专利名称：从悬铃木组织中抽提总rna的方法
技术领域：
本发明涉及悬铃木分子生物学技术领域。具体涉及从悬铃木组织中抽提与纯化用于分子生物学的RNA的方法。
背景技术：
RNA的抽提是进行分子生物学研究的基础。高质量RNA的获得对于功能基因组学以及遗传学研究具有重要意义。有关植物RNA的抽提方法较多，现有的方法主要有Trizol Kit法(Trizol reagent.Product descriptionTRIZOL reagent.Manufacturer protocol(1995)Life Technologies，Gaithersberg，MD.)；异硫氰酸胍法(Chomczynski P and Sacchi N(1987)Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem 162156-159.)；SDS/酚法(Gehrig HH，Winter K，Cushman J，Borland A，and Taybi T(2000)An improved RNA isolation method for succulent plant species richin polyphenols and polysaccharides.Plant Mol Biol Rep 18369-376.)和CTAB-LiCl法(Langridge J，Langridge P，and Bergquist PL(1980)Extraction of nucleic acids from agarose gels.Anal Biochem 103264-271.)等几种，其中CTAB-LiCl法在多种动、植物中抽提RNA上具有广泛的应用，是一种有效、经济的RNA抽提方法。悬铃木被誉为“行道树之王”(陈有民，园林树木学，北京中国林业出版社，1990)，是一种乔木类木本园林植物，其组织和器官中富含多酚和次生代谢物质，按照传统方法抽提DNA、RNA和蛋白质等抽提方法在悬铃木上应用比较困难。
近年来有关悬铃木生物大分子(例如DNA、RNA和蛋白质等)的分离纯化受到分子生物学技术领域科技人员的重视，有关DNA的抽提方法的改良促进了悬铃木分子生物学在DNA水平的发展。但近年来国内外有关从悬铃木组织和器官中抽提RNA的方法却未见报道。
从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是进行Northern杂交、RT-PCR、cDNA文库构建和差别显示分析等分子生物研究的关键。现在虽然有一些较为成熟的总RNA的分离方法能成功地从不同植物或不同组织中提取出RNA，但是从不同的材料或相同材料不同部位提取RNA时难度不同，因此需针对生物材料的具体特点选择适宜的RNA提取方法。在悬铃木植物组织中，不仅酚类化合物及次生代谢产物的含量较高，而且RNase的活性较高，这些因素导致RNA提取难度增大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种新的从悬铃木组织中抽提高质量总RNA的方法，该方法采用改进的CTAB-LiCl法抽提，样品沉淀并溶解后再纯化，以获取悬铃木组织高质量的总RNA样品。本发明的方法快速、经济，适用于悬铃木分子生物学操作。
本发明人经过大量的研究和对比实验，研究出满足本发明目的的一种从悬铃木组织中抽提总RNA的方法。它包括下述步骤1.悬铃木总RNA的粗提(1)采样将悬铃木新鲜的或低温保存的组织(花序、叶片或无菌苗)置于液氮中，得到样品1；(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；(3)取1-2g步骤(1)中样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴5min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下离心10min，回收上清液；(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下离心10min，回收上清液；(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后于-20℃静置8-16h，于4℃条件下离心20min，得到RNA沉淀；(7)将步骤(6)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA的粗提物。
2.悬铃木总RNA的纯化(1)将上述步骤制备的总RNA粗提物用400μlD DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下离心6min，回收上清液；(2)将步骤(1)所得上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，4℃条件下离心10min，收集下层水相；(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃条件下离心30min，得到RNA沉淀；(4)将步骡(3)得到的沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的总RNA。
