来自棒状细菌的sigA基因的等位基因的制作方法

专利名称：来自棒状细菌的sigA基因的等位基因的制作方法
技术领域：
本发明提供了来自棒状细菌(coryneform bacteria)的编码σ因子A(sigma factor A)的变体的sigA基因的一些等位基因，及使用含有这些等位基因的细菌发酵生产L-赖氨酸的方法。
现有技术L-赖氨酸用于人用药物和制药工业，食品工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方式可获得对抗代谢物有抗性或重要的调节代谢物缺陷的并产生氨基酸的菌株。一种已知抗的代谢物是赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良谷氨酸棒杆菌菌株生产L-氨基酸的能力，通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。
来自谷氨酸棒杆菌的编码σ因子A的核苷酸序列可见于专利申请EP-A-1108790，序列号为No.2100和No.7065。
所述核苷酸序列也保藏于国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)(Bethesda，MD，美国)的数据库中，登录号为AX122184和AX127149。
发明目的本发明人的目的是为发酵生产L-赖氨酸提供改良的新方法。
发明概述当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱还指盐，例如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了可复制的核苷酸序列(DNA)，其源自棒状细菌，特别是谷氨酸棒杆菌，并编码σ因子A，其中SEQ ID NO2中相关的氨基酸序列在第414位含有除了L-丙氨酸之外的任何蛋白原性氨基酸(proteinogenic amino acid)。
本发明还提供了可复制的核苷酸序列(DNA)，其源自棒状细菌，特别是谷氨酸棒杆菌，并编码σ因子A，其中如SEQ ID NO4所示相关氨基酸序列在第414位含有L-缬氨酸。
本发明还提供了可复制的核苷酸序列(DNA)，其源自棒状细菌，特别是谷氨酸棒杆菌，并编码σ因子A，其碱基序列如SEQ ID NO3所示，其在第1241位含有胸腺嘧啶。
本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列并任选地在棒状细菌中复制的质粒(载体)。
本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列的棒状细菌，在所述棒状细菌中编码σ因子A的核苷酸序列任选地以超量表达形式存在，其中相关的氨基酸序列在SEQ ID NO2的第414位含有另一种蛋白原性氨基酸。
超量表达是指本发明σ因子A的胞内浓度或活性增加。
通过超量表达措施，相应蛋白的活性或浓度基于起始微生物中蛋白质的活性或浓度一般增加至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。
σ因子A是一种转录因子，其介导RNA聚合酶与DNA的特异性位点(起始位点)结合并启动转录开始(起始)。其参与起始大量基因的转录，例如编码高丝氨酸脱氢酶的基因bom，编码甘油醛三磷酸脱氢酶的gap，编码果糖二磷酸醛缩酶的fda，及编码磷酸甘油酸激酶的pgk(Patek等，微生物学1431297-1309(1996))。
为获得超量表达，可增加相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过诱导型启动子，在L-赖氨酸发酵生产期间增强表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的超量表达。
在棒状细菌中复制的质粒适于增加本发明sigA等位基因的拷贝数。许多已知的质粒载体，例如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64549-554)，pEKExl(Eikmanns等，基因10293-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因10769-74(1991))，基于隐蔽性质粒pHM1519，pBL1或pGA1。以相同方式可以使用其它质粒载体例如基于pCG4(US-A 4489160)或pNG2(Serwold-Davis，FEMS微生物学通讯66，119-124(1990))，或pAG1(US-A 5158891))的那些质粒载体。
可以进一步使用染色体基因扩增方法以增加拷贝数，如Reinscheid等(应用和环境微生物学60，126-132(1994))针对复制或扩增hom-thrB操纵子所述的方法。在这个方法中，将完整基因或等位基因克隆入在宿主中(典型在大肠杆菌中)能复制但在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可能的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，6973(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志26932678-84；US-A5，487993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物学杂志，234534-541(1993))，pEM1(Schrumpft等，1991，细菌学杂志1734510-4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41337-342)。然后通过接合或转化将含有要扩增的基因或等位基因的质粒载体移至所需谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如Schafer等所述(应用和环境微生物学60，756-759(1994))。转化方法例如Thierbach等(应用微生物学和生物技术29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067-1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123，343-347(1994))所述。在通过“交换”事件进行同源重组后，所得菌株含有所述基因或等位基因的至少两个拷贝。
蛋白质浓度的提高可通过1-和2-二维蛋白质凝胶分离及随后使用合适的评估软件经光学鉴别凝胶中蛋白质浓度而检测。在棒状细菌的情况中制备蛋白质凝胶及鉴别蛋白质的一种常用方法是Hermann等(电泳，221712-23(2001))所描述的方法。蛋白质浓度也可以通过与特异于所检测的蛋白质的抗体的Western印迹杂交进行分析(Sambrook等，分子克隆实验指导，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)，随后使用合适软件经光学评估以测定浓度(Lohaus和Meyer(1998)，Biospektrum532-39；Lottspeich(1999)AngewandteChemie 1112630-2647)。DNA结合蛋白的活性可通过DNA条带移位分析(也称为凝胶阻滞)测定(Wilson等(2001)，细菌学杂志1832151-2155)。DNA结合蛋白对其它基因表达的作用可以通过各种熟知的报道基因分析方法检测(Sambrook等，分子克隆实验指导，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)。
本发明提供了可复制的优选地内源的核苷酸序列(DNA)，其衍生自棒状细菌并编码蛋白质σ因子A，其中在相关的氨基酸序列中，在SEQ ID NO2的第414位的L-丙氨酸由另一个蛋白原性氨基酸置换，特别是如SEQ ID NO4所示由L-缬氨酸置换，。
本发明还提供了可复制的优选地内源的核苷酸序列(DNA)，其衍生自棒状细菌并编码蛋白质σ因子A，其相关的碱基序列在第1241位含有胸腺嘧啶，如SEQ ID NO3所示。
“内源基因”或“内源核苷酸序列”应理解为一个物种群体中存在的基因或核苷酸序列及其等位基因。
本发明还提供了载体(质粒)，其含有所述核苷酸序列并任选地在棒状细菌中复制。
本发明还提供了棒状细菌，其优选地含有一个或多个超量表达形式的所述的编码σ因子A的核苷酸序列。
本发明提供了一种生产L-赖氨酸或包含L-赖氨酸的食品添加剂的方法，其中一般进行以下步骤a)发酵含有编码σ因子A的内源核苷酸序列的棒状细菌，其中在相关的氨基酸序列中，第414位的L-丙氨酸由另一个蛋白原性氨基酸置换，优选地由L-缬氨酸置换，在适于形成sigA基因产物σ因子A的条件下超量表达内源sigA的等位基因；b)浓缩发酵肉汤中的L-赖氨酸；c)从发酵肉汤中分离L-赖氨酸或包含L-赖氨酸的食品添加剂，任选地d)伴有发酵肉汤的组分和/或生物量(＞0-100％)。
蛋白原性氨基酸是指组成蛋白质或多肽的所有氨基酸。这些氨基酸特别是L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，L-甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸。
