一种生产木二糖的方法及其专用固定化酶的制作方法

专利名称：一种生产木二糖的方法及其专用固定化酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生产木二糖的方法及其专用固定化酶。
背景技术：
木二糖(Xylobiose)具有独特的生理功能和良好的工艺性能，甜度约为蔗糖的40％，甜味清爽柔和，可应用于食品、医药保健品等诸多领域，是低聚木糖的主要有效成分，也是低聚木糖的定性和定量成分，是功能性低聚糖研究的一个热点。其主要功能特性有1)显著的双歧杆菌增殖能力，可使双歧杆菌等有益菌群快速增殖，从而抑制肠道内有害菌群的生长。2)难消化性木二糖在人体消化系统中非常稳定，不能被唾液、胰液、小肠绒毛腺均质液等分解。可满足患有诸如糖尿病、肥胖病和高血脂症等特殊人群的需要。3)无龋齿性木二糖不能被口腔内变异链球菌等细菌分解成黏着性的单糖，无龋齿性并具有抗龋齿效果。另外，木二糖还具有良好的工艺性能同浓度下木二糖的水分活度与葡萄糖相近；在凝胶的冷冻解冻中，木二糖的保水性能优良，在5％～40％浓度下，保水性能高于蔗糖；木二糖还具有良好的酸碱稳定性和耐热性，在pH 2～8条件下，即使煮沸60min也不分解。
木二糖的制备主要采用水解木聚糖或半纤维素，再经过分离纯化获得。木聚糖是半纤维素的主要成分，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，是自然界中最主要的可再生资源之一。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由β-1，4-糖苷键相连的β-D-吡喃型木糖残基聚合而成，侧链上连着多种不同大小的短的取代基。不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，在一些农业废弃物中，如小麦杆、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等中，木聚糖含量非常高，一般都能高达30％以上，这些原料价廉易得，是制备木二糖的理想原料。
低聚木糖各单一组分除分子质量有所差别外，其它理化性质都比较接近，因此导致了单一组分分离困难且成本高昂。采用凝胶色谱柱法分离分析低聚木糖或制备少量高纯度的单一木二糖已有一些报道。凝胶柱层析技术处理量小、产品浓度低、操作要求高，所以目前该技术仅用于低聚木糖的分析和少量标准品的制备，并不适合木二糖的工业生产。木二糖水解得率低以及分离纯化困难，造成木二糖生产技术难度大和成本过高，价格昂贵，目前，木二糖产品仅能作为标准品出售和使用。以Sigma公司产的木二糖为例，95％纯度，5mg包装售价高达200美元。Megazyme公司的木二糖也售价高达134欧元/50mg。
β-1，4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能够以内切的方式作用于木聚糖的主链，得到不同聚合度的低聚木糖和少量的单糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶，也是生产低聚木糖的关键酶。目前关于低聚木聚糖的专利主要集中在酶法水解生产低聚木糖领域，如日本特开昭62-155095、JP02119791A2、06261750JPA2、JP10215866A2、JP10295372A2等。国内蔡敬民(ZL99126547.5)等用玉米芯、玉米秸杆、稻草等作为原料，碱法提取半纤维素(木聚糖)后，加酶水解生产低聚木糖；陶文沂(ZL00109788.1)等以麸皮、蔗渣或玉米芯为原料，碱法制备木聚糖，然后以突变株假单胞菌(Pseudomonas sp.XUN024)来源的木聚糖酶进行水解生产低聚木糖，低聚木糖产品中木二糖、木三糖含量占总糖组分90％以上；余世袁(ZL 02112568.6)等采用里氏木霉产木聚糖酶水解碱法提取精制木聚糖生产低聚木糖；本发明的发明人以前的专利(ZL 01131171.1)将原料玉米芯用碱金属氢氧化物预处理，在弱酸型催化剂如乙酸、甲酸、柠檬酸等作用下进行直热裂解，然后与木聚糖酶液反应制备低聚木糖。这些方法均能制备低聚木糖，但木二糖所占比例低。
与游离酶相比，固定化酶具有稳定性高，产物与酶分离回收容易，可多次重复使用，酶的利用效率高、可连续操作及自动化控制、工艺简便、生产成本低等一系列优点，成为现代酶工程领域的研究热点。工业化生产中，固定化载体通常采用环氧载体。环氧载体性质非常稳定，长期运输、储存及酶与载体长时间反应，载体都表现出很高的稳定性。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种固定化木聚糖酶及其制备方法。
本发明所提供的固定化木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤1)用金属螯合环氧载体Eupergit C 250L固定重组木聚糖酶XynB，得到固定化酶；2)将步骤1)得到的固定化酶悬浮于0.5-1.25M、pH为5.5-8.0磷酸盐缓冲液中，20-35℃反应12-60小时，得到固定化木聚糖酶。
所述重组木聚糖酶XynB是将核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列(由1079个脱氧核苷酸组成，参见中国专利ZL02156022.6)的木聚糖酶基因经大肠杆菌表达得到的木聚糖酶。
所述重组木聚糖酶XynB具体可按照如下方法制备以海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8DSM3109的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列是序列表中序列2和序列3的引物(参见中国专利ZL02156022.6)PCR扩增核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因，将PCR扩增到的木聚糖酶基因插入表达载体pET28a(+)(Novagen，美国)得到含有核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因的重组表达载体pET28a/XynB，将重组表达载体pET28a/XynB导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，诱导表达得到重组木聚糖酶XynB。
