专利名称：构象病的治疗剂和/或预防剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及构象病的治疗剂和/或预防剂，其含有具有神经保护作用的神经肽或其药理学可接受的盐作为活性成分，和涉及包括所述治疗剂和/或预防剂的药学组合物。
背景技术：
根据Harris提出的假设，腺垂体受控于由下丘脑产生的、然后通过门静脉转运到垂体前叶的体液因子。在过去的30年中已经鉴定了各种下丘脑激素，如促甲状腺激素释放激素(TRH)、黄体生成素释放激素(LH-RH)、生长激素释放抑制激素(生长激素释放抑制因子)、生长激素(GRH)释放因子、促肾上腺皮质激素(CRH)释放因子。这些物质是充当神经递质和神经学功能控制因子的神经肽。在从下丘脑释放之后，所述神经肽作用于垂体，通过多种刺激来促进和抑制激素分泌。然而，有争议的是上述鉴定出来的物质是否就是所有的神经肽。Arimura和同事已经改进了常规的用于分离和鉴定神经肽的策略。具体地讲，他们使用分离用的细胞内信息传输系统(特别是cAMP系统，其对于通过GRH和ACTH分泌的CRH、GH很重要)的激活作为垂体前叶细胞中的指示器，试图从下丘脑分离出新的神经肽，并最终鉴定了该神经肽(Miyata A等人，Biochem Biophys Res Commun(1989)，164，567-574)。由于使用垂体的腺苷酸环化酶的激活作为指示器分离出该肽，因此该肽被命名为是垂体腺苷酸环化酶激活多肽(以下简称PACAP)。
另外，实际上，作为神经肽，比PACAP更早发现的是血管活性肠肽(以下称为VIP)。VIP是从肠分泌的一类神经肽，并具有松弛消化道平滑肌的作用。另外，PACAP的N末端的27个氨基酸的结构非常类似于VIP的N末端的27个氨基酸的结构。VIP和PACAP与肠促胰液素、胰高血糖素等在肽长度和氨基酸序列、和酰胺化的C末端有许多共同点，所以他们通常属于胰高糖素-分泌素家族性。
同时，在神经系统中有许多具有未知机制的疾病。特别是，神经变性疾病的病理学条件有许多未识别的方面。目前，神经变性疾病被定义为“由一类神经元组的进行性退化和蜕膜脱落导致的一组可发展成多种神经/精神症状的疾病，所述神经元组的进行性退化和蜕膜脱落是由于未知原因的代谢错误引起的，因每种疾病而异”。神经变性疾病包括难以置信的多种疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病，其发生频率极高并且他们中的大多数是散发性的；和多聚谷氨酰胺疾病，其作为个别疾病相对少见，但其具有不同的疾病类型，且所有疾病类型均表现出遗传特征。然而，最近迅速变得光明的前景是关于神经变性疾病的机制，所述神经变性疾病在特殊蛋白质的折叠中发生异常，所述特殊蛋白质是所述疾病的致病基因产物，导致形成不溶性积累，其主要形成β折叠结构，在这个过程中获得新的异常功能，因此可导致细胞死亡。结果是，通过蛋白质的高级结构的改变产生的集中于特殊蛋白质的构象病的原理开始迅速地在本领域内渗透。据认为，这些构象病的特征在于，在脑内聚集的特殊蛋白质对于发病是必不可少的。例如，目前提出朊病毒蛋白质是库贾氏病、疯牛病(牛海绵状脑病)和格-施病的致病物质；多聚谷氨酰胺是延髓性肌萎缩、亨廷顿疾病、脊髓小脑共济失调、齿状红核苍白球萎缩的致病物质；α-共核蛋白是帕金森病、路易体痴呆和多元萎缩的致病物质；β-淀粉状蛋白是阿尔茨海默病和唐氏综合症的致病物质；SOD1是家族性肌萎缩性侧索硬化的致病物质；Tau是FTDP-17、进行性核上麻痹、皮层-基底神经节退化和皮克病的致病物质；Abri是家族性British痴呆的致病物质；和neuroserpin是家族性痴呆的致病物质[Cell Technology(2001)20，1475]。
现在这些构象病的致病物质和作用机制正逐渐被阐明。目前期待着治疗有效的和/或预防有效的药学产品的迅速开发。然而，迄今为止，只有少数的有效力地和有效地对这些构象病的药学产品的报导，而一直没有报导有关任何使用上述神经肽用于各种构象病的治疗性的和/或预防性的药学产品。
发明公开因此，本发明的一个目的是提供一种用于各种构象病的治疗剂和/或预防剂以及包含所述治疗剂和/或预防剂的药学组合物，所述的治疗剂和/或预防剂含有一种具有神经保护作用的神经肽或其药理学可接受的盐作为活性成分。
为实现上述目的进行了深入的研究，结果是，我们通过发现一种具有神经保护作用的神经肽完成了本发明，所述神经肽能够对抗可引起构象病发病的特殊蛋白质。
本发明提供以下的(1)到(7)项(1).一种用于构象病的治疗剂和/或预防剂，其含有具有神经保护作用的神经肽或其药理学可接受的盐作为活性成分。
(2).(1)的治疗剂和/或预防剂，其中所述神经肽包括至少23个得自下式(I)的肽的N末端残基His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N(I)(其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分别表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一个F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；和N表示-NH2或Asn-NH2)。