sigA基因的野生型形式包含于棒状细菌的野生型菌株中，尤其在棒杆菌属中。其示于SEQ ID NO1。野生型蛋白质示于SEQ ID NO2。
在棒杆菌属中，特别提及的是本领域已知的谷氨酸棒杆菌物种。谷氨酸棒杆菌物种的已知野生型菌株例如是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870Corynebacterium melassecola ATCC 17965嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERMBP-1539黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869和扩展短杆菌(Brevibacterium divaricam)ATCC 14020。
具有“ATCC”标号的菌株可以得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，美国)。具有“FEMS”标号的菌株可得自日本国家高级产业科学技术研究院(AIST Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，日本)。上述嗜热产氨棒杆菌(FERM BP-1539)菌株及其它菌株(FERM BP-1540，RERM BP-1541和FERM BP-1542)在US-A 52550434中描述。
为产生编码σ因子A的变体的本发明sigA等位基因，使用现有技术领域中描述的诱变方法，所述变体特征在于SEQ ID NO2的第414位氨基酸被置换。
使用诱变物质的常规体内诱变方法可用于进行诱变，所述诱变物质例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍，或UV光。
体外方法如用羟胺处理(Miller，J.H.细菌遗传学短期教程，大肠杆菌和相关细菌的实验指导和手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，1992)或用诱变寡核苷酸处理(T.A.Brown遗传工程入门，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1993)，或者用聚合酶链反应(PCR)，如Newton和Graham所著手册中描述(PCR，Spektrum AkademischerVerlag，Heidelberg，1994)，可进一步用于诱变。
关于产生突变的进一步信息可见于现有技术及已知的遗传和分子生物学教材中，例如Knippers(分子遗传学，第六版，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，德国，1995)，Winnacker(基因与克隆，VCHVerlagsgesellschaft，Weinhheim，德国，1990)或者Hagemann(AllgemeineGenetik，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)所著教材。
如果使用体外方法，现有技术中所描述的sigA基因是借助于聚合酶链反应从任选地克隆入合适的质粒载体中的野生型菌株的分离的完整DNA开始扩增，然后将该DNA进行诱变。借助于聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的信息可见于以下手册中，Gait寡核苷酸合成实践方案(IRL出版社，Oxford，UK，1984)及Newton和GrahamPCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。合适的sigA等位基因然后通过上述方法选择并研究。
本发明提供了一种新的sigA等位基因，其编码σ因子A的变体，并示于SEQ ID NO3。
本发明的sigA等位基因可通过基因置换方法移至合适的菌株中，如Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))所述或PetersWendisch等(微生物学144，915-927(1998))所述。将相应的sigA等位基因克隆入在谷氨酸棒杆菌中不能复制的一个载体中，所述载体例如pK18mobsacB或pK19mobsacB(Jager等，细菌学杂志1745462-65(1992))或者pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bernard等，分子生物学杂志234534-541(1993))，然后通过转化或接合将其移至谷氨酸棒杆菌的希望宿主中。在通过实现整合的第一次“交换”事件及实现靶基因或靶序列切除的适当的第二次“交换”事件同源重组后，突变被掺入。
另外，除本发明的sigA基因之外，特定生物合成途径，糖酵解，回补作用，柠檬酸循环，戊糖磷酸循环，氨基酸输出的一或多种酶及任选地调节蛋白的增强尤其超量表达，对L-氨基酸的生产可以是有益的。一般优选地使用内源基因。
“内源基因”或“内源核苷酸”是指存在于一个物种群提中的基因或核苷酸序列或其等位基因。
文中术语“增强”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性或浓度的增加，例如通过增加基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶或蛋白质的基因或等位基因，及任选地组合使用这些方法。相应酶蛋白活性的增加也可以通过降低对抑制因子的敏感性而实现。
通过增强措施，尤其超量表达，相应蛋白的活性或浓度基于野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质的活性或浓度一般增加至少10％，25％，50％，75％，100％，150％，200％，300％，400％或500％，直至最大1000％或2000％。
因此，为了生产L-赖氨酸，除使用sigA基因的变体之外，同时例如选自以下一组的一或多个内源基因可被增强尤其被超量表达·编码二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)的dapA基因(EP-B 0197335)，·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，·编码烯醇化酶的eno基因(DE19947791.4)，·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661，EP-A-1108790)，·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19831609；EP-A-1108790)，·编码苹果酸-醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254，395-403(1998))，·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(登记号No.P26512；EP-B-0387527；EP-A-0699759；WO 00/63388)，·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548 222)，·编码Zwal蛋白的zwal基因(DE19959328.0，DSM 13115)，
·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(WO 01/71012)·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶一个亚基的opcA基因(WO 01/00844D的序列号No.79；WO 01/04322)。
6-磷酸葡糖酸脱氢酶的增强也可以通过氨基酸置换等实现，例如将酶蛋白第158位的L-脯氨酸用L-丝氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸或L-苏氨酸置换，和/或将酶蛋白第361位的L-丝氨酸用L-苯丙氨酸或L-酪氨酸置换。
葡糖-6-磷酸脱氢酶亚基的增强也可以通过氨基酸置换等而实现，例如将酶蛋白第312位的L-丝氨酸用L-苯丙氨酸或L-酪氨酸置换。
除使用sigA基因变体之外，同时对选自以下一组的一或多个内源基因进行弱化尤其降低其表达对于L-赖氨酸的生产也可以是有益的·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，·编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM 13114)，·编码Zwa2蛋白的zwa2基因(DE19959327.2，DSM 13113)，·编码果糖-1，6-二磷酸醛缩酶的fda基因(登记号X17313；von derOsten等，分子微生物学3(11)，1625-1637(1989))，·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(EP-A-0131171).