所述金属螯合环氧载体Eupergit C 250L固定化重组木聚糖酶XynB中的金属来自Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+。
所述步骤1)中，可按照下述方法用金属螯合环氧载体Eupergit C 250L固定重组木聚糖酶XynB环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸(IDA)活化后螯合金属离子Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+，再按80-1500U重组木聚糖酶XynB/g环氧载体Eupergit C 250L的比例加入重组木聚糖酶XynB，固定12-48h得到固定化酶。
实验证明Ni2+或Co2+的螯合环氧载体Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率比Cu2+和Zn2+螯合环氧载体Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率高20％。以Ni2+最优，Ni2+螯合环氧载体Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率达到70％以上。
其中，所述金属离子优选为Ni2+，所述重组木聚糖酶XynB与环氧载体EupergitC 250L的比例优为288U/g，所述固定时间优选为24h。
所述步骤2)中磷酸盐缓冲液的浓度优选为1M、pH 7.0，反应时间为48小时。
由上述方法制备的固定化木聚糖酶也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述任一种固定化木聚糖酶生产木二糖的方法。
本发明所提供的生产木二糖的方法，包括如下步骤1)对含木聚糖的纤维质原料进行汽爆或高温蒸煮处理，得到含有木聚糖溶出物的汽爆液或高温蒸煮液，将所述汽爆液或高温蒸煮液的pH调至5.5-7.0；2)将上述任一种固定化木聚糖酶装柱，在70～95℃下，将汽爆液或高温蒸煮液以1.0-8.0倍柱床体积/小时的流速过柱，收集流出液，得到木二糖溶液。
所述含木聚糖的纤维质原料为玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和小麦秸秆中的一种或其任意组合；所述汽爆或高温蒸煮可按常规方法进行，在多次试验的基础上确定的适宜条件是将所述含木聚糖的纤维质原料粉碎后，加入是所述含木聚糖的纤维质原料质量6-10倍的水，在160-180℃反应20-60min，收集滤液得到汽爆或高温蒸煮液。
所述含木聚糖的纤维质原料优选为玉米芯；所述汽爆或高温蒸煮处理条件优选为将玉米芯粉碎至40目-80目，加入是玉米芯质量8倍的水，在170℃反应为30min，收集滤液得到汽爆或高温蒸煮液，其聚合度为3-6。
步骤2)中，将固定化木聚糖酶装柱后，在90℃下，将pH为6.2的汽爆液或高温蒸煮液以1.5-4.0倍柱床体积/小时的流速过柱。
所述方法中还包括纯化流出液得到木二糖结晶的步骤。
所述纯化方法为将所述步骤2)收集的流出液过活性炭层析柱，先用去离子水洗净单糖和盐分，再用0-15％乙醇溶液线性洗脱得到木二糖，经过结晶得到木二糖结晶。
本发明固定化木聚糖酶的酶活力回收较高，稳定性和装柱后连续操作性能优良，便于连续化生产，且产物组成稳定易于控制；与游离重组木聚糖酶XynB相比，本发明固定化木聚糖酶的pH稳定性和热稳定性以及水解能力都有所提高，并具有良好的操作稳定性，水解操作简单，可节约酶的用量，还可实现酶与水解液的分离，大幅度降低生产成本并提高生产效率。
在进行酶水解前，采用汽爆或高温蒸煮处理玉米芯等农业废弃物，使玉米芯等农业废弃物中的木聚糖降解而成溶解状态，便于采用固定床反应器连续生产低聚木糖。利用本发明的固定化木聚糖酶在连续柱反应器中水解木聚糖溶出物。采用活性炭柱分离酶水解液并将分离所得木二糖组分浓缩后结晶得到木二糖晶体。分离木二糖的过程中仅用到乙醇和水，能够安全无污染的得到高纯度木二糖。
本发明解决了以农业废弃资源为原料生产高价值木二糖的诸多技术问题，不仅降低了生产成本，还可解决困扰多年的环境问题。所确定的汽爆和高温蒸煮条件有利于提高木聚糖的溶出率并使其聚合度控制在合适的范围。固定化酶载体和离子以及螯合条件使其在尽可能结合较多酶蛋白的同时具有较高的稳定性，固定化酶应用于木二糖的生产不仅节约了酶制剂还简化了后续分离过程。连续水解装置以及据此确定的水解条件在达到较好水解效果的同时，降低了劳动强度，提高劳动效率。因此，本发明具有巨大的经济效益和极高的社会效益。


图1为本发明利用固定化木聚糖酶生产结晶木二糖的工艺流程图2为Eupergit C 250L-Ni固定化XynB经过1M磷酸缓冲液处理前后的温度稳定性变化情况图3为游离XynB和Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最适pH曲线图4为游离XynB和Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最适温度曲线图5为固定化酶连续反应器系统示意6为活性炭柱层析分离玉米芯汽爆液的固体酶水解液的洗脱曲线图7为木二糖晶体的HPLC图
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明在多次试验的基础上确定一种具有工业化应用前景的生产结晶木二糖的方法。该方法首先将富含木聚糖的纤维质原料通过汽爆或高温蒸煮法获得适宜聚合度的木聚糖溶出物。选用能定向水解木聚糖溶出物为木二糖的重组木聚糖酶XynB，对固定化酶所用离子、载体及螯合条件进行了大量的实验研究，制备了固定化木聚糖酶，利用固定化木聚糖酶连续水解木聚糖溶出物。根据试验得出的分离条件，用活性炭柱分离酶水解液并将分离所得木二糖组分浓缩后结晶得到结晶木二糖。本发明利用固定化木聚糖酶生产结晶木二糖的工艺流程如图1所示。