在上述步骤中所用到的药品配方如下RNA抽提缓冲液CTAB buffer包含0.1M Tris-Hcl，25mM EDTA，2％CTAB，2％PVP(soluble PVP 40，Sigma，USA)，2M NaCl；bu/CTAB(正丁醇-CTAB)和aq/CTAB(水饱和CTAB)在DEPC灭过菌的分液漏斗中各加75mL正丁醇和双蒸水，让两相静置分离(上层相为正丁醇)4小时；然后加1.84g CTAB至50mL水饱和的正丁醇，再加50mL正丁醇饱和的水，用分液漏斗摇匀，静置过夜至两相分层(上层相为bu/CTAB，下层相为aq/CTAB)，分别保存备用；离心转速为9000rpm/min-12000rpm/min；氯仿/异戊醇溶液为氯仿和异戊醇按体积比24∶1混合而成；75％的乙醇是由3份体积的无水乙醇和1份体积的水混合而成；水为用0.1％的DEPC处理并经高压灭菌的超纯水；玻璃器皿于140℃灭活RNase；优选地，所用的悬铃木组织材料是新鲜的。
上述本发明的方法能有效抑制酚类物质对总RNA提取的影响，能够从花序和叶片中获得质量高、完整性好的总RNA，28SrRNA亮度约18SrRNA的2倍，完全适于进行RT-PCR等研究，为利用同源序列法克隆基因、构建文库和Northern杂交提供了前提。
本发明的有益效果是本发明对现有技术的贡献主要体现在以下方面本发明在RNA抽提缓冲液中增加了聚乙烯吡咯烷酮40，并可根据悬铃木样品中多酚的含量适当调整其用量，并且还利用了β-巯基乙醇有效防止了多酚的氧化。
在利用氯仿/异戊醇和氯仿溶液对样品混合液进行了两次抽提后利用LiCl进行了一次总RNA粗抽物的沉淀，一方面有效减少了后续操作中溶液的体积，同时通过氯仿的抽提减少了溶液中次生代谢物质的含量。
与报道的CTAB-LiCl不同，本发明创新之处在于先用氯仿/异戊醇抽提，再用纯氯仿进行抽提，然后用LiCl沉淀得到总RNA粗提物后，再利用bu/CTAB和aq/CTAB来纯化，最后用乙醇沉淀还有效减少了多糖的共沉淀，提高了RNA的质量。
本发明对于悬铃木的不同组织都适用。已经利用本发明从悬铃木的花序、叶片、无菌苗等不同组织中成功抽提出高质量的总RNA。
本发明对长期保存的、不同时期的悬铃木的混合花序组织(如本年度2月、7月，上一年8月、10月、12月取样并保存的花序)也能成功抽提出高质量的RNA。
本发明经济，高效。本发明所使用的药品大都为普通的生化试剂，价格低廉，没有利用试剂盒或昂贵的约品，也没有用到苯酚、硫氰酸胍等有毒物质。从处理时间上来看，没有过夜沉淀，一般上午提取，晚上即可纯化，完成全部实验有利于制备效率的提高。
图1本发明与对照方法对悬铃木花序和叶片总RNA的提取效果比较，图中泳道1、2分别为悬铃木的花序和叶(采用异硫氰酸胍法制备)；3、4分别为悬铃木的花序和叶片(采用Trizol Kit法制备)；5，6分别为悬铃木花序和叶片(采用SDS/酚法制备)；7，8分别为悬铃木的花序和叶片(采用报道CTAB-LiCl法制备，但未经过纯化步骤)。
图2本发明纯化和未纯化步骤对悬铃木花序及叶片总RNA提取影响，图中泳道1、3分别为悬铃木叶片；2、4分别为悬铃木的花序，其中泳道3、4是经过本发明所述的纯化步骤，点样孔未见蛋白质污染。
图3悬铃木花序均一化的cDNA的电泳图，图中泳道1为总cDNA；M为分子量标准(DL2000，北京天为公司)图4不同时期取样(本年度2月、7月，上一年8月、10月、12月)并保存的悬铃木混合花序样品总RNA提取效果电泳图，图中泳道1、2为悬铃木的花序混合样品总RNA图5应用RT-PCR扩增LFY基因片段、PCR及酶切检验电泳图，图中M为DNA分子量标记；1-3为以质粒DNA为模板M13引物PCR扩增验证；4为质粒DNA；5-6为以cDNA为模板PCR扩增；7以质粒DNA为模板PCR扩增验证；8质粒DNA用EcoR I and HindIII酶切检测图6应用RT-PCR克隆到悬铃木LEAFY基因片段与加州悬铃木LEAFY基因片段序列对比，经检测同源性高达98％(LEAFY基因的克隆引物设计参考加州悬铃木，ACCESSION numberAF106842，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝8574518)图7应用3’RACE扩增AG基因片段，图中M为DNA分子量标记；1-6为以cDNA为模板PCR扩增具体实施方式
