专利名称：：一种控制固定化酶空间取向的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及酶和其它功能蛋白质分子固定化空间取向(Orientation)的方法。固定化酶是本世纪六十年代发展起来的技术，其原理是通过物理或化学手段将水溶性酶或限制在局部空间，达到可反复使用的目的。主要应用形式为各类酶反应器、酶传感器和生物芯片等生物器件等。长期以来，它们在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。固定化酶技术后来又被用于其它功能蛋白质的固定，如免疫芯片、蛋白质芯片。经典的固定化酶方法主要有物理吸附、化学偶联、交联、凝胶包埋和微胶囊法等。在工业规模应用水平(如酶反应器)，强调载体廉价并具有大的固定表面积(或比表面积)，但酶活常常损失可观(可达90％以上)。然而，在生物传感器和生物芯片方面，可供固定的面积非常小，如传统的生物传感器酶膜面积不到一个平方厘米，新近发展的蛋白质芯片和计算机生物芯片、微型生物传感器及生物传感器阵列等，单只器件有效固定面积为微米水平，甚至向单分子器件发展，使得传统的固定化方法难以满足要求。主要表现在酶或蛋白质经固定后剩余活力(residualactivity)大量损失和批间制作的重现性差。其主要原因有(1)固定过程中化学交联剂对蛋白质造成的化学损伤，这种情况尤其发生在大面积的交联反应和共价结合反应，使蛋白质构象发生不利于反应的变化；(2)当被固定的酶蛋白质分子表面分布有多个可供交联反应或共价键合的基团时，或酶蛋白分子通过静电吸附固定在载体上时，酶分子固定的方向呈随机性，其中不适合的空间取向使酶与底物之间的邻近定向效应受阻，甚至发生酶活性中心被屏蔽，催化作用减弱。上述原因除造成剩余活力低下以外，还导致制成的生物器件活性不均一，互换性差，即所谓均质性差，这是生物传感器研究和制作生物电子器件中遇到的一个主要问题。因此，如何控制酶或功能蛋白质空间沉积方向成为制作高质量生物器件的一个关键。据文献调查，学者们近年来已经尝试了多种解决办法，归纳起来有共价固定法、巯基引入法和生物素-亲和素亲合法。共价固定法选择性地利用酶分子表面远离活性中心的特定稀有基团(如巯基)进行反应，使该基团与载体上另一基团共价键合来固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。但特定稀有基团属于低频氨基酸，在多数蛋白质分子表面难以寻觅，即使有，位置也不一定合适(CollioudA_etal_Orientedandcovalentimmobilizationoftargetmoleculestosolidsupportssynthesisandapplicationofalight-activatableandthiol-reactivecross-linkingreagent．Bioconjug．Chem．1993，4528；SteinT．andGerishG．OrientedBindingofalipid-AnchoredCellProteinontoaBiosensorSurfaceUsingHydrophobicImmobilizationandPhotoactiveCrosslinkingAnal．Biochem．1996，237252)。在此基础上产生了巯基引入法，即利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子引入半胱氨酸，通过其巯基与载体的碘乙酰基团发生烷基化反应来控制酶分子的空间取向(VigmondSJ．IwakuraM．MizutaniF．andKatsuraT．Site-SpecificImmobilizationofMolecularlyEngineeredDihydrofolateReductasetoGoldSurfaces．Langmuir．1994，102870HuangW．etal_Improvingtheactivityofimmobilizedsubtilisinbysite-directedattachmenttosurfaces．Annal．Chem．1997，694601)。但该方法也有明显不足，须要对蛋白质的核酸序列及空间结构有充分了解，蛋白质分子表面不能含所要引入的氨基酸残基，难以预测引入半胱氨酸后蛋白质分子的正常空间折叠及构象是否受影响，等等。生物素-亲和素亲合法是将生物素羧化载体蛋白片段融合与酶融合，将融合蛋白定向固定在亲和素包被的载体。