实施例1、制备固定化木聚糖酶一、Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的制备1、XynB酶液的制备按照中国专利ZL 02156022.6的实施例2、实施例3、实施例4、至实施例5第一段描述的方法获得粗酶液。具体方法如下(1)木聚糖酶基因xynB的扩增所使用的引物为TM-XynB-Nco I-FWD和TM-XynB-Hind-His-REV，其序列分别如下所示TM-XynB-Nco I-FWD5’-CCATGGAAA TATTACCTTC TGTGTGAT(序列2)TM-XynB-Hind-His-REV5’-AAGCTTT CTTTCTTCTA TCTTTTTCTC CA(序列3)根据保藏于德国微生物保藏中心(DSM)的海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8DSM3109的xynB基因的全序列，设计上述一对引物，引物上引入能插入pET28a(+)(Novagen，美国)质粒的NcoI-Hind III酶切位点。在设计TM-XynB-Nco I-FWD正向引物时，考虑到在表达载体中C-末端带6×His标签，在5′端由引物导入一个密码子突变即ATGA*AA…→ATGG*AA…，这样翻译后从NcoI酶切位点第二个氨基酸由K变为E。根据引物设计的这一突变确保目的基因克隆于开放阅读框内，同时具有ATG起始密码子和6×His标签序列，而不会发生开放阅读框漂移。
以海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8的基因组DNA为模板，采用聚合酶进行xynB基因的PCR扩增，PCR扩增反应混合物为海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8的基因组DNA，1μL；10×KOD-Plus buffer，2.5μL；2mM dNTP，2.5μL；25mM MgSO4，1.5μL；100pM TM-XynB-Nco I-FWD，0.5μL；100pM TM-XynB-Hind-His-REV，0.5μL；1Unit/μL KOD-Plus，0.5μL；H2O，16μL；反应混合物总体积为25μL。
PCR扩增反应的条件为循环参数为98℃，5min；98℃，30seconds，62℃，1min和68℃，1min，22个循环后68℃延伸10min，然后冷却至4℃，反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外下照射，切下目标DNA，然后采用QIAquick GelExtraction kit(QIAGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA，即为扩增出的xynB基因DNA片段。
(2)PCR产物的克隆和DNA序列测定PCR扩增反应之后，采用拓扑TA克隆将xynB基因片段克隆到pCR-2.1Topo质粒(Invitrogen公司)载体上，用菌落PCR方法筛选带有重组子的菌落。然后，使用pCR-2.1Topo质粒载体上的标准引物序列作为引物测xynB基因的DNA序列，将含有正确xynB基因序列(序列表中的序列1)的重组质粒pCR2.1-Topo 10/xynB提纯供进一步亚克隆和表达用。
3、木聚糖酶基因xynB的亚克隆和在大肠杆菌中的表达所使用的表达基因载体为pET28a(+)，是常用的表达载体之一，靶基因克隆于pET28a(+)载体上，使其表达置于T7噬菌体强启动子转录及翻译信号控制之下。由于Thermotoga属的基因在大肠杆菌中表达较难，研究设计使xynB基因的C末端带有6×His标签(tag)，这样表达出的目标蛋白质带有6×His tag，利用6×His tag与Ni-NTA的亲和性，可将表达出的重组蛋白进行亲和层析提纯，这样可方便快速地纯化表达的酶。NcoI-Hind III酶切位点pET28a(+)载体的编码了羧基端6×His标签，可以用羧肽酶除去His标签。实际上，在蛋白质分子上接上6×His纯化标签，这种修饰对蛋白质的表达、折叠和生物学活性均无影响。
提取已经确定正确DNA序列的Topo克隆的质粒pCR2.1-Topo 10/xynB，分别用一对限制性内切酶NcoI和HindIII酶切，在紫外下照射，观察电泳后的琼脂糖凝胶，并迅速切下目标DNA。然后采用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA，回收的DNA片段即为所要插入的xynB基因。采用同样酶切方法制备pET28a(+)载体，将制备好的xynB基因片段和pET28a(+)载体混合，并加入ligation High T4 DNA ligase kit(TOYOBO公司)在16℃下连接4h。然后用电穿孔法转入感受态细胞E.coli BL21，将100μL菌液涂在含卡那霉素抗性的LB平板上，于37℃过夜培养。将生长出的单菌落标号，采用菌落PCR筛选带重组质粒的菌落。提取几个阳性菌落的质粒，进行双酶切电泳和DNA序列测定，经鉴定正确的质粒即为含有xynB基因的重组质粒，命名为pET28a/XynB。同时所得阳性克隆菌落，经诱导培养后进行酶的表达实验。将完全正确且符合要求的菌落作为菌种保存备用。