(3).(1)的治疗剂和/或预防剂，其中神经肽由下式(II)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-P-Gly-Q-R(II)(其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分别表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一个F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；P表示Asn或化学键；Q表示Lys、Arg、Lys-Arg、Arg-Arg或化学键；和R表示-OH或-NH2)。
(4).(1)的治疗剂和/或预防剂，其中神经肽由下式(III)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N-Gly-O-P-Tyr-Q-Gln-R-Val-S-Asn-T-U(III)(其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F、J、O、P、Q、R、S和T分别表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一个F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；N表示化学键或Asn；和U表示-OH或-NH2)。
(5).(1)到(4)中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中构象病是通过朊病毒蛋白质、聚谷氨酸、α-共核蛋白、β-淀粉状蛋白、SOD1、Tau、Abri或neuroserpin的蓄积产生的。
(6).(1)到(5)中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中构象病是库贾氏病、疯牛病(牛海绵状脑病)、格-施病、延髓性肌萎缩、亨廷顿疾病、脊髓小脑共济失调、齿状红核苍白球萎缩、帕金森病、路易体痴呆、多元萎缩、阿尔茨海默病、唐氏综合症、家族性肌萎缩性侧索硬化、FTDP-17、进行性核上麻痹、皮层-基底神经节退化、皮克病、家族性British痴呆或家族性痴呆。
(7)一种药学组合物，其包含(1)到(6)中任一项的治疗剂和/或预防剂。
本说明书包括作为日本专利申请2001-386699的说明书和/或附图中公开的部分或全部内容，所述文献是本申请的优先权文件。
附图概述
图1表示异常朊病毒对细胞死亡的作用。
图2表示神经肽对抗异常朊病毒的神经保护作用的程度。“●”表示PACAP，和“▲”表示VIP。
图3表示β-淀粉状蛋白对细胞死亡的作用。“□”表示含5％马血清和5％新生小牛血清的DMEM，阴影的“□”表示含0.25％马血清和0.25％新生小牛血清的DMEM，和“■”表示含0.2μM胰岛素而不含血清的DMEM。
图4表示神经肽对抗β-淀粉状蛋白的神经保护作用程度。“□”表示对照，“■”表示10-5M的β-淀粉状蛋白，“●”表示10-9M的PACAP27，“#”表示P＜0.05和“##”表示P＜0.01。
图5表示神经肽PACAP27、VIP和humanin、以及一种细胞可渗透的cAMP衍生物的神经保护作用。“#”表示P＜0.05，“##”表示P＜0.01(用于对照)，“*”表示P＜0.05和“**”表示P＜0.01(用于β-淀粉状蛋白治疗组)。
图6表示神经肽的浓度和神经保护作用之间的关系。“●”表示PACAP，“▲”表示VIP。
图7表示β-淀粉状蛋白的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化作用和神经肽对该作用的抑制作用。“#”表示P＜0.01(用于对照)，“*”表示P＜0.05和“**”表示P＜0.01(用于β-淀粉状蛋白治疗组)。
序列表说明SEQ ID NO14位的Xaa表示Ala或Gly。
SEQ ID NO15位的Xaa表示Ile或Val。
SEQ ID NO19位的Xaa表示Asn或Ser。
SEQ ID NO111位的Xaa表示Thr或Ser。
SEQ ID NO113位的Xaa表示Leu或Tyr。
SEQ ID NO115位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO117位的Xaa表示Met或Leu或nLeu。
SEQ ID NO120位的Xaa表示Lys或Arg或Gln。
SEQ ID NO121位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO124位的Xaa表示Asn或Ala。
SEQ ID NO125位的Xaa表示Ser或Ala。
SEQ ID NO126位的Xaa表示Ile或Val。
SEQ ID NO102位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO103位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO105位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO107位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO109位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO1011位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO113位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO114位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO116位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO118位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO1110位的Xaa表示Lys或Arg。