·编码异丙基苹果酸脱氢酶的leuB基因(Patek等，应用环境微生物学5043-47(1989))，登记号No.Y09578)，·编码异丙基苹果酸脱水酶的leuC基因(登记号AX121536，专利EP1108790中的序列号No.1452；登记号AX063983，专利WO0100843中的序列号No.265)，·编码高丝氨酸激酶的thrB基因(Peoples，O.W.等，分子微生物学263-72(1988))及·编码果糖磷酸激酶的pfkB基因(WO 01/00844中的SEQ IDNO57)。
文中术语“弱化”是指降低或消除微生物中由相应DNA编码的一或多种酶或蛋白质的胞内活性，例如通过使用弱启动子或使用编码具有低活性的相应酶的基因或等位基因，或失活相应基因或酶或蛋白质，及任选地组合使用这些方法。
通过弱化措施，相应蛋白质的活性或浓度一般降低至野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质活性或浓度的0-75％，0-50％，0-25％，0-10％或0-5％。
异丙基苹果酸脱氢酶的弱化也可以通过氨基酸置换等实现，例如所述酶蛋白第131位的L-甘氨酸可以用L-天冬氨酸，L-天冬酰胺或L-谷氨酸置换。
异丙基苹果酸脱水酶的弱化也可以通过氨基酸置换等实现，例如所述酶蛋白第451位的L-精氨酸用L-丝氨酸置换，或第456位的L-谷氨酸用L-天冬氨酸置换，或者组合这些置换。
高丝氨酸脱氢酶的弱化也可以通过氨基酸置换等实现，例如所述酶蛋白第118位的L-天冬酰胺用L-苏氨酸或L-丝氨酸置换，或第160位的L-亮氨酸用L-脯氨酸置换，或者组合这些置换。
果糖磷酸激酶的弱化也可以通过氨基酸置换等实现，例如所述酶蛋白第109位的L-亮氨酸可以用L-丙氨酸，L-甘氨酸或L-脯氨酸置换。
本发明还提供了根据本发明产生的微生物，它们可连续或非连续地通过分批法(分批培养)，补料分批法(补料方法)或重复补料分批法(重复补料方法)培养，以生产L-氨基酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(美国华盛顿D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，还可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃-45℃，优选地25℃-40℃。持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10-160小时内达到。
本领域已知确定L-氨基酸的方法。因此可例如Spackman等所述通过阴离子交换层析随后茚三酮衍生化作用(分析化学，30(1958)，1190)进行该分析，或者通过反相HPLC进行，如Lindroth等所述(分析化学(1979)511167-1174)。
本发明的方法用于发酵生产L-赖氨酸。
L-赖氨酸的浓度可任选通过加入L-赖氨酸而调节为希望的值。
本发明借助于以下实施例得以更详细阐述。
实施例1菌株DM1547的sigA等位基因DNA的扩增和测序谷氨酸棒杆菌菌株DM1547通过多次非定向诱变、选择及突变体选择从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中制备。该菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，对甲硫氨酸敏感。
通过常规方法从菌株DM1547中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学1401817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应，扩增携带sigA基因或等位基因的DNA节段。基于已知的谷氨酸棒杆菌sigA基因序列(EP1108970的序列号2100和7065)，选择以下引物寡核苷酸进行PCRsigA-1(SEQ ID No8)5’tgatcggctgaccaactcta 3’sigA-2(SEQ ID No9)5’aaggtctcgaatccgagaac 3’所示引物通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，通过Innis等所述方法进行PCR(PCR方案，方法与应用指导，1990，学术出版社)。用所述引物扩增出长度为大约1.89kb的一DNA节段，其携带sigA等位基因。
携带菌株DM1547的sigA等位基因的长度为大约1.89kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴别，从凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
该扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)测序确定。PCR产物的序列示于SEQ ID NO5。编码区的序列示于SEQ ID NO3。借助于Patentin程序获得的相关σ因子A的氨基酸序列示于SEQ ID NO6和4。
在菌株DM1547的sigA等位基因编码区的核苷酸序列的第1241位，即SEQ ID NO5所示核苷酸序列的第1466位，是碱基胸腺嘧啶。在野生型基因(SEQ ID NO1)的相应位置是碱基胞嘧啶。
在菌株DM1547的σ因子A的氨基酸序列的第414位是缬氨酸(SEQ ID NO6和4)。在野生型蛋白质的相应位置是丙氨酸(SEQ IDNO2)。
在编码区第1241位含有碱基胸腺嘧啶并因此编码在氨基酸序列第414位含有缬氨酸的σ因子A的sigA等位基因在下文称为sigA_A414V等位基因。在名称“sigA_A414V”中，A代表L-丙氨酸，V代表L-缬氨酸，414表示氨基酸置换的位置(见SEQ ID NO2和4)。
实施例2用sigA_A414V等位基因交换菌株DSM5715的sigA野生型基因2.1产生携带sigA_A414V等位基因的具有突变A414V的区域的DNA片段通过常规方法从菌株DM1547中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学1401817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应扩增携带sigA_A414V等位基因的具有突变A414V的区域的一个DNA节段。基于已知的谷氨酸棒杆菌sigA基因的序列(来自EP-A-1108790，序列号No.2100和序列号No.7065)，选择以下引物寡核苷酸进行聚合酶链反应，由此突变A414V位于扩增产物的中心区域sigA-XL-A1(SEQ ID NO10)5’acgaa tte-cga cgg cga tga ctt cgt ag 3’sigA-XL-A2(SEQ ID NO11)5’tggaa ttc-cgt tcc acc tcg ctc cat tc 3’所示引物通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成，并通过Innis等所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法与应用指导，1990，学术出版社)。用所述引物扩增出携带sigA_A414V等位基因的一个区域的长度为大约1.69kb的一DNA节段(SEQ ID NO7)。该引物还含有限制性内切酶EcoRI的切割位点序列，该切割位点序列在上述核苷酸序列中以下划线示出。
将携带菌株DM1547的sigA等位基因的长度为大约1.69kb的扩增的DNA片段用限制性内切酶EcoRI切割，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳而鉴别，然后从该凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
2.2构建置换载体pK18mobsacB_sigA_A414V将含有携带突变A414V的sigA_A414V等位基因的一个区域并用限制性内切酶EcoRI切割的长度为大约1.68kb的DNA片段，借助于Schafer等所述sacB系统(基因14，69-73(1994))，通过置换诱变掺入谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715的染色体中。这个系统能产生并选择通过同源重组发生的等位基因交换。
将活动型克隆载体pK18mobsacB用限制酶EcoRI消化，用碱性磷酸酶将末端去磷酸化(碱性磷酸酶，德国曼海姆Boehringer)。以此方式制备的载体与大小为大约1.68kb的sigA_A414V片段混合，并将此混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株S17-1(Simon等，生物/技术1784-791，1993)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实践方案，第1卷，ILR出版社，冷泉港，纽约，1989)。携带质粒的细胞通过将转化混合物铺板于补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)上进行选择。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒，从转化体中分离质粒DNA，并通过用酶BamHI限制酶切，随后进行琼脂糖凝胶电泳而检测。该质粒称为pK18mobsacB_sigA_A414V，并示于

图1。
2.3等位基因交换通过Schafer等所述方法(微生物学杂志1721663-1666(1990))，将实施例2.2中所述载体pK18mobsacB_sigA_A414V通过接合转移至谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715中。该载体在DSM5715中不能独立复制，只有由于重组而整合在染色体中的情况下才能保留在细胞中。通过将接合混合物铺板子补加15mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港，纽约，1989)上选择转接合子，及具有整合的pK18mobsacB_sigA_A414V的克隆。将卡那霉素抗性转接合子铺板于具有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上，在33℃温育24小时。为选择其中由于第二次重组事件而发生质粒切除的突变体，将所述克隆在LB液体培养基中非选择性培养30小时，然后铺板于具有10％蔗糖的LB琼脂上，温育16小时。