4、重组木聚糖酶B的表达和初步纯化新鲜制备100mL含有重组质粒pET28a/XynB的E.coli BL21，接种于1000mL含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani broth(LB)培养基，在30℃的摇床中培养，摇床转速为150rpm。测定培养液在600nm下的吸光度的变化，当吸光度达0.5-0.6时，加入1mL的1M IPTG诱导，再继续培养16h。用冷冻离心机将培养液在4℃下以离心10min，离心力为29200×g，收获细菌沉淀，用50mL磷酸缓冲溶液(50mM，pH 8.0)悬浮。在冰水浴中用超声波细胞破碎机破碎细菌细胞，将破碎液在4℃下以离心10min，离心力29200×g，所得上清液即为粗酶液。将所得粗酶液在90℃下处理10min，在4℃下以离心10min，离心力29200×g，所得上清液即为固定化用游离酶XynB，置4℃下储存备用。
2、XynB酶的Eupergit C 250L-Ni固定化称取10g Eupergit C 250L(多孔丙烯酸微球，由甲基丙烯酰氨、N，N’-亚甲基-双-(甲基丙烯酰氨)缩水甘油甲基丙烯酸酯形成的含环氧官能团的聚合物，孔径为100nm，德国Rohm Pharma公司产品)，加入80mL硼酸钠-亚氨基二乙酸(IDA)缓冲液(硼酸钠浓度为0.1M，亚氨基二乙酸浓度为2M，氢氧化钠调节pH至8.5)，于30℃水浴摇床中反应2h，摇床转速为150rpm(旋转半径50mm)。玻璃砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗三次，得到40g(湿态)经亚氨基二乙酸活化的EupergitC 250L，记为IDA-Eupergit C 250L。将40g IDA-EupergitC 250L悬浮于200mL磷酸缓冲溶液(pH 6.0，50mM)中，并加入2.016g NiCl2·6H2O和11.688g NaCl，150rpm(旋转半径50mm)，30℃水浴摇床中反应2h后玻璃砂芯漏斗真空抽滤，得到Ni螯合环氧载体Ni-IDA-Eupergit C 250L。
将Ni螯合环氧载体Ni-IDA-Eupergit C 250L悬浮于200mL(pH7.0，50mM)磷酸缓冲液中，并加入含木聚糖酶活力分别为800U、2880U、4000U、8000U的XynB酶液25mL，150rpm(旋转半径50mm)，30℃水浴摇床中反应48h后玻璃砂芯漏斗真空抽滤，得到Eupergit C 250L-Ni固定化XynB。测定滤液中木聚糖酶XynB的酶活，以确定Eupergit C 250L与XynB的最佳配比。酶活测定结果表明，80-800U XynB可被1g Eupergit C 250L对应的Ni-IDA-Eupergit C 250L完全吸附，综合考虑加酶量与酶活回收率、固定化酶绝对酶活力及固定化酶比酶活等因素的关系，加酶量选为288U/g Eupergit C 250L。
其中，采用4-羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)法测定木聚糖酶XynB的酶活。游离XynB的酶活测定方法10μL经适当稀释的酶液加入到190μL的底物中(0.25％的可溶燕麦木聚糖，50mM柠檬酸缓冲液为缓冲体系pH 6.2)，70℃反应10min，加入400μL PHBAH试剂终止反应，沸水中煮6min，在420nm下测吸光度值。一个酶活力单位(U)定义为在上述实验条件下，在1mL反应体系中每分钟生成1μmol木糖所需要的酶量。
固定化XynB酶活力测定方法称取一定量的固定化XynB酶，加入190μL的0.25％的可溶燕麦木聚糖，50mM柠檬酸缓冲液为缓冲体系pH 6.2，70℃反应10min，加入400μL PHBAH试剂终止反应，沸水中煮6min，在420nm下测吸光度值。一个酶活力单位(U)定义为在上述实验条件下，在1mL反应体系中每分钟生成1μmol木糖所需要的酶量。
3、提高Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的温度稳定性Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在高温下(90℃)稳定性较差，在90℃下处理30min后酶活保持率(处理后的剩余酶活/初始酶活)只有55％。为了能够提高Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的温度稳定性，以便固定化酶能够适应高温操作的环境，采用促进酶分子与载体多点共价交联的办法，提高固定化酶的温度稳定性。具体方法如下将0.5g Eupergit C 250L-Ni固定化XynB悬浮于2.5mL、1M、pH 7.0的磷酸缓冲液中以提高固体酶的热稳定性，150rpm(旋转半径50mm)，30℃水浴摇床中振荡48h后玻璃砂芯漏斗真空抽滤，得到经1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB，于4℃冷藏备用。以未经1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在70℃、pH 6.2酶活力为100％，按照下述方法测定经过上述1M磷酸缓冲液处理前后的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的温度稳定性将经1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB和未经1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB分别在90℃下处理30min，取出立即放冰水浴中冷却10min，用玻璃砂心漏斗抽滤，按上述酶活测定方法测定经1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB和未经1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB热处理前后的酶活。
