得生物学活性的G-CSF分子与无生物学活性的G-CSF分子和其它杂质的有效分离，所以当与其它方法相比时，G-CSF的纯化和/或分离的经济性得到了更大的改善。
因此，通过仅使用一个纯化步骤而可以获得95％以上的G-CSF纯度。
下面的色谱步骤特别适用于从IMAC洗脱下来后生物学活性的G-CSF的最后纯化(精炼)。
.阳离子交换色谱法和/或.凝胶过滤法阳离子交换色谱法对于除去得自宿主细胞的痕量的核酸、脂多糖和蛋白、以及除去G-CSF的离子异构体和被改变的(被损害的)具有改变的pI值的G-CSF形式而言尤其有效。凝胶过滤色谱法对于除去痕量的二聚物和G-CSF的高聚集形式而言尤其有效。
仅使用另外两个最后的纯化步骤产生纯度高于99％的生物学活性的G-CSF。
根据本发明优选的实施方案还包括阳离子交换色谱法和凝胶过滤法的本发明生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离的整个过程的优点有除适宜的预处理步骤如溶解和可进行或不进行的随后通过渗析、离子交换、超滤、渗滤或稀释等等来除去增溶剂外，该方法可以高效地仅包含上面所指定的三种色谱步骤；在这三种色谱步骤两者之间优选地没有中间步骤(如浓缩、渗析、沉淀等等)，并且该纯化和/或分离过程一直优选地被维持在自然条件下。
中间的浓缩步骤将不利地造成二聚物和其它聚集体形式的形成，从而降低了收率。可以将纯化和/或分离的整个方法转化成工业规模和用来制造纯度为至少99％的生物学活性的G-CSF。
通过本发明整个纯化和/或分离过程而获得的生物学活性的G-CSF适于制备包含治疗有效量的生物学活性的G-CSF并适于临床应用的药物组合物。
在短期的纯化和分离过程中可以维持G-CSF的活性形式不仅有助于改善收率，而且还有助于改善该生物学活性的G-CSF以及包含其的药物组合物的纯度和效力。
这里所用的术语‘治疗有效量’指的是具有生物学活性的G-CSF的治疗作用的生物学活性的G-CSF的数量。
适宜的可药用的辅助物质包括在G-CSF治疗中有用的适宜的稀释剂、助剂和/或载体。
通过本发明的方法获得的，特别是当进行另外的阳离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法时所获得的生物学活性的G-CSF可用于制备表明适用于下面的适应症的药物嗜中性白细胞减少症和与嗜中性白细胞减少症相关的临床后遗症、化疗后发热性嗜中性白细胞减少症的住院的减少、作为供体白细胞输入的供替代选择的造血母细胞的调动、慢性嗜中性白细胞减少症、中性白细胞减少症和非中性白细胞减少症性感染、移植受体、慢性炎性情况、脓毒症和脓毒性休克、中性白细胞减少症和非-中性白细胞减少症的感染的风险(rist)、发病率、死亡率、住院天数的减少、中性白细胞减少症和非中性白细胞减少症患者的感染和与感染相关的并发症的预防、非医院源性感染的预防和降低非医院源性感染的死亡率和感染频率、新生儿的肠内给药、增强新生儿的免疫系统、改善重症监护病房患者和病危患者的临床结果、伤口/皮肤渍疡/烧伤愈合和治疗、化疗和/或放疗的强化、各类血细胞减少、抗炎性citokines的增加、通过预防性使用非格司停而缩短高剂量化疗的间隔、光动力学疗法抗肿瘤作用的增强、由不同脑机能异常所造成的疾病的预防和治疗、栓塞性疾病及其并发症的治疗和辐射后红细胞生成的恢复。
其还可以用于治疗需要G-CSF的所有其它疾病。
因此可以将包含用本发明的方法所获得的纯的生物学活性的G-CSF的药物组合物以本领域技术人员公知的方式以可有效治疗上述疾病的治疗量给药于患者。
将在下面对用于进行本发明方法的IMAC的优选实施方案进行描述。
该方法通过将样品进行填充和将至少G-CSF蛋白的生物学活性形式结合到IMAC支撑物上而开始。