与起始质粒pK18mobsacB相似，质粒pK18mobsacB_sigA_A414V除了卡那霉素抗性基因之外，还含有一个拷贝的编码得自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的果聚糖蔗糖酶的sacB基因。可以由蔗糖诱导的表达导致果聚糖蔗糖酶形成，其催化对谷氨酸棒杆菌有毒性的果聚糖产物合成。因此只有其中整合的pK18mobsacB_sigA_A414V由于第二次重组已经被切除的那些克隆在LB琼脂上生长。根据第二次重组相对于突变位点的位置，随切除而发生等位基因的交换或突变的掺入，或者原始拷贝保留在宿主染色体中。
对大约40-50个菌落测试表型“在存在蔗糖情况下生长”和“在存在卡那霉素的情况下不生长”。在显示出表型“在存在蔗糖情况下生长”和“在存在卡那霉素的情况下不生长”的4个菌落中，通过GATCBiotech AG(Constance，德国)，从测序引物sA_1(SEQ ID NO12)开始对跨越A414V突变的sigA基因区域进行测序，以证实sigA_A414V等位基因的突变存在于染色体中。通过GATC合成为此所用的引物sA_1sA_1(SEQ ID NO12)5’aag ttc tcc acc tac gca ac 3’以此方式鉴别一个克隆，其在sigA基因的第1241位含有碱基胸腺嘧啶，并因此具有sigA_A414V等位基因。这个克隆称为菌株DSM5715sigA_A414V。
实施例3制备赖氨酸将实施例2中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715sigA_A414V在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃将菌株在琼脂板上温育24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶中)。用于预培养的培养基是MM培养基。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物24小时。从这些预培养物中接种主培养物，由此主培养物的起始光密度(波长660nm)为0.1。培养基MM也用作主培养物。
培养基MMCSL 5g/lMOPS20g/l葡萄糖(单独高压灭菌)50g/l(NH4)2SO425g/lKH2PO40.1g/lMgSO4·7H2O 1.0g/lCaCl2·2H2O 10mg/lFeSO4·7H2O 10mg/lMnSO4·H2O 5.0mg/l生物素(过滤灭菌)0.3mg/l硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/lL-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/lCaCO325g/l用氨水将CSL(玉米浆)，MOPS(吗啉代丙磺酸)和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。在33℃和80％湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表1。
表1
附图简述图1质粒pK18mobsacB_sigA_A414V图谱。
图中所采用的缩写和符号有如下含义。标示的碱基对数是在重复测定基础上获得的大约值。
Kan卡那霉素抗性基因EcoRI限制酶EcoRI的酶切位点BamHI限制酶BamHI的酶切位点′sigA含有sigA等位基因(＝sigA_A414V等位基因)3’末端区域及下游区域的克隆的DNA片段sacBsacB基因RP4-mob具有进行转移的复制源点(oriT)的mob区域oriV复制源点V
序列表<110>德古萨股份公司<120>来自棒状细菌的sigA基因的等位基因<130>DEDEG0231<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1497<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<223>sigA wild-type gene<400>1gtg gag agc agc atg gta gaa aac aac gta gca aaa aag acg gtc gct48Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15aaa aag acc gca cgc aag acc gca cgc aaa gca gcc ccg cgc gtg gca96Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30acc cca ttg gga gtc gca tct gag tct ccc att tcg gcc acc cct gcg144Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45cgc agc atc gat gga acc tca acc cct gtt gaa gct gct gac acc ata192Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60gag acc acc gcc cct gca gcg aag gct cct gcg gcc aag gct ccc gct240Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80aaa aag gtt gcc aag aag aca gct cgc aag gca cct gcg aaa aag act288Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95gtc gcc aag aaa gcc aca acc gcc aag gct gca cct gca act gcc aag336Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110gac gaa aac gca cct gtt gat gac gac gag gag aac ctc gct cag gat384Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125gaa cag gac ttc gac ggc gat gac ttc gta gac ggc atc gaa gac gaa432Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140
gaa gat gaa gac ggc gtc gaa gcc ctc ggt gaa gaa agc gaa gac gac480Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160gaa gag gac ggc tca tcc gtt tgg gat gaa gac gaa tcc gca acc ctg528Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175cgt cag gca cgt aaa gat gcc gag ctc acc gct tcc gcc gac tct gtt576Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190cgc gct tac ctg aag caa atc ggt aaa gtt gcc ctg ctg aac gct gaa624Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205cag gaa gtc tcc ctg gca aag cgc atc gaa gca ggc ctt tac gcc acc672Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220cac cgc atg gag gaa atg gaa gaa gct ttc gca gcc ggt gac aag gac720His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240gcg aaa ctc acc cca gcc gtc aag cgt gac ctc cgc gcc atc gct cgt768Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255gac ggc cgc aag gcg aaa aac cac ctc ctg gaa gcc aac ctt cgt ctg816Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270gtt gtc tcc ctg gca aag cgc tac acc ggc cgt ggc atg gca ttc ctg864Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285gac ctc atc cag gaa ggc aac ctc ggt ctg att cgt gcc gta gag aag912Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300ttc gac tac tcc aag ggc tac aag ttc tcc acc tac gca acc tgg tgg960Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320atc cgt cag gca atc acc cgc gcc atg gcc gac caa gca cga acc atc1008Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335cgt atc cca gtc cac atg gtt gaa gtg atc aac aaa ctt ggt cgc atc1056Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350caa cgt gaa ctc ctt cag gaa ctc ggc cgc gaa cca acc cca cag gaa1104Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu355 360 365ctg tcc aaa gaa atg gac atc tcc gag gaa aag gta ctg gaa atc cag1152Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380