结果如图2所示，表明Eupergit C 250L-Ni固定化XynB经过1M磷酸缓冲液处理前后的温度稳定性变化情况。未经过上述1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB当在90℃下处理30min后相对酶活保持率仅为55％。如果将Eupergit C 250L-Ni固定化XynB先用1M磷酸缓冲液处理，则固定化酶的耐热性有较大提高，其中磷酸缓冲液处理过程中有部分酶活损失，70℃、pH 6.2酶活保持率为87.6％。然后在90℃下保温30min，最终酶活保持率86.8％。比未经过磷酸缓冲液处理的固定化酶最终酶活保持率提高了32％。图2中，1，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB；2，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在90℃下处理30min；3，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB经1M磷酸缓冲液处理48h；4，1M磷酸缓冲液处理48h后Eupergit C 250L-Ni固定化XynB在90℃下处理30min。
4、经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的的特性(1)游离XynB和经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最适pH具体测定方法如下采用不同缓冲体系配成一系列浓度为200mM的缓冲液，pH值范围为2.18～11.78。缓冲体系和pH范围分别为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH2.18～6.0；Tris-HCl缓冲液，pH 7.0～9.0；甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 8.8～11.78。用以上缓冲液稀释4倍替代标准酶活力测定中的0.05M、pH 6.2的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，测定酶活力，以最大值为100％。
结果如图3所示，表明经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB最适pH值范围变宽了，5.1-6.6范围内相对酶活较高。在酸性环境下，经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的相对酶活较游离XynB高。图3中，○示游离酶，●示固定化酶。
(2)游离XynB和经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最适温度具体测定方法如下在pH 6.2，浓度为50mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系中，反应时间为10min，在不同温度下(40～100℃)测定酶活力，以最大值为100％。结果如图4所示，表明经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB酶活随着温度的升高逐渐升高，100℃的酶活依然没有下降。经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的最适温度提高到100℃，经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB与游离XynB相比，温度稳定性较游离XynB也有所提高，经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB操作稳定性很高，90℃间歇水解半衰期为62次(每次水解时间45min)，90℃下连续水解木聚糖半衰期为577.6h。图4中，○示游离酶，●示固定化酶。
二、Eupergit C 250L-Co固定化XynB的制备1、XynB酶液的制备同步骤一中的1。
2、XynB酶的Eupergit C 250L-Co固定化称取10g Eupergit C 250L，加入80mL硼酸钠-亚氨基二乙酸(IDA)缓冲液(硼酸钠浓度为0.1M，亚氨基二乙酸浓度为2M，氢氧化钠调节pH至8.5)，于30℃水浴摇床中反应2h，摇床转速为150rpm(旋转半径50mm)。玻璃砂芯漏斗过滤后，用蒸馏水冲洗三次，得到40g IDA-Eupergit C 250L。将40g IDA-EupergitC250L悬浮于200mL磷酸缓冲溶液(pH 6.0，50mM)中，并加入2.3793g CoCl2·6H2O和11.688g NaCl，150rpm(旋转半径50mm)，30℃水浴摇床中反应2h后玻璃砂芯漏斗真空抽滤，得到Co螯合环氧载体Co-IDA-Eupergit C 250L。
将Co螯合环氧载体Co-IDA-Eupergit C 250L悬浮于200mL(pH 7.0，50mM)磷酸缓冲液中，并加入含木聚糖酶活力分别为800U、2880U、4000U、8000U的XynB酶液25mL，150rpm(旋转半径50mm)，30℃水浴摇床中反应48h后玻璃砂芯漏斗真空抽滤，得到Eupergit C 250L-Co固定化XynB。测定滤液中木聚糖酶XynB的酶活，以确定Eupergit C 250L与XynB的最佳配比。酶活测定结果表明，120-600U XynB可被1g Eupergit C 250L对应的Co-IDA-Eupergit C 250L完全吸附，综合考虑加酶量与酶活回收率、固定化酶绝对酶活力及固定化酶比酶活等因素的关系，加酶量选为232U/g Eupergit C 250L。
3、提高Eupergit C 250L-Co固定化XynB的温度稳定性的方法中，除将EupergitC 250L-Ni固定化XynB换为Eupergit C 250L-Co固定化XynB，其余方法同步骤一中的3。
以未经磷酸缓冲液处理过的Eupergit C 250L-Co固定化XynB在70℃、pH 6.2酶活力为100％，结果表明Eupergit C 250L-Co固定化XynB在90℃下处理30min后酶活保持率仅为49％。如果将Eupergit C 250L-Co固定化XynB先用1M磷酸缓冲液处理，则固定化酶的耐热性有较大提高，其中磷酸缓冲液处理过程中有部分酶活损失，70℃、pH 6.2酶活保持率为86.2％。然后在90℃下保温30min，最终酶活保持率82.3％，比未经过磷酸缓冲液处理的固定化酶最终酶活保持率提高了33.3％。
4、经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的的特性(1)游离XynB和经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的最适pH测定方法同步骤一。结果表明经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C250L-Co固定化XynB最适pH值范围变宽了，pH 5.3-6.5范围内相对酶活较高。
(2)游离XynB和经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的最适温度测定方法同步骤一。结果表明经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C250L-Co固定化XynB酶活随着温度的升高逐渐升高，100℃的酶活依然没有下降。经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB与游离XynB相比，pH稳定性有所提高，经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB的最适温度提高到100℃，温度稳定性较游离XynB也有所提高，经过步骤3的1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Co固定化XynB操作稳定性很高，90℃间歇水解半衰期为57次(每次水解时间45min)，90℃下连续水解木聚糖半衰期为496.6h。
三、测定Eupergit C 250L-Ni固定化XynB、Eupergit C 250L-Co固定化XynB、Eupergit C 250L-Cu固定化XynB和Eupergit C 250L-Zn固定化XynB的木聚糖酶的酶活回收率按Eupergit C 250L-Ni固定化XynB的方法制备Eupergit C 250L-Cu固定化XynB和Eupergit C 250L-Zn固定化XynB，称取1g固定化XynB(酶活为300U)，加入5mL磷酸钠盐缓冲溶液(pH 7.0，50mM)，于25℃水浴摇床中反应48h，摇床转速为150rpm(旋转半径50mm)。抽滤至干，分别测定固定化酶活力，酶活回收率为固定化酶活/总酶活，其中总酶活为300U。试验结果表明，Eupergit C 250L-Ni固定化XynB或Eupergit C 250L-Co固定化XynB的酶活回收率比Eupergit C250L-Cu固定化XynB和Eupergit C 250L-Zn固定化XynB的木聚糖酶的酶活回收率高20％。以Ni2+最优，Ni2+螯合环氧载体Eupergit C 250L固定化木聚糖酶的酶活回收率达到70％以上。
实施例2、汽爆液或高温蒸煮液的制备一、玉米芯汽爆液或高温蒸煮液的制备1、汽爆液的制备称取100g玉米芯(含木聚糖32.4％)，按1∶8的固液比加入蒸馏水800mL，室温浸泡12h后加入高压罐中，加盖密封，加热，温度控制在165～170℃维持30min后立即打开球型阀，释放物料到收集罐中。待所收集的物料温度降至60～70℃时抽滤，滤液即为汽爆液。冷却至室温后测定其总糖及还原糖含量。其中，还原糖含量测定采用Somogyi法，以D-木糖为标准。总糖测定采用Orcinol-HCl法，以D-木糖为标准。平均聚合度(DP值)＝总糖含量/直接还原糖含量。结果表明总糖含量22.0mg/mL，还原糖含量4.66mg/mL，DP＝4.72。
用1M NaOH溶液将汽爆液pH调节至6.2，4℃冰箱冷藏备用。
2、高温蒸煮液的制备固液比1∶8，即每100g玉米芯(含木聚糖32.4％)中添加800mL水，加热至170℃-175℃、保温时间30min，保温过程中不断搅拌，搅拌速度为60rpm，反应结束后迅速通入冷却水冷却至室温，取出反应混合物，经布什漏斗抽滤，收集滤液得到高温蒸煮液，测定其总糖及还原糖含量。其中，还原糖含量测定采用Somogyi法，以D-木糖为标准。总糖测定采用Orcinol-HCl法，以D-木糖为标准。平均聚合度(DP值)＝总糖含量/直接还原糖含量。结果表明总糖含量19.6mg/mL，还原糖含量3.80mg/mL，DP＝5.16。
用1M NaOH溶液将高温蒸煮液pH调节至6.2，4℃冰箱冷藏备用。
实施例3、利用实施例1的固定化木聚糖酶连续水解实施例2汽爆液或高温蒸煮液1、用1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB柱水解实施例2玉米芯汽爆液或高温蒸煮液实验设3个重复。每个重复在内径15mm的不锈钢夹套层析柱中加入40g湿态(由10g Eupergit C 250L制备)1M磷酸缓冲液处理的Eupergit C 250L-Ni固定化XynB，酶床实际高度为33cm，连接恒流泵和部分收集器(图5)，用50mM，pH 6.2的柠檬酸缓冲液平衡30min。底物为玉米芯汽爆液或高温蒸煮液，其中，玉米芯汽爆液总糖含量22.0mg/mL，还原糖含量4.66mg/mL；玉米芯高温蒸煮液总糖含量19.6mg/mL，还原糖含量3.80mg/mL。使不锈钢夹套的温度保持90℃，底物流速1.5倍柱床体积/h连续反应，收集流出液(水解液)，用HPLC分析流出液糖组成以及采用Somogyi法，以D-木糖为标准测定流出液中还原糖含量。合并并浓缩流出液用于制备木二糖。其中，高效液相分析(HPLC)采用KS-802型糖柱，柱温80℃；流动相为超纯水，流速0.6mL/min；采用视差检测器，检测温度45℃。