(MinDJetal_SpecificimmobilizationofinvivobiotinylatedbacterialluciferaseandFMNNAD(P)Hoxidoreductase．Annal．Biochem．1999，270，133)。生物素与亲和素或链霉亲和素有高专一性的、极强的亲和力。极端pH值、高的离子强度、甚至促溶剂(如盐酸胍(3mol／L))都不能破坏这种结合，因而广泛用于免疫分析、受体研究、免疫组织化学、蛋白质分离等。固定效率及稳定性都有提高。在此基础上，本申请作者之一Cass博士等曾经采用采用融合蛋白技术将链霉结合肽与酶结合，通过链霉结合肽与链霉亲和素之间的专一性结合反应，以达到定向固定酶分子的目的，但固定化效率底，酶活损失较大。推测酶分子与链霉结合肽之间的距离太近，两者构象相互影响，而且酶分子对链霉结合肽与链霉亲和素的结合反应造成较大的空间位阻，不利于固定化。本发明的目的是提供一种控制固定化酶空间取向的方法，通过融合蛋白的基因操纵技术，构建能定向固定的分子系统，与现有固定化酶方法相比，固定化回收活力高，均一性好，能解决生物分子器件活性不稳定和互换性差的问题。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施利用融合蛋白原理，通过基因操纵将酶分子与连接肽以及链霉结合肽融合，构建成酶、连接肽和链霉结合肽的融合蛋白分子系统，通过链霉结合肽与固相载体上的链霉亲和素专一性的结合、以及连接肽的连接作用，使酶分子固定在载体上。我们特称这种方法为“锚-链”方法。“锚”即链霉结合肽，“链”即连接肽。“锚”的作用为定向定点固定，“链”的作用是增加酶蛋白与链霉结合肽之间的距离，使各自的构象和生物学活性互不受影响，酶分子通过“链”和“锚”的作用被锁定在链霉亲和素修饰的载体表面，所有被固定的酶分子具有一致的空间取向，它们的活性中心均自由地朝向外部溶液，保持催化活性状态。其步骤是1．基因融合，选择合适的基因克隆和表达载体，通过基因操纵，将待固定的酶分子(或其它功能蛋白质)基因、连接肽(甘氨酸残基和丝氨酸残基的多聚体)编码核苷酸序列和链霉结合肽基因依次拼接，构建酶、连接肽和链霉结合肽的融合基因；其中，链霉结合肽含十个氨基酸残基，分别是丝氨酸、丙氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和两个甘基酸。该融合基因编码的融合蛋白的一级结构为酶-(N)末端-[(甘氨酸-丝氨酸)n]-链霉结合肽，其中10≥n≥3；2．融合基因表达，将携带有融合基因的质粒转化到相应的受体细胞(受体细胞基因组须不含有与融合基因相同的基因)，在选择性平板上挑选阳性转化子，并在合适的液体培养基中表达出融合蛋白；3．融合蛋白制备，离心培养液、收集洗涤细胞，提取蛋白粗品，若属分泌型表达，则直接从上清液中提取融合蛋白粗品，通过柱层析等方法分离纯化融合蛋白，继而超滤浓缩，4℃保存；4．融合蛋白鉴定，通过SDS-聚丙稀胺凝胶电泳法确定融合蛋白为电泳纯，用光吸收法或BIO-RAD试剂盒测定样品中融合蛋白浓度；5．融合蛋白酶学分析，进行融合蛋白的酶动力学分析，确定比活力、Km、Kcat等动力学常数，比较游离的融合蛋白和野生型酶蛋白的催化动力学性质。如果被固定的是其它功能蛋白质(如某种抗体)，则要定量检测其相应的功能；6．融合蛋白的固定，在包被有链霉亲和素的载体上固定融合蛋白，融合蛋白的酶的活性中心朝向反应溶液；7．固定化融合蛋白的性能鉴定。附图及说明图1．酶(或其它功能蛋白)固定化空间取向控制的“锚-链”分子模型利用融合蛋白原理，通过基因操纵将酶分子与连接肽以及链霉结合肽融合，构建成酶、连接肽和链霉结合肽的融合蛋白分子系统，通过链霉结合肽与固相载体上的链霉亲和素专一性的结合、以及连接肽的连接作用，使酶分子固定在载体上。其中，“锚”即链霉结合肽，“链”即连接肽。“锚”的作用为定向定点固定，“链”的作用是增加酶蛋白与链霉结合肽之间的距离，使各自的构象和生物学活性互不受影响，酶分子通过“链”和“锚”的作用被锁定在链霉亲和素修饰的载体表面，所有被固定的酶分子具有一致的空间取向，它们的活性中心均自由地朝向外部溶液，保持催化活性状态；图2．基因融合策略合成的连接肽(LP)编码序列lp的(+)、(-)链经退火处理后两端成PstI酶切位点的粘性末端。质粒pASK75克隆有大肠杆菌碱性磷酸酶工程酶(EAP(D101S))基因phoA和链霉结合肽(Streptag，ST)基因st，该两个基因之间含有一个PstI酶切位点。