cag tac gcc cgc gaa cca atc tcc ctg gac caa acc atc ggc gac gaa1200Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400ggc gac agc cag ctc ggc gac ttc atc gaa gac tcc gaa gcc gtc gtc1248Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val Val405 410 415gca gtc gac gcc gtc tca ttc acc ctg ctg caa gac cag cta cag gac1296Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430gtc cta gag acc ctc tcc gaa cgt gaa gcc ggc gtg gtt aaa ctc cgc1344Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445ttc gga ctc acc gac gga atg cca cgc act tta gac gaa atc ggc caa1392Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460gtt tac ggt gtc acc cgt gag cgc atc cgc cag att gag tcc aag acc1440Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480atg tct aag ctg cgc cac cca tca cgc tcc cag gtc ctt cgc gac tac1488Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495ctg gac taa1497Leu Asp<210>2<211>498<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>2Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110
Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu355 360 365Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Ala Val Val405 410 415Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430
Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495Leu Asp<210>3<211>1497<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<223>sigA allele<220>
<221>mutation<222>(1241)..(1241)<223>Exchange of cytosine for thymine<400>3gtg gag agc agc atg gta gaa aac aac gta gca aaa aag acg gtc gct48Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15aaa aag acc gca cgc aag acc gca cgc aaa gca gcc ccg cgc gtg gca96Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30acc cca ttg gga gtc gca tct gag tct ccc att tcg gcc acc cct gcg144Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45cgc agc atc gat gga acc tca acc cct gtt gaa gct gct gac acc ata192Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60gag acc acc gcc cct gca gcg aag gct cct gcg gcc aag gct ccc gct240Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80aaa aag gtt gcc aag aag aca gct cgc aag gca cct gcg aaa aag act288Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95gtc gcc aag aaa gcc aca acc gcc aag gct gca cct gca act gcc aag336Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110gac gaa aac gca cct gtt gat gac gac gag gag aac ctc gct cag gat384
Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125gaa cag gac ttc gac ggc gat gac ttc gta gac ggc atc gaa gac gaa432Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140gaa gat gaa gac ggc gtc gaa gcc ctc ggt gaa gaa agc gaa gac gac480Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160gaa gag gac ggc tca tcc gtt tgg gat gaa gac gaa tcc gca acc ctg528Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175cgt cag gca cgt aaa gat gcc gag ctc acc gct tcc gcc gac tct gtt576Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190cgc gct tac ctg aag caa atc ggt aaa gtt gcc ctg ctg aac gct gaa624Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205cag gaa gtc tcc ctg gca aag cgc atc gaa gca ggc ctt tac gcc acc672Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220cac cgc atg gag gaa atg gaa gaa gct ttc gca gcc ggt gac aag gac720His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240gcg aaa ctc acc cca gcc gtc aag cgt gac ctc cgc gcc atc gct cgt768Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255gac ggc cgc aag gcg aaa aac cac ctc ctg gaa gcc aac ctt cgt ctg816Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270gtt gtc tcc ctg gca aag cgc tac acc ggc cgt ggc atg gca ttc ctg864Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285gac ctc atc cag gaa ggc aac ctc ggt ctg att cgt gcc gta gag aag912Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300ttc gac tac tcc aag ggc tac aag ttc tcc acc tac gca acc tgg tgg960Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320atc cgt cag gca atc acc cgc gcc atg gcc gac caa gca cga acc atc1008Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335cgt atc cca gtc cac atg gtt gaa gtg atc aac aaa ctt ggt cgc atc1056Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350cas cgt gaa ctc ctt cag gaa ctc ggc cgc gaa cca acc cca cag gaa1104
Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr pro Gln Glu355 360 365ctg tcc aaa gaa atg gac atc tcc gag gaa aag gta ctg gaa atc cag1152Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380cag tac gcc cgc gaa cca atc tcc ctg gac caa acc atc ggc gac gaa1200Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400ggc gac agc cag ctc ggc gac ttc atc gaa gac tcc gaa gtc gtc gtc1248Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val405 410 415gca gtc gac gcc gtc tca ttc acc ctg ctg caa gac cag cta cag gac1296Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430gtc cta gag acc ctc tcc gaa cgt gaa gcc ggc gtg gtt aaa ctc cgc1344Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445ttc gga ctc acc gac gga atg cca cgc act tta gac gaa atc ggc caa1392Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460gtt tac ggt gtc acc cgt gag cgc atc cgc cag att gag tcc aag acc1440Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480atg tct aag ctg cgc cac cca tca cgc tcc cag gtc ctt cgc gac tac1488Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495ctg gac taa1497Leu Asp<210>4<211>498<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>4Met Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80
Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110Asp Glu Asn Ala pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu355 360 365Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400
Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val405 410 415Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495Leu Asp<210>5<211>1892<212>DNA<213>Corynebacterium glutamicum<220>
<221>CDS<222>(226)..(1719)<223>sigA allele<220>
<221>mutation<222>(1466)..(1466)<223>Exchange of cytosine for thymine<400>5tgatcggctg accaactcta taagagatgc acctcaagtt tggggatact tattcggcgt60ttctggggaa caaatacgtt tccctattgt tgtatatagg tattcgcact taagaaacat120ctctcatgga aagaagctag gcggaaaggg cgttaagtac ttgccattta atcctcagca180tcactcggat cagtcggaga tgtcgatgaa aatgcaccag gagcc gtg gag agc agc237Val Glu Ser Ser1atg gta gaa aac aac gta gca aaa aag acg gtc gct aaa aag acc gca 285Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala Lys Lys Thr Ala5 10 15 20cgc aag acc gca cgc aaa gca gcc ccg cgc gtg gca acc cca ttg gga 333Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala Thr Pro Leu Gly25 30 35gtc gca tct gag tct ccc att tcg gcc acc cct gcg cgc agc atc gat 381Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala Arg Ser Ile Asp40 45 50
gga acc tca acc cct gtt gaa gct gct gac acc ata gag acc acc gcc429Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile Glu Thr Thr Ala55 60 65cct gca gcg aag gct cct gcg gcc aag gct ccc gct aaa aag gtt gcc477Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Lys Lys Val Ala70 75 80aag aag aca gct cgc aag gca cct gcg aaa aag act gtc gcc aag aaa525Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr Val Ala Lys Lys85 90 95 100gcc aca acc gcc aag gct gca cct gca act gcc aag gac gaa aac gca573Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys Asp Glu Asn Ala105 110 115cct gtt gat gac gac gag gag aac ctc gct cag gat gaa cag gac ttc621Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp Glu Gln Asp Phe120 125 130gac ggc gat gac ttc gta gac ggc atc gaa gac gaa gaa gat gaa gac669Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp135 140 145ggc gtc gaa gcc ctc ggt gaa gaa agc gaa gac gac gaa gag gac ggc717Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp Glu Glu Asp Gly150 155 160tca tcc gtt tgg gat gaa gac gaa tcc gca acc ctg cgt cag gca cgt765Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu Arg Gln Ala Arg165 170 175 180aaa gat gcc gag ctc acc gct tcc gcc gac tct gtt cgc gct tac ctg813Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val Arg Ala Tyr Leu185 190 195aag caa atc ggt aaa gtt gcc ctg ctg aac gct gaa cag gaa gtc tcc861Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu Gln Glu Val Ser200 205 210ctg gca aag cgc atc gaa gca ggc ctt tac gcc acc cac cgc atg gag909Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr His Arg Met Glu215 220 225gaa atg gaa gaa gct ttc gca gcc ggt gac aag gac gcg aaa ctc acc957Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp Ala Lys Leu Thr230 235 240cca gcc gtc aag cgt gac ctc cgc gcc atc gct cgt gac ggc cgc aag1005pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg Asp Gly Arg Lys245 250 255 260gcg aaa sac cac ctc ctg gaa gcc sac ctt cgt ctg gtt gtc tcc ctg1053Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu Val Val Ser Leu265 270 275gca aag cgc tac acc ggc cgt ggc atg gca ttc ctg gac ctc atc cag1101Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu Asp Leu Ile Gln280 285 290