所说的IMAC支撑物包括一种固相材料和结合于该固相材料的金属离子螯合物。可以适宜地使用常规的固相材料，如琼脂糖、Fractogel和其它凝胶支撑物质。结合于该IMAC支撑物的金属离子螯合物适宜地选自优选地具有两个化合价的金属离子，尤其是过渡金属离子。由于其毒性和从该IMAC柱被萃取出来的倾向，较不适于采用Hg。结合于该IMAC支撑物的金属离子螯合物的优选实例包括M(II)-亚氨酸二醋酸盐(IDA)、M(II)-氨三乙酸(NTA)、M(II)-羧甲基天冬氨酸盐等等，其中M代表Zn、Cu、Co、Ni等等。特别有效的是Zn(II)-IDA、Ni(II)-IDA和Ni(I1)-NTA。
在被装填到IMAC柱上以前，该包涵体优选地是以溶液的形式被提供的，或者在分批或膨胀床分离模式中，在存在低去污剂或增溶剂浓缩物的情况下优选地是以混悬液的形式被提供的。因此，当去污剂留在溶液或混悬液中或当用离子交换、渗析、沉淀等等除去去污剂时该G-CSF可以被保持在自然条件下。优选地在将该溶液或混合物装填到IMAC柱上之前除去去污剂或增溶剂。
如果被装填的样品之前已经被复性，例如通过稀释、渗析、超滤或除去变性剂/去污剂来被复性，则还可以用存在强变性剂如8M脲或6MGndHCl的包涵体溶液或混悬液(或混合物)和存在变性浓度的去污剂(例如1％十二烷基肌氨酸钠、2％十二烷基肌氨酸钠或1％十二烷基硫酸钠)的溶液作为起始样品。
在分泌系统如酵母菌、真菌或哺乳动物细胞系中进行表达的情况中，可以将pH为6.5至9.0范围的预先进行了处理的混合物的上清液或进行了浓缩的上清液或培养介质装填到该IMAC支撑物上。
还可以用得自由IMAC柱进行的第一次洗脱的洗脱液作为用于IMAC的装填溶液或混合物。应通过例如加入NaOH溶液或高pH的缓冲溶液将该洗脱液的pH调节至6.5至9.0。然后可以将洗脱液重新装填到相同的IMAC支撑物如例如Zn(II)-IDA、Ni(II)-IDA、Ni(II)-NTA上或不同的IMAC支撑物上。还可以与其它固定化金属离子相组合(例如Zn(1I)、Cu(II)、Co(II)、Ni(II)等等)，使之能更好的分离和除去特定的宿主蛋白。
不考虑装填溶液的制备和起源，装填溶液的pH应当为6.5至9.0。装填溶液的pH优选地为7.0至8.5，最优选地为7.8至8.2。
可以将可将pH维持在6.5至9.0的各种缓冲剂用于装填和G-CSF与IMAC支撑物的结合。适宜缓冲剂有可以提供6.5至9.0的pH的磷酸盐、醋酸盐、羟甲基氨基甲烷(Tris)/HCl、Tris/醋酸盐、枸橼酸盐和其它缓冲剂。优选地，使用Tris/HCl。
缓冲剂，尤其是Tris/HCl缓冲剂的应用浓度优选地为5至50mM，最优选地为10至40mM。
在与该支撑物结合后，通过对该柱进行洗涤和将蛋白从柱上洗脱下来来继续进行该方法。可以用pH递减的不连续梯度或线性梯度或高pH下的竞争洗脱(例如用咪唑、组氨酸、氯化铵以及类似物)来进行洗脱。
这里所用的术语‘线性梯度’指的是用其组成以一种缓冲剂(或该缓冲剂的一种组分)的比例线性增加，而其它缓冲剂(或该缓冲剂的其它成组分)的比例线性降低的方式进行变化的溶液对色谱柱进行洗脱。
这里所用的术语‘不连续梯度’指的是用由一定比例的一种缓冲剂(或该缓冲剂的一种组分)和一定比例的另一种缓冲剂(或该缓冲剂的其它组分)所组成的溶液对色谱柱洗涤所确定的时间。两种缓冲剂的比例都快速(突然)改变并且用其对色谱柱洗涤另一个所确定的时间。溶液的组成(缓冲剂比例或组分比例的变化)并不是线性改变的。
这里所用的术语‘竞争洗脱’指的是在结合缓冲剂的pH下其中洗脱缓冲剂中的竞争剂分子如咪唑、组氨酸、氯化铵等等本身结合到螯合了金属的基质上从而替换了蛋白分子的洗脱。
优选地，使用可以在低pH下进行洗脱的不连续梯度。即，高pH可能会造成半胱氨酸残基的活化和二聚物的形成。在低pH下G-CSF的稳定性也高。