结果表明玉米芯汽爆液水解产物主要以木二糖为主，HPLC测得其糖组分及比例为阿拉伯糖∶木糖∶木二糖∶木三糖∶木四糖∶木五糖＝6.1∶12.7∶27.9∶5.4∶2.9∶1.0；木二糖所占比例为49.8％，单糖为33.6％，其他寡糖为16.6％。
玉米芯高温蒸煮液水解产物主要以木二糖为主，HPLC测得其糖组分及比例为阿拉伯糖∶木糖∶木二糖∶木三糖∶木四糖∶木五糖＝5.6∶10.5∶25.8∶5.2∶2.8∶1.3；木二糖所占比例为50.3％，单糖为31.4％，其他寡糖为18.7％。
实施例4、活性炭柱分离和木二糖结晶将活性炭柱(直径3.5cm，高45cm，内装层析用活性炭85g)用去离子水以流速为110mL/h平衡12h后备用。取实施例3玉米芯汽爆液连续水解液浓缩至200mL，总糖16.0g(总糖含量为80mg/mL，还原糖含量为48mg/mL)，木二糖为7.97g。将含总糖为16g的浓缩液以流速110mL/h上样，结束后开始进行程序洗脱，洗脱速度稳定在110mL/h，洗脱程序为去离子水水洗1L以洗净单糖和盐分，再用0-15％乙醇溶液(总体积8L)线性洗脱72.7小时，洗脱液全部用自动部分收集器收集，1瓶/h，110mL/瓶，线性洗脱后采用50％乙醇溶液1L洗脱并收集。测定所收集的每瓶糖液的总糖含量，并TLC检测糖组成。合并木二糖组分。其中，薄层层析法(TLC)薄层板采用硅胶板(Merck，Gel Plate F254)；展层系统采用乙腈∶水＝85∶20(v/v)；5％硫酸甲醇溶液蘸板，晾干后100℃显色2min。
活性炭层析分离酶解液的结果见图6，表明0-15％乙醇溶液线性洗脱能很好的发挥活性炭柱层析的分离效果，得到明显的2个峰，分别对应了水解液单糖(图6中第一个峰，即第4瓶-第7瓶洗脱液，110mL/瓶)和木二糖(图6中第二个峰，以X2(8-38)示，第8瓶-第38瓶洗脱液，110mL/瓶)。说明先用的770mL去离子水完全洗净单糖和盐分，再用0-15％乙醇溶液线性洗脱33小时(3300ml)就可将木二糖完全洗脱。
结果表明收集所得总糖共计14.49g，总糖回收率为90.5％。含木二糖单一组分的收集液中总糖为6.67g，木二糖的回收率为83.4％，占收集液中总糖的46.0％。最后合并含单一木二糖组分的收集液于55℃真空浓缩至过饱和糖浆状态，加入木二糖晶种，室温静置等待结晶。共得到晶体5.51g，晶体的收得率为34.4％。晶体熔点为184-186℃。经HPLC测定纯度为99.1％且保留时间(图7)与标准品一致。图7中，X2示木二糖。
木二糖晶体收得率(％)＝木二糖晶体质量/原料中木聚糖质量×100。
序列表<160>3<210>1<211>1079<212>DNA<213>海栖热袍菌(Thermotoga maritima)<400>1atggaaatat taccttctgt gttgatcctt ttgttgggat gtgttccagt tttcagctct 60cagaatgtat ctctgagaga actcgcagaa aagctgaaca tctatattgg ttttgccgca120atcaacaact tttggtctct ttccgacgca gaaaagtaca tggaagttgc aagaagagaa180ttcaacatcc tgacccctga gaaccggatg aagtgggata cgattcatcc agaaagagac240agatacaatt tcactcccgc agaaaaacac gttgagtttg cagaagaaaa cgacatgatc300gtgcatggac acactcttgt ctggcacaac cagcttcctg gatggatcac tggtagagaa360tggacaaagg aagaactttt gaacgttctt gaagaccaca taaaaacggt ggtgtctcat420ttcaaaggta gagtgaagat ctgggatgtg gtgaacgaag cggtgagcga ttctggaacc480tacagggaaa gcgtgtggta caagacgatc ggtcctgaat acattgaaaa agcgttcaga540tgggcgaaag aagccgatcc agatgcgatt ctcatctaca acgactacag catagaagaa600atcaacgcaa aatcgaantt cgtctacaac atgataaaag agctgaaaga aaagggagta660cctgttgatg gaataggatt tcagatgcac atagactaca gagggctcaa ttatgacagt720ttcagaagga atttggagag atttgcgaaa ctcggtcttc aaatatacat cacagagatg780gatgtgagaa ttcctctcag tggttcggag gagtattatt tgaaaaaaca ggctgaagtt840tgtgcgaaga tcttcgatat atgcttggac aaccctgcag ttaaagcgat ccagttttgg900ggattcacag acaaatactc ctgggttccc ggctttttca aagggtacgg gaaagcgttg960ctcttcgatg agaattacaa ccccaagcct tgttattacg cgataaaaga ggtgctggag 1020aaaaagatag aagaaagaaa aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccac1079<210>2<211>27<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ccatggaaat attaccttct gtgtgat27<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3aagctttctt tcttctatct ttttctcca 29