SEQ ID NO1112位的Xaa表示Lys或Arg。
优选实施方案以下详细说明本发明。
本发明的具有神经保护作用的神经肽具体地为包括至少23个残基的肽，所述至少23个残基得自包括氨基酸序列SEQ ID NO1的肽的N-末端；或具体地为包括以下氨基酸序列的肽，即，其中把Asn或任一的氨基酸序列SEQ ID NO2到12加到包括氨基酸序列SEQID NO1的肽的C末端。
His-Ser-Asp-Xaa-Xaa-Phe-Thr-Asp-Xaa-Tyr-Xaa-Arg-Xaa-Arg-Xaa-Gln-Xaa-Ala-Val-Xaa-Xaa-Tyr-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Leu(SEQ ID NO1)Gly-Lys(SEQ ID NO2)Gly-Arg(SEQ ID NO3)Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO4)Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO5)Asn-Gly-Lys(SEQ ID NO6)Asn-Gly-Arg(SEQ ID NO7)Asn-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO8)Asn-Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO9)Gly-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Xaa-Val-Xaa-Asn-Xaa(SEQ ID NO10)Asn-Gly-Xaa-Xaa-Tyr-Xaa-Gln-Xaa-Val-Xaa-Asn-Xaa(SEQ ID NO11)可向上述肽的N-末端氨基结合一种极性物质或非极性物质，以改变分子的极性；和结合聚乙二醇或糖胺聚糖(透明质酸等)聚合物以赋予肽以抗酶性。作为选择，可使氨基酸结合于脂质体质上以装囊于脂质体中，或固定在类脂膜的表面上。
另外，上述肽的C末端可为-OH或-NH2。
肽的具体例子包括PACAP38(肽1；SEQ ID NO12)、PACAP27(肽2；SEQ ID NO13)、VIP(肽3；SEQ ID NO14)、PACAP的衍生物即Arg-PACAP38(肽4；SEQ ID NO15)、类PACAP肽(肽5；SEQ ID NO16)、Arg-PACAP27(肽6；SEQ ID NO17)、[A4，V5]-PACAP27(肽7；SEQID NO18)和[A4，V5，N9]-PACAP27(肽8；SEQ ID NO19)、VIP的衍生物即[G4，I5]-VIP(肽9；SEQ ID NO20)和[G4，I5，S9]-VIP(肽10；SEQ ID NO21)、VIP的高度碱性衍生物即VIP高度碱性衍生物A(肽11；SEQ ID NO22)、VIP高度碱性衍生物B(肽12；SEQ ID NO23)、VIP高度碱性衍生物C(肽13；SEQ ID NO24)和VIP高度碱性衍生物D(肽14；SEQ ID NO25)、PACAP27的高度碱性衍生物即PACAP27高度碱性衍生物A(肽15；SEQ ID NO26)、PACAP27高度碱性衍生物B(肽16；SEQ ID NO27)、PACAP27高度碱性衍生物C(肽17；SEQ ID NO28)、VIP/PACAP高度碱性嵌合肽(肽18；SEQ ID NO29)、PACAP短型(肽19和26到38；SEQID NO30和37到49)，VIP短型(肽20和22到25；SEQ ID NO31和33到36)、PACAP衍生的类PACAP肽(-PACAP)(肽21；SEQ ID NO32)和乙酰化的PACAP27碱性衍生物C(肽39；SEQ ID NO17的乙酰化衍生物)。
本发明的具有神经保护作用和可用于治疗和/或预防构象病的神经肽可根据任何已知合成肽的标准方法合成。例如，根据在“ThePeptides”(Schrederand Luhke，vol.1，Academic Press，New York，U.S.A.，1966)或在“Peptide Synthesis(Peptide no go-sei)”(Izumiya等人，MARUZEN，1975)中的描述，可通过多种方法合成神经肽。该方法的具体例子包括叠氮化物方法、酰基氯方法、酸酐方法、混和酸酐方法、DCC、活性酯方法(对硝基苯基酯方法、N-羟基琥珀酰亚胺酯方法、氰基甲基酯方法等)、使用伍德沃德试剂K的任何方法、carboimidazole方法、氧化还原方法、DCC-加成(HONB、HOBt、HONSu)方法等。这些方法即可用于固相又可用于液相合成。
本发明的肽的合成通过上述任何通用的多肽合成法进行，例如通过所谓的分步骤方法(其包括通过使氨基酸一个一个地缩合到末端氨基酸上的顺序地结合)进行合成，或通过使几个分离的片段偶合的任何方法进行合成。