实施例1从悬铃木花序抽提总RNA样品a.悬铃木花序总RNA的粗提(1)采样采集新鲜的悬铃木花序，将其置于液氮中，得到样品1；(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；(3)取2g步骤(1)中样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴5min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后于-20℃放置8-16h，于4℃条件下12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；(7)将步骤(6)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA的粗提物。
b.悬铃木花序总RNA的纯化(1)将上述步骤制备的花序总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下12000rpm/min，离心6min，回收上清液；(2)将步骤(1)所得的上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃条件下12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃放置1h，4℃条件下12000rpm/min，离心30min，得到RNA沉淀；(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的花序总RNA。
用本实施例，悬铃木花序总RNA的产率为202.20微克/克鲜重。
质量检测经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.94，可以满足分子生物学实验需要。
实施例2从悬铃木叶片抽提总RNA样品a.悬铃木叶片总RNA的粗提(1)采样采集悬铃木新鲜叶片并至于液氮中，得到样品1；(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；(3)取1g步骤(1)中样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴2min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后-20℃放置8-16h，于4℃条件下12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；(7)将步骤(6)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干。
b.悬铃木叶片总RNA的纯化(1)将上述步骤制备的叶片总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下12000rpm/min，离心6min，回收上清液；(2)将步骤(1)所得的上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃条件下12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃条件下12000rpm/min，离心30min，得到RNA沉淀；(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的叶片总RNA。
用本实施例，悬铃木叶片总RNA的产率为245.90微克/克鲜重。
质量检测经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.93，可以满足分子生物学实验需要。
实施例3从不同时期取样并保存的悬铃木混合花序中抽提总RNA
a.粗提(1)采样分不同时期(样品取自本年度2月、7月、8月及上一年10月、12月)采集悬铃木花序并置于液氮中，于-70℃超低温冰箱备用，得到不同时期的混合样品1；(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；(3)取2g步骤(1)中混合样品1加液氮研磨成粉末加入步骤(1)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，65℃水浴2min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；(4)将步骤(2)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿/异戊醇(氯仿∶异戊醇的体积比＝24∶1)，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；(5)将步骤(3)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，上下颠倒使混匀成一相，于4℃条件下12000rpm/min离心10min，回收上清液；(6)将步骤(4)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后-20℃放置8-16h，于4℃条件下12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；(7)将步骡(5)所得RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA粗提物。