可以用一些洗脱剂来进行不连续或线性洗涤和洗脱，这些缓冲剂可选自醋酸盐、Tris/醋酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐和其它适宜的缓冲剂。洗脱的pH范围可以为3.0至5.0，优选地为3.5至4.5。在进行不连续洗脱时，其pH迅速从装填时的pH次序改变成洗脱pH的次序，如从7.0至4.0，从而跳过了等电点，避免了蛋白的沉淀。即，等电点的pH环境可造成其沉淀。
在洗脱液中，获得了纯度高于95％的生物学活性的恰当折叠的单体G-CSF。
如果需要的话，可以将得自IMAC柱的洗脱液不需要进行任何另外的中间步骤地直接装填到阳离子交换色谱柱上。可以使用各种阳离子交换色谱支撑物，其可以选自SP琼脂糖FF、SP琼脂糖HP、CM琼脂糖FF、TSK凝胶SP-5PW、TSK凝胶SP-5PW-HR、Toyopearl SP-650M、Toyopearl SP-650S、Toyopearl SP-650C、Toyopearl CM-650M、Toyopearl CM-650S、Macro-Prep High S支撑物、Macro-Prep S支撑物、Macro-Prep CM支撑物等等。优选地使用SP琼脂糖FF或TSK凝胶SP-5PW。
用于阳离子交换色谱法的装填溶液的pH范围为3.0至5.8，优选地为4.0至5.0。
用于阳离子交换色谱法的装填溶液中的盐浓度必需足够低以确保可以进行对溶液的pH也有依赖性的结合。
可以用pH为3.0至5.8的各种缓冲剂来进行装填和与阳离子交换色谱法的支撑物相结合，其可以选自醋酸盐、枸橼酸盐、Tris/HCl、Tris/醋酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、2-(N-吗啉乙基磺酸盐)(MES)和其它缓冲剂。优选地使用醋酸盐。
醋酸盐缓冲剂的应用浓度可以为10至60mM，优选地为10至30mM。
在阳离子交换色谱法中，在柱装填后对柱进行清洗并将蛋白从柱上洗脱下来。在缓冲溶液中加入高浓度的盐后由于离子强度增加而发生洗脱。可以使用不连续梯度、线性梯度以及不连续和线性梯度的适宜组合。
可用于洗涤和洗脱的洗脱缓冲剂可以选自醋酸盐、枸橼酸盐、Tris/HCl、Tris/醋酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、丙二酸盐、MES和具有添加的盐如NaCl或KCl的其它适宜缓冲剂。可以获得洗脱效果的离子强度和盐的浓度取决于缓冲溶液的pH。缓冲剂的pH越高，将蛋白从柱上洗脱下来所需的离子强度就越低。
在该洗脱液中，得到纯度高于98％的生物学活性的恰当折叠的单体形式的G-CSF。
如果需要的话，可以将得自IMAC的洗脱液或优选地在连续的阳离子交换色谱柱后所获得的洗脱液不需要进行任何另外的中间步骤地直接装填到凝胶过滤柱上。
可以使用各种凝胶过滤支撑物，其可以选自Sephacryl S-200HR、Sephacryl S-100HR、Superose 12、Superose 6、Superdex 75、TSKgelG-2500PW、TSK gel G-3000 PW、Bio-Gel P-60、Bio-Gel P-100等等。优选地使用Superdex 75。
对于凝胶过滤法而言，装填溶液可以具有广泛的pH范围，因此，可以适宜地直接将得自IMAC或优选得自随后的阳离子交换色谱法的洗脱液作为装填溶液。可以用相同的缓冲剂来进行溶液的装填、蛋白与凝胶过滤支撑物的结合和蛋白的洗脱。可以使用各种洗脱剂，其可以选自可以将pH维持在3.5至8.0的范围内的枸橼酸盐、醋酸盐、Tris、磷酸盐和其它适宜缓冲剂。优选地使用pH为6.0至7.0的枸橼酸盐缓冲剂。
优选地，磷酸盐缓冲剂(用于装填的磷酸盐缓冲剂)的应用浓度可以为2至100mM，优选地为3至10mM。
凝胶过滤缓冲剂中盐的浓度可以为30至100mM，优选地为约50mM。
在该洗脱液中，得到纯度高于99％和生物学活性为1×108IU/mg的生物学活性的恰当折叠的单体形式的G-CSF。
用下面的实施例来对本发明的各实施方案进行解释，并不是要用其以任何方式对本发明进行限制。