例如，通过分步骤方法的固相合成可具体根据下述的Merrifield.R.B.[Solid phase peptide synthesis，J.Amer.Chem.Soc.，85，2149-2159(1963)]的方法进行。首先，使C末端氨基酸(氨基被保护)通过其羧基结合到不溶性树脂上，然后除去氨基酸C末端的氨基保护基。其次，根据目标肽的氨基酸序列，通过缩合反应使氨基被保护的氨基酸的反应活性羧基与如此得到的游离的反应活性的氨基偶合。在如上所述逐步合成整个序列之后，使肽与不溶性树脂断裂。
任何不溶性树脂可用于上述固相合成，只要它对反应活性的羧基有亲合力即可。这种不溶性树脂的例子包括氯甲基树脂、氧代甲基树脂、4-氧代甲基苯乙酰胺甲基树脂(PAM树脂)、二苯甲基胺树脂(BHA树脂)、氨甲基树脂、甲基二苯甲基树脂(MBHA树脂)、4-氨甲基苯氧甲基树脂和4-羟甲基苯氧甲基树脂。
另外，当9-芴甲氧羰基基团(Fmoc)用作α-氨基、4-羟甲基苯氧甲基树脂等的保护基时，优选其通过三氟乙酸(TFA)的方式从树脂消除。当叔丁氧羰基基团(Boc)用作4-氧代甲基苯基乙酰氨基甲基树脂(PAM树脂)等的保护基时，优选其通过氟化氢等方式从树脂消除。
优选每1g树脂的肽浓度至多为0.5毫摩尔。
在上述方法中，需要氨基酸的肽结合中所涉及的保护基与氨基的结合/消除，和氨基酸的肽结合中所涉及的羧基的活化。
用于氨基的保护基的例子包括苄氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)、叔氨氧羰基(Aoc)、异冰片氧羰基、对甲氧基苄氧羰基、2-氯苄氧羰基、金刚烷氧羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、邻硝基苯基亚磺酰基和二苯基硫膦基。
此外，在氨基酸中，如His、Tyr、Thr、Lys、Asp、Arg和Ser的侧链上的官能团优选事先被保护。如下所述，根据任何常规使用的方法使保护基与上述氨基酸结合来保护官能团。在反应之后，除去保护基。
用于His的亚氨基的保护基的例子包括苄氧甲基(Bom)、对甲苯磺酰基(Tos)、苄基(Bzl)、苄氧羰基(Z)和三苯甲基基团。
Ser和Thr的羟基可通过例如酯化或醚化的方式被保护，但这个保护不是必要的。适用于酯化的基团的例子包括低级烷酰基如乙酰基、芳酰基如苯甲酰基、和得自碳酸的任何基团如苯甲酰氧羰基和乙氧羰基基团。另外，适合于醚化的基团的例子包括苄基(Bzl)、四氢吡喃基和叔丁基基团。
用于Tyr的羟基的保护基的例子包括苄基(Bzl)、溴苄氧羰基(Br-Z)、二氯苄基(Cl2-Bzl)、苄氧羰基(Z)、乙酰基和对甲苯磺酰基(Tos)基团。
用于Lys的氨基的保护基的例子包括苄氧羰基(Z)、氯苄氧羰基(Cl-Z)、二氯苄基(Cl2-Bzl)、叔丁氧羰基(Boc)和对甲苯磺酰基(Tos)基团。
用于Arg的胍基的保护基的例子包括对甲苯磺酰基(Tos)、硝基、苄氧羰基(Z)和叔戊氧羰基(Aoc)基团。
Asp的羧基通过例如苄醇、甲醇、乙醇、叔丁醇、环己基(cHex)等的酯化被保护。
用于其它氨基酸的保护基的例子，具体地说，用于Trp的吲哚基的保护基的例子包括甲酰基、苄氧羰基、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基和2，2，2-三氯乙氧羰基。然而这个保护不是必要的。
为保护Met的硫代甲基，方法是首先使硫代甲基转化为二甲亚砜，然后使中间产物还原。然而，这个保护不是必要的。
同时，可通过任何已知的标准方法活化羧基，以及本文所使用的试剂等也可适当地选自已知试剂等。例如，可使羧基与多种试剂反应形成相应的酰基氯、酸酐或混和酸酐、叠氮化物、活性酯(与五氯苯酚、对硝基酚、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基苯并三唑、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亚胺等的酯)等使羧基活化。
在固相中反应活性氨基和反应活性羧基之间的上述缩合反应(肽键生成反应)所用溶剂的例子可以是用于形成肽键的任何溶剂。例如，无水或者含水的二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、吡啶、氯仿、二氧杂环己烷、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮和六甲基磷酰三胺(HMPA)，这些溶剂可单独使用或使用包含两种或多种类型的这些溶剂的混合溶剂。
另外，上述缩合反应可在缩合剂的存在下进行，例如碳二亚胺试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)或羰二咪唑、焦磷酸四乙酯或苯并三唑-N-羟基三二甲基氨基鏻六氟磷酸盐(Bop试剂)。
可根据任何标准方法使如此得到的肽进行脱盐和纯化。这种方法的例子包括离子交换色谱法如DEAE-纤维素、分配色谱法如SephadexLH-20和Sephadex G-25、正相色谱法如硅胶、和反相色谱法如ODS-硅胶和高效液相色谱法。
如果需要，可通过使用多种酸使上述得到的纯化的肽变成药理学可接受的盐，如乙酸盐、盐酸盐和磷酸盐。