b.纯化(1)将上述步骤制备的花序总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加bu/CTAB和aq/CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃条件下12000rpm/min，离心6min，回收上清液；(2)将步骤(1)所得的上清，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃条件下12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3M NaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃条件下12000rpm/min，离心30min；(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用1ml 75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，-20℃保存，得到纯的总RNA。
用本实施例，悬铃木混合花序RNA产率为198.58微克/克鲜重。
质量检测经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.85，可以满足分子生物学实验需要。
实施例4从悬铃木无菌苗抽提总RNA(1)无菌苗的培养参见刘国锋和包满珠(Liu G，Bao M，Adventitious shoot regeneration from in vitrocultured leaves of London plane tree(Platanus acerifolia Willd.)Plant Cell Rep，2003，21640-44)报道的方法。
(2)从悬铃木无菌苗中提取总RNA的粗提与纯化步骤参照本说明书的实施例1。
用本实施例，悬铃木无菌苗总RNA产率为204.6微克/克鲜重。
质量检测经电泳检测，RNA保持完整，A260/280＝1.85，可以满足分子生物学实验需要。
实施例5本发明与对照方法对悬铃木组织中总RNA提取效果的比较本实施例具体涉及本发明方法与报道的其它三种方法(如前所述的异硫氰酸胍法、Trizol Kit法、SDS/酚法)提取悬铃木组织中总RNA的质量和得率的比较，对照方法的具体操作步骤见说明书《背景技术》文献所述。
从结果可以看出，目前常用的Trizol Kit法并不适合提取悬铃木RNA(见表1、图1)，用该法提取悬铃木花序的RNA很容易降解，而无菌苗的RNA杂质很多，并且完整性不好。尽管整个操作过程需时较短，但Trizol缓冲液有剧毒且试剂盒费用较高，故其并不是提取悬铃木RNA的理想方法。
异硫氰酸胍法能成功提取悬铃木花序及叶片的RNA，但RNA纯度及完整性并不如改进SDS/酚法和改进CTAB-LiCl法，并且异硫氰酸胍较贵、有毒，且异硫氰酸胍母液及提取缓冲液在4℃、暗处分别只能保存三个月和一个月。
改进SDS/酚法也能成功提取悬铃木花序及叶片的RNA，但该方法产量较低，并且苯酚有剧毒。
本发明不仅能成功提取悬铃木花序及叶片的RNA，而且提取的RNA产量较高，多糖、蛋白质等杂质污染可以有效避免，尽管需时较长，但有毒药品比其它方法少，稳定有效、成本低。故成为提取悬铃木花序及叶片较为理想的方法。
表1.本发明与对照方法对悬铃木花序和叶片中总RNA提取效果的比较
注表中数据为平均值±标准误，同一行中不同英文字母表示数据间存在的显著差异(P＝0.05)(下同)。
本发明提取到的总RNA经纯化之后，28SrRNA亮度约18SrRNA的2倍(图2)，完全适于进行RT-PCR等研究。纯化后的悬铃木总RNA的A260/A230值大于2.0，表明RNA没有多酚、多糖及蛋白质的污染，RNA完整性很好，可以用于进一步的分子生物学研究。而未经纯化的悬铃木花序和叶片的总RNA(图2，泳道1、2)，点样空处有污染，可能是蛋白质未去除干净。从悬铃木花序和无菌苗叶片中提取总RNA产量分别约为202μg/g鲜重和245μg/g鲜重(参见表2)。
表2.纯化和未纯化步骤对悬铃木花序和叶片中总RNA提取效果的比较
实施例6本发明的应用实施例(应用RT-PCR克隆悬铃木LEAFY基因片段)(1)悬铃木花序总RNA提取具体操作步骤参照实施例1所述的步骤。
(2)cDNA合成第一链逆转录cDNA合成采用CLONTECH SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit，按田振东等(田振东等，cDNA文库与RACE方法结合克隆一个马铃薯病程相关蛋白基因cDNA，遗传学报，2003，30(11)996-1002)的方法进行。用该方法合成的单链cDNA3’端带有接头5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC-3′。