gaa ggc aac ctc ggt ctg att cgt gcc gta gag aag ttc gac tac tcc1149Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Tyr Ser295 300 305aag ggc tac aag ttc tcc acc tac gca acc tgg tgg atc cgt cag gca1197Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Ala310 315 320atc acc cgc gcc atg gcc gac caa gca cga acc atc cgt atc cca gtc1245Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile Arg Ile Pro Val325 330 335 340cac atg gtt gaa gtg atc aac aaa ctt ggt cgc atc caa cgt gaa ctc1293His Met Val Glu Val Ile Asr Lys Leu Gly Arg Ile Gln Arg Glu Leu345 350 355ctt cag gaa ctc ggc cgc gaa cca acc cca cag gaa ctg tcc aaa gaa1341Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu Leu Ser Lys Glu360 365 370atg gac atc tcc gag gaa aag gta ctg gaa atc cag cag tac gcc cgc1389Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln Gln Tyr Ala Arg375 380 385gaa cca atc tcc ctg gac caa acc atc ggc gac gaa ggc gac agc cag1437Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu Gly Asp Ser Gln390 395 400ctc ggc gac ttc atc gaa gac tcc gaa gtc gtc gtc gca gtc gac gcc1485Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val Ala Val Asp Ala405 410 415 420gtc tca ttc acc ctg ctg caa gac cag cta cag gac gtc cta gag acc1533Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp Val Leu Glu Thr425 430 435ctc tcc gaa cgt gaa gcc ggc gtg gtt aaa ctc cgc ttc gga ctc acc1581Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg Phe Gly Leu Thr440 445 450gac gga atg cca cgc act tta gsc gaa atc ggc caa gtt tac ggt gtc1629Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln Val Tyr Gly Val455 460 465acc cgt gag cgc atc cgc cag att gag tcc aag acc atg tct aag ctg1677Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr Met Ser Lys Leu470 475 480cgc cac cca tca cgc tcc cag gtc ctt cgc gac tac ctg gac1719Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr Leu Asp485 490 495taaaacccca gtcgggctca agaccgggcc gccactgttt tcctctgcgg ggaacggtgg 1779tggcccggtt tttctgttgc tttggttcgg ctggtcacag ttcggctggg gtgttttaag 1839tttgatttca cattgccgat ttctaaacgc cgagttctcg gattcgagac ctt 1892
<210>6<211>498<212>PRT<213>Corynebacterium glutamicum<400>6Val Glu Ser Ser Met Val Glu Asn Asn Val Ala Lys Lys Thr Val Ala1 5 10 15Lys Lys Thr Ala Arg Lys Thr Ala Arg Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala20 25 30Thr Pro Leu Gly Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ser Ala Thr Pro Ala35 40 45Arg Ser Ile Asp Gly Thr Ser Thr Pro Val Glu Ala Ala Asp Thr Ile50 55 60Glu Thr Thr Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala Ala Lys Ala Pro Ala65 70 75 80Lys Lys Val Ala Lys Lys Thr Ala Arg Lys Ala Pro Ala Lys Lys Thr85 90 95Val Ala Lys Lys Ala Thr Thr Ala Lys Ala Ala Pro Ala Thr Ala Lys100 105 110Asp Glu Asn Ala Pro Val Asp Asp Asp Glu Glu Asn Leu Ala Gln Asp115 120 125Glu Gln Asp Phe Asp Gly Asp Asp Phe Val Asp Gly Ile Glu Asp Glu130 135 140Glu Asp Glu Asp Gly Val Glu Ala Leu Gly Glu Glu Ser Glu Asp Asp145 150 155 160Glu Glu Asp Gly Ser Ser Val Trp Asp Glu Asp Glu Ser Ala Thr Leu165 170 175Arg Gln Ala Arg Lys Asp Ala Glu Leu Thr Ala Ser Ala Asp Ser Val180 185 190Arg Ala Tyr Leu Lys Gln Ile Gly Lys Val Ala Leu Leu Asn Ala Glu195 200 205Gln Glu Val Ser Leu Ala Lys Arg Ile Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Thr210 215 220His Arg Met Glu Glu Met Glu Glu Ala Phe Ala Ala Gly Asp Lys Asp225 230 235 240Ala Lys Leu Thr Pro Ala Val Lys Arg Asp Leu Arg Ala Ile Ala Arg245 250 255Asp Gly Arg Lys Ala Lys Asn His Leu Leu Glu Ala Asn Leu Arg Leu260 265 270Val Val Ser Leu Ala Lys Arg Tyr Thr Gly Arg Gly Met Ala Phe Leu275 280 285