质粒经PstI酶解后与lp在T4连接酶的作用下连接，使lp插入到phoA和st中间，得到融合基因phoA-lp-st。该融合基因编码融合蛋白EAP-LP-ST。融合基因重组子序列中的lp的5’端失去原有的PstI酶切位点，使重组以后的质粒pASK75仍然只含有一个PstI酶切位点，该位点在lp和st中间，便于利用酶切进一步检查基因融合正确与否。基因片段和质粒的纯化都采用QIAGEN公司试剂盒。图3．融合蛋白的SDS-PAGE电泳照片M为小分子量蛋白质电泳标准，S为融合蛋白BAP-LP-ST样品，电泳方向自上而下，凝胶浓度为浓缩胶，3．9％；分离胶，12％；电流强度，10-15mA；电泳时间80分钟。图4．固定化酶的活性比较A为融合蛋白BAP(野生型)-LP-ST，C为融合蛋白BAP-ST，D为融合蛋白，设置的对照组分别为B1为无链霉亲和素包被但加入融合蛋白样品，B2为链霉亲和素包被但未加入融合蛋白样品，实验空白对照，B3既无链霉亲和素包被，又未加入融合蛋白样品，只加NBT／BCIP。实验设4个重复。结合附图对本发明作进一步详细描述实施例大肠杆菌碱性磷酸酶工程酶(EAP(D101S))的定向固定。1．基因融合(图2)编码EAP(D101S)、结合肽(LP，甘氨酸残基和丝氨酸残基的5聚体)和链霉结合肽ST的基因或核苷酸序列分别为phoA、lp和st。含有phoA、和st的克隆表达载体为细菌质粒pASK75，转化受体细菌为E．coliSM547。用DNA合成仪分别合成lp的正负链，并使其两端含有限制性内切酶PstI酶切位点，正负链经退火形成DNA双链(+)5’-AGCGGCTCT(GGATCT)3GGATCTGCA-3’(-)3’-CGTTCGCCTAGA(CCTAGA)3CCTAG-5’用PstI分别酶切lp和含有phoA-st融合基因的的pASK75质粒(ZhangXEetal_EngineeringE．colialkalinephosphataseyieldschangesofcatalyticaetivity，resistancetophosphateinhibitionandheatstability，Enzymeandmicrobialtechnology，submitted)。将两种酶切产物混合，用T4连接酶在14℃连接过夜，转化到E．coliSM547感受态细胞，涂布在含100ug／ml氨苄青霉素(Amp)40ug／ml和BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸)的LB平板，37℃培养过夜，挑选指示EAP酶活性的蓝色菌落，提取其质粒，通过PstI酶切进而用DNA序列分析确定插入序列的正确性；2．融合蛋白的表达与提取将新鲜转化子细胞接种到含100ug／mlAmp的LB液体培养基，37℃、200rpm培养至600nm处光密度在0．5左右，加入Tetracycline(终浓度为0．2ug／ml(w／v))，总共培养20小时后离心(6000rpm，10min，4℃)收集细胞，用TMZP缓冲液(100mMTris含1×10-3MMgCl2，1×10-4MNaH2PO4，3．1×10-3MNaN3，和1×10-5MZnSO4，pH7．4)，洗涤细胞一次，离心弃上清，采用渗透压冰冻休克法处理细胞(常规方法)，使胞间质融合蛋白释放到溶液中，离心(8000rpm，20min，4℃)，收集上清液，4℃保存；3．融合蛋白纯化与浓缩采用Q-Sepharose离子交换柱层析法纯化融合蛋白，洗脱液为TMZP缓冲液，NaCl浓度梯度为0-0．3mmol／L，流速为1-2ml／min，在280nm和405nm处分别检测洗脱液的蛋白质和酶活性，收集酶活性最高的洗脱组分，在FILTRONTM超滤器浓缩，超滤膜切割分子量为10，000D，融合蛋白浓缩液于-20℃贮存。4．融合蛋白纯度和浓度鉴定纯度鉴定采用变性SDS-PAGE电泳法，浓缩胶3．9％，分离胶12％，电流强度10-15mA，电泳进行80分钟，常规的溴酚蓝染色和脱色，结果见图3。M为小分子量蛋白质电泳标准，融合蛋白样品泳道显示一条电泳纯蛋白带，分子量正确。继而以BSA(牛血清白蛋白)作为参照标准，用BIO-RAD蛋白质检测试剂盒测定样品融合蛋白质浓度。5．融合蛋白活性检测及动力学测定EAP能以pNPP(p-nitrophenolatephosphate)为底物，催化pNPP生成NP(nitrophenolate)，NP在405nm处有吸收峰。反应体系为Tris-HCl缓冲液(1．0mol／L，pH10．0)，pNPP母液浓度为20mmol／Ｌ。