一种含有以上制备的肽及其药理学可接受的盐作为活性成分的药剂具有对抗那些能诱导构象病的特殊蛋白质的神经保护作用。本文中，能引起构象病发病的特殊蛋白质是指这样的蛋白质，即当基因异常引起蛋白质折叠过程中发生异常时所述蛋白质形成不溶性蓄积，并且形成与原蛋白质构象不同的β折叠结构。另外，构象病指这样的疾病，即其中当在神经元中由于上述特殊蛋白质的蓄积发生细胞死亡时，诱导了以进行性痴呆、肌阵挛、共济失调、构音障碍等为特征的症状。特殊蛋白质和由其引起的构象病的例子包括由朊病毒蛋白质引起的库贾氏病、疯牛病(牛海绵状脑病)和格-施病；由多聚谷氨酰胺引起的延髓性肌萎缩、亨廷顿疾病、脊髓小脑共济失调和齿状红核苍白球萎缩；由α-共核蛋白引起的帕金森病、路易体痴呆和多元萎缩；由β-淀粉状蛋白引起的阿尔茨海默病和唐氏综合症；由SOD1引起的家族性肌萎缩性侧索硬化；由Tau引起的FTDP-17、进行性核上麻痹、皮层-基底神经节退化和皮克病；由Abri引起的家族性British痴呆；和由neuroserpin引起的家族性痴呆。另外，神经保护作用是指抑制神经元中细胞死亡的作用以及维持神经元功能的作用，所述细胞死亡是由能引起上述构象病发病的特殊蛋白质引起的。据述由细胞程序死亡引起的细胞死亡是由构象病的发展过程引起的。事实上，有一个关于这种对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶系统的作用的报导，其深入地探讨了细胞程序死亡[Journal of neuroscience research(2001)65，45-53]。例如，该作用的检测是通过向受试细胞中添加一种毒性蛋白质如朊病毒以刺激细胞在具有神经保护作用的试验物质的存在下对抗毒性蛋白质，检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活性，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶是细胞死亡的标记物，然后与没有试验物质的对照组比较天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活性。当受试细胞中的活性低于对照组的活性时，可以确定试验物质具有对抗特殊蛋白质的神经保护作用。另外，也可通过比较活细胞数代替上述测试中的检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的活性来进行类似的评定。
本发明的肽及其衍生物具有神经保护作用，并观察到每个衍生物都具有比PACAP和VIP更强的活性和希望的临床支持作用。例如，含有Arg-PACAP38和Arg-PACAP27的碱性氨基酸取代衍生物组在体内对肽酶具有极强的耐受性，这在Peptide Chemistry(1996)249-252中具体说明。通常，肽和蛋白质在体内被立即代谢，参予这一过程的一种重要物质是肽酶。因此，对肽酶的耐受性导致碱性氨基酸取代衍生物在体内的作用时间延长，因此其对作为慢性疾病的构象病很有效。这个结果导致给药频率降低并伴随药物价格降低，即使从医学上和经济学上考虑，也可认为具有显著的作用。此外，N末端进行改变的衍生物组没有表现出PACAP的收缩呼吸系统平滑肌的短暂作用。因此，其临床应用可使更宽范围内的可能的受试患者受益。上述具有支持作用的衍生物表现出优于PACAP和VIP的神经保护作用。特别是，在PACAP衍生物中，Arg-PACAP38(肽4；SEQ ID NO16)、Arg-PACAP27(肽6；SEQ ID NO18)、PACAP27高度碱性衍生物A(肽15；SEQ ID NO26)、PACAP27高度碱性衍生物B(肽16；SEQ ID NO27)、和PACAP27高度碱性衍生物C(肽17；SEQ ID NO28)；和VIP衍生物中的[G4，I5，S9]-VIP(肽10；SEQ ID NO22)表现出显著的作用。
本发明的包含肽及其药理学可接受的盐作为活性成分的治疗剂和/或预防剂可有效地治疗和预防各种构象病，如唐氏综合症、帕金森病、路易体痴呆、多元萎缩、库贾氏病、疯牛病(牛海绵状脑病)、阿尔茨海默病、格-施病、延髓性肌萎缩、亨廷顿疾病、脊髓小脑共济失调、齿状红核苍白球萎缩、家族性肌萎缩性侧索硬化、FTDP-17、进行性核上麻痹、皮层-基底神经节退化、皮克病、家族性British痴呆、家族性痴呆等。
当本发明的肽及其盐用于治疗患有上述疾病的患者时，它们可以原样给药。
此外，本发明的肽及其盐通过任何已知的方法与多种药理学可接受的载体和其它组分混和，然后混合物可作为液体或固体药学组合物用于非肠道的、口服的、气雾剂、经肺、经皮、经鼻或滴眼液的形式作用于中枢神经系统。例如，组合物可以以片剂(包括糖衣片和薄膜包衣片)、粉末、颗粒、胶囊(包括软胶囊)、液体药物、注射剂、栓剂缓释制剂等形式安全地口服给药或非肠道给药(例如局部、直肠和静脉内给药)。另外，本发明的药学组合物可通过心室内泵的方式直接以大脑为目标给药。