图1表示通过使用IMAC支撑物Zn(II)-IDA Chelating Sepharosefast flow(Pharmacia)而进行的蛋白与溶解的包涵体的色谱分离。
该色谱图表明了依赖于时间(分钟)在280nm(A280)(—)下的吸收变化和缓冲剂P3(----)的比例。
峰A-大肠杆菌蛋白和聚集的G-CSF；峰B-单体形式的恰当折叠的生物学活性的G-CSF和痕量的大肠杆菌蛋白。
图2表示在存在起始样品的十二烷基硫酸钠(SDS-PAGE)和用Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow(Pharmacia)进行分离后图1中的色谱峰中所表示的样品的情况下用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行的分析。
图例说明1.分子量标准品(Bio-Rad)和G-CSF(Neupogen)(用箭头标出的)。
2.在进行色谱分离之前的起始样品。
3.图1中峰A的蛋白(聚集的G-CSF和大肠杆菌蛋白)。
4.图1中峰B的蛋白(单体形式的恰当折叠的生物学活性的G-CSF和痕量的大肠杆菌蛋白)。
图3表示用具有IMAC支撑物Zn-IDA Chelating Sepharose FastFlow(Pharmacia)的XK50/20柱进行的色谱分离。
该色谱图表明了随时间(分钟)变化在280nm(A280)(—)下的吸收变化和缓冲剂P6(----)的比例。
峰A-大肠杆菌蛋白和聚集的G-CSF；峰B-单体形式的恰当折叠的生物学活性的G-CSF和痕量的大肠杆菌蛋白。
图4表示用装填有阳离子色谱法支撑物TSK gel SP-5Pw(TosoHaas)的XK16/20柱进行的色谱分离。
该色谱图表明了依赖于时间(分钟)在280nm(A280)(—)下的吸收变化和缓冲剂P8----)的比例。
主峰-单体形式的恰当折叠的生物学活性的G-CSF；小峰-G-CSFisoforms和痕量的大肠杆菌蛋白。
图5用装填有凝胶过滤法支撑物SuperdexTM75制备等级(Pharmacia)的XK26/70柱进行的色谱分离。
色谱图表示随时间(分钟)变化在280(A280)下的吸收变化。
主峰-单体形式的恰当折叠的生物学活性的G-CSF。
实施例实施例1用IMACZn-IDA(Chelating Sepharose fast flow)进行的生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离用Chelating Sepharose fast flow(Pharmacia)支撑物对色谱柱(h＝10cm，d＝10mm)进行装填，在所说的支撑物上结合有Zn2+离子，然后用5倍柱体积的缓冲剂P2以2ml/分钟的恒定流速对该柱进行平衡。将包涵体溶解于缓冲剂P1(0.2％十二烷基肌氨酸钠，40mM Tris/HCl，pH8.0)中并通过使用离子交换器来除去十二烷基肌氨酸钠。将10ml包含生物学活性的G-CSF的装填溶液(17mg总蛋白)以1ml/分钟的恒定流速装填到该柱上。用2ml/分钟的恒定流速用缓冲剂P3的不连续梯度进行分离(图1)。在第一个色谱峰(峰A)中发现了大肠杆菌蛋白和大多数不恰当折叠的和聚集的G-CSF。在100％的缓冲剂P3(0％的缓冲剂P2)的情况在，洗脱下来纯度高于95％的基本纯单体形式的生物学活性的G-CSF(7mg)(图2)。
如下面实施例5所述的那样对得自峰A的样品的生物学活性进行测量，其为约1×106IU/mg蛋白，测得的得自峰B的样品的生物学活性为0.8-1.0×108IU/mg蛋白，而标准品的生物学活性为1×1081U/mg蛋白。用使用起始包涵体溶液的一步IMAC可以分离出纯度高于95％和生物学活性可以与标准品相提并论的单体形式的G-CSF。