反应时分别加入3份融合蛋白样品，33份缓冲液和64份pNPP溶液，25℃摇动反应1分钟，于紫外分光光度计或平板读数仪405nm处测定光吸收值，确定产生的NP量，并由此检测酶活存在和计算酶比活(每毫克酶蛋白酶分钟催化产生的NP摩尔数)。空白对照实验除用3份缓冲液取代融合蛋白样品以外，其它条件均同。表1列出了融合蛋白EAP-LP-ST和融合蛋白EAP-ST的酶学动力学数据。与不含结合肽的融合蛋白EAP-ST相比，含结合肽的融合蛋白EAP-LP-ST酶比活和kcat都增加了大约20％，Km降低了40％，kcat／Km提高了1倍。这种变化意味着，链霉结合肽与EAP的直接融合对EAP的空间构象有负面作用，使酶的比活下降，酶与底物亲和性下降。在EAP和ST中间插入结合肽以后，增加了EAP与ST的分子间距离，使两者互不影响，克服了上述现象。表1融合蛋白EAP-LP-ST和EAP-ST的酶学动力学数据*U指每毫克蛋白每分钟水解底物pNPP的umol数。**kcat值是用二聚体分子量(分子量为94，000D)，由每个活性中心的Vmax值计算出来的。6．融合蛋白的固定化固定化是在包被链霉亲和素的玻璃载体上进行的，通过融合蛋白上的链霉结合肽与载体上链霉亲和素的专一性结合使酶蛋白固定在载体上。取用氢氟酸腐蚀成4×6的凹井阵列玻片，每一凹井加入0．5-1．0ul链酶亲和素(100ug／ml)，于4℃保温4小时。蒸馏水洗三次，加3％BSA溶液(w／v)封闭4小时。水洗后，在指定的凹井中加入1ul融合蛋白样品(10ug／ml)，保温2小时，用蒸馏水洗脱未固定的融合蛋白，固定完毕，4℃贮藏。7．固定化融合蛋白的酶活分析为使反应结果更加明显，改用NBT(氯化硝基四氮唑蓝)／BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸)为BAP的催化底物。在凹井中加入1ulNBT／BCIP试剂(华美公司)，保温(20-35℃)10分钟，可见蓝紫色信号出现。图4中，肉眼观察反应后斑点蓝紫色深度依次为BAP-LP-ST＞BAP-ST＞BAP(野生型)-LP-ST。通过计算机软件对各斑点扫描进行颜色深度定量，并进行t-测验，结果表明，A、C和D之间的颜色差异具有显著性。其中，三者当中任意两个平均差值大于t0．01×SD(8．52)。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果可实现定向固定，固定化酶的剩余活力高，均一性好，因此可以成为一种固定化酶的模式方法，以解决生物分子器件活性不稳定和互换性差的问题。权利要求1.一种控制固定化酶空间取向的方法，包括下列步骤A、基因融合，选择基因克隆和表达载体，通过基因操纵，将待固定的酶分子编码基因、连接肽编码序列和链霉结合肽基因依次拼接、构建酶与连接肽和链霉结合肽的融合基因，该融合基因编码的融合蛋白的一级结构为酶-(N)末端-[(甘氨酸-丝氨酸)n]-链霉结合肽，其中10≥n≥3；B、融合基因表达，将携带融合基因的质粒转化到受体细胞，在选择性平板上挑选阳性转化子，在液体培养基中表达出融合蛋白；C、融合蛋白制备，离心培养基、收集、洗涤细胞，提取蛋白粗品，然后分离、纯化融合蛋白，浓缩，4℃保存；D、融合蛋白鉴定，确定融合蛋白为电泳纯后，用光吸收法或BIO-RAD试剂盒测定样品中融合蛋白浓度；E、融合蛋白酶活性检测及动力学测定；F、融合蛋白的固定化，通过融合蛋白上的链霉结合肽与载体上链霉亲和素的专一性结合使酶蛋白定向固定在载体上，其活性中心朝向反应溶液；G、固定化融合蛋白的性能鉴定。全文摘要本发明公开了一种控制固定化酶空间取向的方法。其步骤是通过基因操纵构建和表达酶—连接肽—链霉结合肽融合蛋白,制备融合蛋白纯品,超滤浓缩,测定酶动力学;通过链霉结合肽与链霉亲和素的专一性结合,使酶分子定向固定在经链霉亲和素包被的固相载体上,其活性中心朝向反应溶液。融合蛋白为“锚—链”分子系统,其中链霉结合肽为“锚”,控制酶分子固定的方向,连接肽为“链”,能增加酶与链霉结合肽之间的分子距离,既保持两者各自空间活动的灵活性,又减小了链霉结合肽与链霉亲和素的结合反应的空间位阻,从而大大提高定向固定效率。该方法剩余酶活高,均一性好,是定向固定酶分子的一种模式方法,适合于制作高质量生物传感器、生物芯片等生物器件。文档编号C12N15/63GK1292417SQ0011595公开日2001年4月25日申请日期2000年8月11日优先权日2000年8月11日发明者张先恩,安东尼E·G·卡史,邵文海,刘虹,张治平申请人:中国科学院武汉病毒研究所,英国伦敦帝国理工医学院