用于本发明的药学组合物的药理学可接受的载体的例子包括通常用作药学制剂原料的多种有机或无机载体物质。例如，用于固体药学制剂的赋形剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂；用于液体药学制剂的溶剂、增溶剂、助悬剂、等渗剂、缓冲剂和光滑剂(soothing agent)。另外，如果必要，可使用添加剂如防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、吸附剂、和润湿剂。作为赋形剂，可使用如乳糖、蔗糖、D-甘露醇、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素或轻质无水硅酸。作为润滑剂可使用如硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石或胶态二氧化硅。粘合剂的例子包括结晶纤维素、蔗糖、D-甘露醇、糊精、羟丙纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、蔗糖、明胶、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠。崩解剂的例子包括淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、crosscarmellose钠、羧甲基淀粉钠和L-羟丙纤维素。溶剂的例子包括注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油和玉米油。增溶剂的例子包括聚乙二醇、丙二醇、D-甘露醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三氨基甲烷、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠和柠檬酸钠。作为助悬剂，可使用例如表面活性剂如硬脂酰三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、氨基丙酸十二烷基酯、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵和甘油单硬脂酸酯；或亲水的高分子如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素和羟乙基纤维素、羟丙基纤维素。等渗剂的例子包括葡萄糖、D-山梨糖醇、氯化钠、甘油和D-甘露醇。缓冲剂的例子包括磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐和柠檬酸盐。光滑剂的例子为苄醇等。防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸和山梨酸。抗氧化剂的例子包括亚硫酸盐和抗坏血酸。
本发明的肽或其盐的剂量取决于使用(测试)目的、受试者的年龄、体重、给药方法等适当地决定。例如，当对哺乳动物包括人进行静脉内给药时，优选每次给药剂量为0.1到100μg的肽。
实施例通过以下描述的实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些 (肽的合成)通过通用的肽的固相合成方法分别合成具有以下氨基酸序列的PACAP38、PACAP27、VIP(肽1到3)及由这些肽衍生的肽衍生物(肽4到39)。除非具体说明，每个肽的N末端和C末端分别为H和-NH2。
(1)肽1PACAP38His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn-Lys(SEQ ID NO12)(2)肽2PACAP27His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO13)(3)肽3VIPHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO14)(4)肽4PACAP衍生物Arg-PACAP38His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg(SEQ ID NO15)(5)肽5PACAP衍生物类PACAP肽(海星-PACAP)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Lys(SEQ ID NO16)(6)肽6PACAP衍生物Arg-PACAP27His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO17)(7)肽7PACAP衍生物[A4，V5]-PACAP27His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO18)(8)肽8PACAP衍生物[A4，V5，N9]-PACAP27His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu(SEQ ID NO19)(9)肽9VIP衍生物[G4，I5]-VIPHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO20)(10)肽10VIP衍生物[G4，I5，S9]-VIPHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO21)(11)肽11VIP高度碱性衍生物AHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys(SEQID NO22)(12)肽12VIP高度碱性衍生物BHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO23)(13)肽13VIP高度碱性衍生物CHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO24)(14)肽14VIP高度碱性衍生物DHis-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-nLeu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg(SEQ ID NO25)(15)肽15PACAP27高度碱性衍生物AHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys(SEQ IDNO26)(16)肽16PACAP27高度碱性衍生物BHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg(SEQID NO27)(17)肽17PACAP27高度碱性衍生物CHis-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg(SEQID NO28)(18)肽18VIP/PACAP高度碱性嵌合肽His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Arg-Gln-nLeu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-Gly-Arg-Arg-Tyr-Arg-Gln-Arg-Val-Arg-Asn-Arg(SEQ ID NO29)(19)肽19PACAP短型His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu(SEQ ID NO30)(20)肽20VIP短型His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu(SEQ ID NO31)(21)肽21PACAP衍生物类PACAP肽(stingray-PACAP)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Pro-Lys-Arg-Arg-Asn-Ser-Gly-Arg-Arg-Val-Phe-Tyr(SEQ ID NO32)(22)肽22VIP短型(VIP24)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn(SEQ ID NO33)(23)肽23VIP短型(VIP25)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser(SEQ ID NO34)(24)肽24VIP短型(VIP26)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile(SEQ ID NO35)(25)肽25VIP短型(VIP27)His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu(SEQ ID NO36)(26)肽26PACAP短型(PACAP24)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala(SEQ ID NO37)(27)肽27PACAP短型(PACAP25)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala(SEQ ID NO38)(28)肽28PACAP短型(PACAP26)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val(SEQ ID NO39)(29)肽29PACAP长型(PACAP28)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly(SEQ ID NO40)(30)肽30PACAP长型(PACAP29)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys(SEQ IDNO41)(31)肽31PACAP长型(PACAP30)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg(SEQID NO42)(32)肽32PACAP长型(PACAP31)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr(SEQ ID NO43)(33)肽33PACAP长型(PACAP32)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys(SEQ ID NO44)(34)肽34PACAP长型(PACAP33)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln(SEQ ID NO45)(35)肽35PACAP长型(PACAP34)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg(SEQ ID NO46)(36)肽36PACAP长型(PACAP35)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val(SEQ ID NO47)(37)肽37PACAP长型(PACAP36)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys(SEQ ID NO48)(38)肽38PACAP长型(PACAP37)His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Arg-Tyr-Lys-Gln-Arg-Val-Lys-Asn(SEQ ID NO49)(39)肽39乙酰基-PACAP27高度碱性衍生物C