实施例2用IMACZn-IDA(Fractogel EMD Chelate)进行的生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离用结合有Zn2+离子的Fractogel EMD Chelate(Merck)支撑物对色谱柱(h＝2cm，d＝10mm)进行装填。用水对该柱进行洗涤并以1ml/分钟的恒定流速用5倍柱体积的缓冲剂P2对其进行平衡。将包涵体溶解于缓冲剂P1中并用离子交换器除去十二烷基肌氨酸钠。将3.3ml总量为4mg的被溶解的包涵体装填到该柱上。用以1ml/分钟的恒定流速进行的缓冲剂P3的不连续梯度(梯度13分钟0％的缓冲剂P3(100％的缓冲剂P2)，12分钟25％的缓冲剂P3(75％的缓冲剂P2)，14分钟100％的缓冲剂P3(0％的缓冲剂P2)，11分钟0％的缓冲剂P3(100％的缓冲剂P2))来进行分离。在100％的缓冲剂P3时洗脱下来单体形式的生物学活性的G-CSF(0.7mg)。
实施例3通过使用IMACNi-NTA(Superflow)进行的生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离用Ni-NTA Superflow(Qiagen)支撑物对色谱柱(h＝10cm，d＝10mm)进行装填并用5倍柱体积的缓冲剂P4以2ml/分钟的恒定流速对其进行平衡。将包涵体溶解于缓冲剂P1中并用离子交换器除去十二烷基肌氨酸钠。以1ml/分钟的恒定流速将10ml被溶解的包涵体(10mg总蛋白)装填到该柱上。以2ml/分钟的恒定流速用缓冲剂P5的不连续梯度(如图1所示的用Zn-IDA Chelating Sepharose fast flow进行分离的相同梯度)进行分离。在100％的缓冲剂P5(0％的缓冲剂P4)时，洗脱下来纯度高于95％的单体形式的生物学活性的G-CSF(3.6mg)。在第一个色谱峰中，除大肠杆菌蛋白外仅发现了不恰当折叠的和聚集的G-CSF。在用Ni-NTA Superflow进行一些色谱分离后，汇集得自第二个峰的单体形式的G-CSF，然后用阳离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法进行最后的纯化(精炼)。
实施例4包括另外的色谱步骤的用于制备生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法这种生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离方法从G-CSF在大肠杆菌中表达之后所获得的包涵体溶液开始，将4.5g进行了洗涤的包涵体重新混悬于225ml缓冲剂P1中，然后在用线性震动器轻轻(轻微)振动的情况下使其在20℃下溶解18小时。在离心15分钟后，用离子交换器除去十二烷基肌氨酸钠。用水将样品稀释至体积加倍，得到～430ml包涵体溶液；其蛋白浓度为～1.4mg/ml(在根据用G-CSF作为标准品的Bradford后)。将该蛋白溶液分成两份相等的体积装填到用ChelatingSepharose fast flow(45-165μm，Pharmacia)支撑物装填至10cm高度的色谱柱XK50/20(Pharmacia)(h＝10cm，d＝5cm，V＝200ml)上，其上结合有Zn2+离子。以7ml/分钟的固定流速来进行样品的装填和洗脱。在装填后，用不连续梯度(图3)对该柱进行洗涤用缓冲剂P2洗涤15分钟，然后用体积比为75∶25的缓冲剂P2和P6的混合物洗涤45分钟，然后用缓冲剂P6洗涤86分钟。在100％的缓冲剂P6时洗脱下来的是单体形式的生物学活性的G-CSF。将包含单体形式的生物学活性的G-CSF的所有级分(两套分离系统的)合并，得到271ml蛋白浓度为～0.7mg/ml的溶液。向这种溶液中加入EDTA至终浓度为2mM。用20mM pH4.0的CH3COOH将该溶液稀释三倍，然后将其用作用于阳离子交换色谱法的装填溶液。