权利要求
1.一种固定化木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤1)用金属螯合环氧载体Eupergit C 250L固定重组木聚糖酶XynB，得到固定化酶；2)将步骤1)得到的固定化酶悬浮于0.5-1.25M、pH为5.5-8.0磷酸盐缓冲液中，20-35℃反应12-60小时，得到固定化木聚糖酶；所述重组木聚糖酶XynB是将核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因经大肠杆菌表达得到的木聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组木聚糖酶XynB按照如下方法制备以海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8 DSM3109的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列是序列表中序列2和序列3的引物PCR扩增核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因，将PCR扩增到的木聚糖酶基因插入表达载体pET28a(+)得到含有核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因的重组表达载体pET28a/XynB，将重组表达载体pET28a/XynB导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，诱导表达得到重组木聚糖酶XynB。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述金属螯合环氧载体Eupergit C250L固定化重组木聚糖酶XynB中的金属来自Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+；所述步骤1)中按照下述方法用金属螯合环氧载体Eupergit C 250L固定重组木聚糖酶XynB环氧载体Eupergit C 250L经亚氨基二乙酸活化后螯合金属离子Cu2+、Co2+、Zn2+或Ni2+，再按80-1500U重组木聚糖酶XynB/g环氧载体Eupergit C 250L的比例加入重组木聚糖酶XynB，固定12-48h得到固定化酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述金属离子为Ni2+，所述重组木聚糖酶XynB与环氧载体Eupergit C 250L的比例为80-800U/g，优选为288U/g，所述固定时间为24h。
5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤2)中磷酸盐缓冲液的浓度为1M、pH 7.0，反应时间为48小时。
6.由权利要求1至5中任一所述方法制备的固定化木聚糖酶。
7.一种利用权利要求6所述的固定化木聚糖酶生产木二糖的方法，包括如下步骤1)对含木聚糖的纤维质原料进行汽爆或高温蒸煮处理，得到含有木聚糖溶出物的汽爆液或高温蒸煮液，将所述汽爆液或高温蒸煮液的pH调至5.5-7.0；2)将权利要求6所述的固定化木聚糖酶装柱，在70～95℃下，将汽爆液或高温蒸煮液以1.0-8.0倍柱床体积/小时的流速过柱，收集流出液，得到木二糖溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述含木聚糖的纤维质原料为玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳和小麦秸秆中的一种或其任意组合；所述汽爆或高温蒸煮按照如下方法处理将所述含木聚糖的纤维质原料粉碎后，加入是所述含木聚糖的纤维质原料质量6-10倍的水，在160-180℃反应20-60min，收集滤液得到汽爆或高温蒸煮液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述含木聚糖的纤维质原料为玉米芯；所述汽爆或高温蒸煮处理条件为将玉米芯粉碎至40目-80目，加入是玉米芯质量8倍的水，在170℃反应为30min，收集滤液得到汽爆或高温蒸煮液。
10.根据权利要求7、8或9所述的方法，其特征在于步骤2)中，将固定化木聚糖酶装柱后，在90℃下，将pH为6.2的汽爆液或高温蒸煮液以1.5-4.0倍柱床体积/小时的流速过柱。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述方法中还包括纯化木二糖溶液得到木二糖结晶的步骤；所述纯化方法为将所述步骤2)收集的流出液过活性炭层析柱，先用去离子水洗净单糖和盐分，再用0-15％乙醇溶液线性洗脱得到木二糖，经过结晶得到木二糖结晶。
全文摘要
本发明公开了一种制备木二糖的方法及其专用固定化酶。本发明的固定化木聚糖酶按照包括如下步骤的方法制备1)用金属螯合环氧载体Eupergit C 250L固定重组木聚糖酶XynB，得到固定化酶；2)将步骤1)得到的固定化酶悬浮于0.5－1.25M、pH为5.5－8.0磷酸盐缓冲液中，20－35℃反应12－60小时，得到固定化木聚糖酶；所述重组木聚糖酶XynB是将核苷酸序列是序列表中序列1的DNA序列的木聚糖酶基因经大肠杆菌表达得到的木聚糖酶。该固定化木聚糖酶的酶活力回收较高，稳定性和装柱后连续操作性能优良，便于连续化生产，且产物组成稳定易于控制；利用该固定化木聚糖酶生产木二糖，水解操作简单，可节约酶的用量，还可实现酶与水解液的分离，大幅度降低生产成本并提高生产效率。因此，该方法是一种适宜工业化生产木二糖的方法。
文档编号C12N9/24GK1916171SQ200610113099
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月11日 优先权日2006年9月11日
发明者江正强, 李里特, 李道义, 朱运平 申请人:中国农业大学