Asp Leu Ile Gln Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile Arg Ala Val Glu Lys290 295 300Phe Asp Tyr Ser Lys Gly Tyr Lys Phe Ser Thr Tyr Ala Thr Trp Trp305 310 315 320Ile Arg Gln Ala Ile Thr Arg Ala Met Ala Asp Gln Ala Arg Thr Ile325 330 335Arg Ile Pro Val His Met Val Glu Val Ile Asn Lys Leu Gly Arg Ile340 345 350Gln Arg Glu Leu Leu Gln Glu Leu Gly Arg Glu Pro Thr Pro Gln Glu355 360 365Leu Ser Lys Glu Met Asp Ile Ser Glu Glu Lys Val Leu Glu Ile Gln370 375 380Gln Tyr Ala Arg Glu Pro Ile Ser Leu Asp Gln Thr Ile Gly Asp Glu385 390 395 400Gly Asp Ser Gln Leu Gly Asp Phe Ile Glu Asp Ser Glu Val Val Val405 410 415Ala Val Asp Ala Val Ser Phe Thr Leu Leu Gln Asp Gln Leu Gln Asp420 425 430Val Leu Glu Thr Leu Ser Glu Arg Glu Ala Gly Val Val Lys Leu Arg435 440 445Phe Gly Leu Thr Asp Gly Met Pro Arg Thr Leu Asp Glu Ile Gly Gln450 455 460Val Tyr Gly Val Thr Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu Ser Lys Thr465 470 475 480Met Ser Lys Leu Arg His Pro Ser Arg Ser Gln Val Leu Arg Asp Tyr485 490 495Leu Asp<210>7<211>1689<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1689)<223>Description of the artificial sequencePCR product containing ann3′-terminal region of the sigA allele (＝sigA_A414V allele) andthe downstream region<220>
<221>mutation<222>(854)..(854)<223>Exchange of cytosine for thymine
acgaattccg acggcgatga cttcgtagac ggcatcgaag acgaagaaga tgaagacggc60gtcgaagccc tcggtgaaga aagcgaagac gacgaagagg acggctcatc cgtttgggat120gaagacgaat ccgcaaccct gcgtcaggca cgtaaagatg ccgagctcac cgcttccgcc180gactctgttc gcgcttacct gaagcaaatc ggtaaagttg ccctgctgaa cgctgaacag240gaagtctccc tggcaaagcg catcgaagca ggcctttacg ccacccaccg catggaggaa300atggaagaag ctttcgcagc cggtgacaag gacgcgaaac tcaccccagc cgtcaagcgt360gacctccgcg ccatcgctcg tgacggccgc aaggcgaaaa accacctcct ggaagccaac420cttcgtctgg ttgtctccct ggcaaagcgc tacaccggcc gtggcatggc attcctggac480ctcatccagg aaggcaacct cggtctgatt cgtgccgtag agaagttcga ctactccaag540ggctacaagt tctccaccta cgcaacctgg tggatccgtc aggcaatcac ccgcgccatg600gccgaccaag cacgaaccat ccgtatccca gtccacatgg ttgaagtgat caacaaactt660ggtcgcatcc aacgtgaact ccttcaggaa ctcggccgcg aaccaacccc acaggaactg720tccaaagaaa tggacatctc cgaggaaaag gtactggaaa tccagcagta cgcccgcgaa780ccaatctccc tggaccaaac catcggcgac gaaggcgaca gccagctcgg cgacttcatc840gaagactccg aagtcgtcgt cgcagtcgac gccgtctcat tcaccctgct gcaagaccag900ctacaggacg tcctagagac cctctccgaa cgtgaagccg gcgtggttaa actccgcttc960ggactcaccg acggaatgcc acgcacttta gacgaaatcg gccaagttta cggtgtcacc1020cgtgagcgca tccgccagat tgagtccaag accatgtcta agctgcgcca cccatcacgc1080tcccaggtcc ttcgcgacta cctggactaa aaccccagtc gggctcaaga cagggccgcc1140actgttttcc tctgcgggga acggtggtgg cccggttttt ctgttgcttt ggttcggctg1200gtcacagttc ggctggggtg ttttaagttt gatttcacat tgccgatttc taaacgccga1260gttctcggat tcgagacctt acctgcaatt tcacggttac aatttctcgt tagcactttc1320gcgtactcaa tttcttatgt tcaatttcgg tcggaaaagt gccattttcc gacatcgcct1380tgagaaattg aatacaagaa attgagcgca aggtatcgaa cttgagaaat tgagctttag1440cactcactcc cctgtttgat gaagtcagca aagccaaaag acgacttcac atctccgact1500tcttaacagc gacttctcgt ggctgacttc gctacctaaa cctgagtttc cttagcgaag1560tcgtgtgatg agaagtcgtg tgatgagaag ttgggtatga gaagtcagca cacgtgaagt1620cgccttttct ccccggcacg ctcggagtag cgtgaaaggt ggaatggagc gaggtggaac1680ggaattcca1689
<210>8<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA-1<400>8tgatcggctg accaactcta 20<210>9<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA-2<400>9aaggtctcga atccgagaac 20<210>10<211>28<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA_XL-Al<400>10acgaattccg acggcgatga cttcgtag28<210>11<211>28<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(28)<223>Description of the artificial sequenceprimer sigA_XL-A2<400>11tggaattccg ttccacctcg ctccattc28<210>12<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)
<223> Description of the artificial sequenceprimer sA_1<400>12aagttctcca cctacgcaac 权利要求
1.源自棒状细菌并编码蛋白质σ因子A的可复制的核苷酸序列(DNA)，其中在相关的氨基酸序列中，SEQ ID NO2的第414位L-丙氨酸由另一个蛋白原性氨基酸置换。
2.权利要求1的源自棒状细菌并编码蛋白质σ因子A的可复制的核苷酸序列(DNA)，其中相关氨基酸序列在第414位含有L-缬氨酸，如SEQ ID NO4所示。
3.权利要求1的源自棒状细菌并编码蛋白质σ因子A的可复制的核苷酸序列(DNA)，其碱基序列在第1241位含有胸腺嘧啶，如SEQID NO3所示。
4.含有权利要求1-3任一项的核苷酸序列并任选地在棒状细菌中复制的质粒(载体)。
5.含有权利要求1-4任一项的核苷酸序列的棒状细菌，在所述棒状细菌中编码σ因子A的核苷酸序列优选地以超量表达形式存在。
6.含有编码σ因子A的核苷酸序列的棒状细菌，其中在相关的氨基酸序列中，SEQ ID NO2的第414位L-丙氨酸由另一个蛋白原性氨基酸置换。
7.生产L-赖氨酸或包含L-赖氨酸的食品添加剂的方法，其中包括进行以下步骤a)发酵棒状细菌，所述棒状细菌中内源sigA基因的等位基因在适于形成sigA基因产物σ因子A的条件下超量表达；b)从发酵肉汤、形成L-赖氨酸的棒状细菌中分离L-赖氨酸或包含L-赖氨酸的食品添加剂。
8.权利要求7的方法，其中采用的是含有sigA基因等位基因的棒状细菌，其中在相关的氨基酸序列中，SEQ ID NO2的第414位的L-丙氨酸由另一个蛋白原性氨基酸置换。
9.权利要求7的方法，其中采用的微生物中L-赖氨酸生物合成途径的其它基因被额外超量表达。
10.权利要求7的方法，其中采用的微生物中降低L-赖氨酸形成的代谢途径被至少部分消除。
11.生产L-赖氨酸或包含L-赖氨酸的食品添加剂的方法，其中进行以下步骤a)发酵含有编码蛋白质σ因子A的内源核苷酸序列的棒状细菌，其中在相关的氨基酸序列中，第414位L-丙氨酸由另一个蛋白原性氨基酸置换，优选地用L-缬氨酸置换；b)浓缩发酵肉汤中的L-赖氨酸，c)从发酵肉汤中分离L-赖氨酸或包含L-赖氨酸的食品添加剂，任选地d)伴有发酵肉汤中组分和/或生物量(＞0-100％)。
全文摘要
本发明涉及来自棒状细菌的编码σ因子A的sigA基因的等位基因，本发明还涉及使用含有这些等位基因的细菌发酵生产L－赖氨酸的方法。
文档编号C12N1/21GK1606617SQ02825477
公开日2005年4月13日 申请日期2002年10月16日 优先权日2001年12月20日
发明者布丽吉特·巴特, 斯特凡·汉斯, 卡罗琳·赖内恩, 瓦尔特·普费弗勒 申请人:德古萨股份公司