将该IMAC洗脱液分成两等份地装填到用色谱支撑物SP-5PW(30μm；TosoHaas)装填至16cm高度(h＝16cm，d＝1.6cm，V＝32ml)的色谱柱XK16/20(Pharmacia)上。样品的装填和从色谱柱上的洗脱都是在5ml/分钟的恒定流速下进行的。在将样品装填后，用缓冲剂P7将该柱洗涤11分钟，然后用缓冲剂P8以0％至25％缓冲剂P8(100％至75％缓冲剂P7)的线性梯度洗脱30分钟。再用体积比为75∶25的缓冲剂P7和P8的混合物对该柱洗涤16分钟，然后用缓冲剂P8将其洗涤22分钟(图4)。将在～18％缓冲剂P8的线性梯度的线性部分中被洗脱下来的并属于恰当折叠的G-CSF(其纯度高于98％)的主要的色谱峰的级分合并，将其直接用作用于凝胶过滤柱的装填溶液。
将得自该阳离子交换色谱法的洗脱液(V＝46ml，蛋白浓度为～2.4mg/ml)分成5等分装填到用凝胶过滤支撑物Superdex 75(制备级，34μm)(Pharmacia)装填至57cm高度的色谱柱XK26/70(Pharmacia)(h＝57cm，d＝2.6cm，V＝300ml)上。以2.5ml/分钟的固定流速用缓冲剂P9来进行分离。表示蛋白二聚物的峰与表示单体蛋白的主峰清楚地分开(图5)。将主要的色谱峰级分合并，改变缓冲剂，得到100mg纯度高于99％和生物学活性为1×108IU/mg的纯单体形式的G-CSF，其中所说的生物学活性相当于标准品的生物学活性。
实施例5G-CSF体外生物学活性测定用公知的方法(Hammerling，U.等人，J Pharm Biomed Anal 13，9-20(1995))通过以细胞增生(NFS-60细胞)的刺激为基础的方法来测定G-CSF的生物学活性，并且使用国际标准人重组G-CSF(88/502，得自酵母菌的细胞；NIBSC Potters Bar，Hertfordshire，UK；见Mire-Sluis，A.R.等人.v J Immunol Methods 179，117-126(1995)。
缓冲剂组成P10.2％十二烷基肌氨酸钠，40mM Tris/HCl，pH8.0P220mM Tris/HCl，150mM NaCl pH8.0P320mM醋酸，150mM NaCl，通过加入1M NaOH将其pH调至4.5P410mM Tris/HCl，200mM NaCl，pH8.0P520mM醋酸，200mM NaCl，通过加入1M NaOH将其pH调至4.0
P620mM CH3COOH，150mM NaCl，pH4.0P720mM CH3COOH，pH5.5P820mM CH3COOH，500mM NaCl，pH5.5P95mM磷酸钠，50mM NaCl，pH7.0
权利要求
1.一种用于生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离的方法，其包括提供一种存在杂质的包含G-CSF的生物学活性形式的混合物，和将所说的混合物用IMAC进行处理。
2.如权利要求1所述的生物学活性的G-CSF的分离方法，其包括下面的步骤·将存在杂质的包含生物学活性的G-CSF的所述混合物装填到IMAC支撑物上，·该G-CSF的生物活性形式与IMAC支撑物选择性结合，和·将G-CSF的生物活性形式从该IMAC支撑物上洗脱下来，从而提供生物学活性的G-CSF。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所说的混合物包含杂质，所说的杂质是无生物学活性的单体形式和不恰当折叠的G-CSF分子、寡聚的和多聚的G-CSF形式、变性的G-CSF形式、宿主细胞蛋白和其它宿主蛋白杂质(组分)组成的组中的至少一种物质；和所说的IMAC是以在生物学活性的G-CSF形式洗脱之前该杂质基本不与该IMAC支撑物结合并且不能从IMAC柱上被洗脱下来的方式来进行的。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所说的生物学活性的G-CSF未被糖基化。