(3)基因克隆RT-PCR扩增Leafy基因的第三段外显子(Exon)根据Michael等(Michael W.Frohlich，David S.Parker，The Mostly Male Theory of Flower EvolutionaryOriginsfrom Genes to Fossils Systematic Botany(2000)，25(2)pp.155-170)在Platanus racemosa中报道的Leafy基因(参见gene bank，accession numberAF106842，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝8574518)序列设计RT-PCR引物Forward(5’-TGACGAACCAGGTATTCAGA-3’)，Reverse(5’-AGGAAGGACCAGTAATGGCT-3’)。
PCR反应体系如下2μl第一链逆转录cDNA，1.5mM MgCl2，200μM dNTPs(NH4+balanced)，5μl 10×Buffer，1μM primer，1.5U Taq酶。
PCR反应程序如下94℃变性45s，57℃退火60s，72℃延伸2min，38个循环，循环结束后72℃延伸10min。扩增产物用1.5％琼脂糖(含1％EB)电泳检测。
用本发明提取的悬铃木花序的总RNA，经第一链逆转录为cDNA，以此cDNA模板，成功扩增出Leafy基因第三段内含子，连接T载体(购自中国大连宝生物公司)后，经酶切及PCR鉴定(如图5所示)并测序，其大小为360bp(如图6所示)。用Clustal W 1.83软件进行序列分析，证明所克隆片段与Michael等(2000)在Platanus racemosa中报道的Leafy基因第三段内含子的同源性高达98％。
表3.本发明所涉及英文缩写的说明
权利要求
1.一种从悬铃木组织中抽提总RNA的方法，其特征在于它包括以下步骤a.粗提(1)采样将悬铃木新鲜的或低温保存的组织置于液氮中，得到样品1；(2)向离心管中加含700μl/100ml β-ME的裂解液3ml，于65℃水浴预热；(3)取2g步骤(1)制备的样品1加液氮研磨成粉末，再加入步骤(2)中离心管内，振荡1-2min使其充分混匀，于65℃水浴5min，自然冷却至室温，得到样品混合液2；(4)将步骤(3)得到的样品混合液2中加等体积的氯仿与异戊醇的体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，使混匀成一相，于4℃12000rpm/min离心10min，回收上清液；(5)将步骤(4)所得的上清液转入新的离心管中，加等体积氯仿，使混匀成一相，于4℃ 12000rpm/min离心10min，回收上清液；(6)将步骤(5)所得的上清液转入另一新的离心管，加1/3体积的8mol/l LiCl，混匀后于-20℃放置8-16h，于4℃12000rpm/min，离心20min，得到RNA沉淀；(7)将步骤(6)所得的RNA沉淀用75％乙醇洗一次，稍晾干，得到总RNA的粗提物；b.纯化(1)将上述步骤制备的总RNA粗提物用400μl DEPC-H2O溶解，加正丁醇-CTAB和水饱和CTAB各200μl，涡旋2min，于4℃12000rpm/min，离心6min，回收上清液；(2)将步骤(1)所得的上清液，加300μl 0.2M NaCl，涡旋30s，于4℃12000rpm/min，离心10min，收集下层水相；(3)将步骤(2)所收集的下层水相，加1/10体积3MNaAc和2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，于4℃12000rpm/min，离心30min，得到RNA沉淀；(4)将步骤(3)得到的RNA沉淀用75％乙醇洗一次，稍晾干，溶于50μl去离子甲酰氨，摇匀，于-20℃保存，得到纯的悬铃木组织总RNA。
2.根据权利要求1所述的从悬铃木组织中抽提总RNA的方法，其特征在于，所述的新鲜组织选自悬铃木花序或叶片或芽或离体培养的无菌苗。
3.权利要求1所述的方法在悬铃木植物分子生物学上的应用。
全文摘要
本发明属于悬铃木分子生物学技术领域，具体涉及林木组织RNA制备技术领域。本发明公开了一种从悬铃木组织中提取总RNA的方法。针对悬铃木组织中酚类和次生代谢物质含量较高影响提取高质量RNA样品的障碍，提出了从粗提到纯化悬铃木总RNA的关键步骤，制备了含有聚乙烯吡咯烷酮40和β－巯基乙醇的新型裂解液，用于抑制悬铃木组织中多酚类物质的氧化；利用氯仿/异戊醇和氯仿分别抽提以除去部分多糖，多酚和蛋白质；将粗提物用DEPC－H
文档编号C12N15/29GK1986795SQ200610113098
公开日2007年6月27日 申请日期2006年9月11日 优先权日2006年9月11日
发明者包满珠, 李志能, 刘国锋, 张俊卫, 黄文俊 申请人:华中农业大学