5.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所说的生物学活性的G-CSF被糖基化。
6.如权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所说的生物学活性的G-CSF是至少一种选自甲二磺酰基G-CSF、G-CSF类似物、酶或化学改性的G-CSF形式和包含G-CSF的融合蛋白组的组中的物质。
7.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其中所说的包含G-CSF的混合物选自变性然后又复性后所得的混合物、介质或溶液；自然条件下的包涵体的溶液或混悬液；在分泌系统中表达后得自上清液的混合物或溶液或得自表达系统的培养介质的混合物或溶液；和通过由IMAC柱或任何其它色谱柱的之前的洗脱而获得的洗脱液。
8.如权利要求1或7所述的方法，其中所说的混合物包含自然条件下的包涵体溶液或混悬液。
9.如前面权利要求中任意一项所述的方法，在该方法中进行具有结合于该IMAC支撑物上的被螯合的金属离子的IMAC，其中所说的金属离子不是Hg。
10.如权利要求9所述的方法，其中所说的结合于该IMAC支撑物的被螯合的金属离子选自M(II)-亚氨酸二醋酸盐、M(II)-氨三乙酸和M(II)-羧甲基天冬氨酸盐，其中M选自Zn、Cu、Co和Ni。
11.如权利要求10所述的方法，其中所说的结合于该IMAC支撑物的被螯合的金属离子选自Zn(II)-亚氨酸二醋酸盐、Ni(II)-亚氨酸二醋酸盐和Ni(II)-氨三乙酸。
12.如权利要求10所述的方法，其中所说的IMAC支撑物包含Zn(II)-亚氨酸二醋酸盐。
13.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其中所说的包含G-CSF的生物活性形式的用于IMAC的装填混合物或溶液是pH为6.5至9.0的缓冲溶液。
14.如权利要求13所述的方法，其中所说的装填混合物或溶液具有7.0至8.5的pH，所说的pH优选地为7.8至8.2。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所说的用于制备该包含G-CSF的生物活性形式的被缓冲的装填混合物或溶液的缓冲剂选自醋酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、Tris/HCl和Tris/醋酸盐缓冲剂。
16.如权利要求15所述的方法，其中所说的缓冲剂是Tris/HCl缓冲剂。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所说的缓冲剂的浓度为5至50mM。
18.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其中所说的将G-CSF的生物学活性形式从IMAC支撑物上洗脱下来的步骤是用选自包括pH递减的不连续梯度、线性梯度和在高pH下进行的竞争结合的洗脱方法来进行的。
19.如权利要求18所述的方法，其中所说的将G-CSF的生物学活性形式从该IMAC支撑物上洗脱下来的步骤是通过使用不连续梯度来进行的。
20.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其中用于IMAC的洗脱溶液是pH3.0至5.0的缓冲剂溶液。
21.如权利要求20所述的方法，其中所说的洗脱溶液的pH为3.5至4.5。
22.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其中所说的用于制备IMAC洗脱溶液的缓冲剂选自醋酸盐、Tris/醋酸盐、磷酸盐和枸橼酸盐缓冲剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所说的洗脱缓冲剂是醋酸盐缓冲剂。
24.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其中在进行IMAC后所获的生物学活性的G-CSF具有至少95％的纯度。
25.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其进一步包含阳离子交换色谱法和/或凝胶过滤色谱法的步骤。
26.如权利要求25所述的方法，其中在进行色谱步骤后获得的生物学活性的G-CSF具有至少99％的纯度。
27.一种用于生物学活性的G-CSF的纯化和/或分离的方法，其中在自然条件下将包含G-CSF的不纯混合物进行仅由IMAC和任选地至少一种选自离子交换和凝胶过滤技术的纯化方法所组成的色谱步骤。
28.如权利要求27所述的方法，其中所说的包含G-CSF的混合物基本不含去污剂或增溶剂或以G-CSF在自然条件下存在的浓度包含去污剂或增溶剂。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中在进行色谱步骤后所获得的生物学活性的G-CSF具有至少95％的纯度；优选地具有至少99％的纯度。
30.如前面权利要求中任意一项所述的方法，其中所说的整个方法是在自然条件下进行的。
31.一种纯度高于99％的生物学活性的G-CSF。
32.用如权利要求1至30中任意一项所定义的方法所获得的如权利要求31所述的生物学活性的G-CSF。
33.一种包含治疗有效量的纯度高于99％的生物学活性的G-CSF和可药用的辅助物质的药物组合物。
34.如权利要求33所述的组合物，其中所说的生物学活性的G-CSF是用如权利要求1至30中任意一项所定义的方法所获得的。
35.用如权利要求1至30中任意一项所定义的方法所获得的生物学活性的G-CSF用于制备选自下面适应症的药物的用途嗜中性白细胞减少症和嗜中性白细胞减少症-相关的临床后遗症、化疗后发热性嗜中性白细胞减少症的住院的减少、作为供体白细胞输入的供替代的造血母细胞的调动、慢性嗜中性白细胞减少症、中性白细胞减少症和非-中性白细胞减少症性感染、移植受体、慢性炎性情况、脓毒症和脓毒性休克、中性白细胞减少症和非-中性白细胞减少症的感染的风险、发病率、死亡率、住院天数的减少、中性白细胞减少症和非中性白细胞减少症患者的感染和与感染相关的并发症的预防、非医院源性感染的预防和降低非医院源性感染的死亡率和感染频率、新生儿的肠内给药、增强新生儿的免疫系统、改善重症监护病房患者和病危患者的临床结果、伤口/皮肤溃疡/烧伤愈合和治疗、化疗和/或放疗的强化、各类血细胞减少、抗炎性细胞因子的增加、通过预防性使用非格司停而缩短高剂量化疗的间隔、光动力学疗法抗肿瘤作用的增强、由不同脑机能异常所造成的疾病的预防和治疗、栓塞性疾病及其并发症的治疗和辐射后红细胞生成的恢复。
全文摘要
本发明涉及用于生物学活性的粒细胞集落刺激因子(G－CSF)的分离的方法，其使得可以通过使用固定化金属亲合色谱法将恰当折叠的生物学活性的单体G－CSF分子与不恰当折叠的无生物学活性的单体形式的寡－或多聚G－CSF分离开以及还可以将其与聚集形式的G－CSF分子分开；如果需要的整个过程话，本发明的方法可以有利地在自然条件下进行。从而可以获得纯度高于95％的生物学活性的G－CSF。然后，优选地仅用两个另外的色谱步骤——阳离子交换色谱法和凝胶过滤色谱法来除去痕量的杂质。整个方法可以以更高的收率来制备纯度高于99％的G－CSF。所述的方法特别适用于G－CSF的工业生产。
文档编号C12N15/00GK1606568SQ02825465
公开日2005年4月13日 申请日期2002年12月5日 优先权日2001年12月19日
发明者V·贾伯克伯雷卡, V·米纳特 申请人:Lek制药股份公司