乙酰基-His-Ser-Asp-Gly-Ile-Phe-Thr-Asp-Ser-Tyr-Ser-Arg-Tyr-Arg-Arg-Gln-Leu-Ala-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Ala-Ala-Val-Leu-Gly-Arg-Arg(肽17的乙酰化衍生物)[实施例2]检测由异常朊病毒(106-126)引起的细胞死亡已经证实正常的朊病毒通过构象转化而转化为异常形式(J.Neurochem，(2000)vol.75，2536-2545)。因此，使用PC12细胞检测由具有异常折叠的朊病毒蛋白质(106-126)引起的细胞死亡，所述PC12细胞得自小鼠肾嗜铬细胞瘤并在脑/神经系统研究中用作模型细胞系。在含5％的马血清和5％的新生小牛血清的Dulbecoo改进极限必需培养基(DMEM)中，在37℃的恒温和5％CO2和95％空气的环境下培养PC12细胞。在使用胰蛋白酶使PC12细胞从培养烧瓶移开后，将上述细胞在96孔培养板上培养(104细胞/孔)。把朊病毒(106-126)(AmericanPeptide Company)加入到培养过的PC12细胞中从而证实其作用。朊病毒(106-126)已经在约5mg/mL的浓度下预处理约72小时，然后转化为聚集体(原纤维转变为具有β折叠结构)。通过检测乳酸脱氢酶自细胞向介质中的释放量监测细胞死亡。图1表示结果试验。其清楚地表明细胞死亡的发生取决于异常朊病毒(106-126)的浓度。
PACAP和VIP对抗异常朊病毒(106-126)的神经保护作用把50μM的异常朊病毒(106-126)和不同浓度的神经肽(PACAP和VIP)加入到已经以类似实施例2的方式培养的PC12细胞中。通过WST-8方法计算细胞数，使得可数字化地表示出对抗异常朊病毒(106-126)的神经保护作用的程度。图2表示试验结果。其证实了甚至在极低的浓度下，PACAP也表现出一定程度的神经保护作用。相比之下，VIP在比PACAP的浓度更高的浓度下表现出神经保护作用。另外，证实了所有的神经肽1到21的每个神经肽在10-9M下都有神经保护作用。
检测由β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡把β-淀粉状蛋白(β-淀粉状蛋白1-42，American PeptideCompany)(10-3M)加入到已经以类似实施例2的方式培养的PC12细胞中，培养48小时之后，检测得到的细胞死亡。β-淀粉状蛋白在约5mg/mL的浓度下已经预处理约24小时，以使其转化为聚集体(原纤维)。通过检测乳酸脱氢酶来监测细胞死亡，乳酸脱氢酶通常存在于细胞膜上并且当发生与细胞死亡伴随的细胞膜破裂时乳酸脱氢酶被释放到外面。检测三种类型的培养基的每一种培养基中由β-淀粉状蛋白诱导的细胞死亡，即检测含5％马血清和5％新生小牛血清的DMEM、含0.25％马血清和0.25％新生小牛血清的DMEM、和含0.2M胰岛素而不含血清的DMEM。图3表示试验结果。与对照组(没有加入β-淀粉状蛋白的组)相比，在含0.2M胰岛素的无血清的DMEM和含0.25％马血清和0.25％新生小牛血清的DMEM中证实了由β-淀粉状蛋白引起的显著细胞死亡。另一方面，在含5％马血清和5％新生小牛血清的DMEM中的PC12培养细胞中，证实甚至在48小时之后没有由β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡。这些结果暗示了血清组分可能与某种神经保护有关系。另外，基于上述结果，决定在以下实施例中使用含0.2M胰岛素的无血清的DMEM。
神经肽PACAP27对抗β-淀粉状蛋白的神经保护作用把β-淀粉状蛋白加入到以类似实施例4的方式培养的PC12细胞。这时使得神经肽PACAP27得以共存从而证实其对抗由β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡的神经保护作用。通过检测乳酸脱氢酶从细胞向介质的释放量来监测细胞死亡。图4表示试验结果。能够证实在β-淀粉状蛋白的存在下细胞随时间的迁移而死亡。另外，并非很多细胞在培养24小时后死亡，而是经过一定时间段之后发生死亡，这暗示了由β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡可能是由于细胞程序死亡诱导所引起的。相比之下，在加入神经肽PACAP27的细胞组中，细胞死亡被很强烈地抑制，使得细胞死亡的值与对照组的值几乎相同。这些结果显示了PACAP表现出极强的对抗β-淀粉状蛋白的神经保护作用。
多种神经肽对抗淀粉状蛋白的神经保护作用以类似实施例5的方式进行实验，然后证实了以下神经肽对抗由β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡的神经保护作用，所述神经肽包括PACAP相关的神经肽(肽1、2、4、5、7、8、15、16、17、19、21、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38和39)和VIP相关的神经肽(肽3、9、10、11、12、13、14、18、20、22、23、24和25)。具体地说，把淀粉状蛋白(50M)和各种PACAP相关的神经肽和VIP相关的神经肽中的每个加入到培养过的PC12细胞中。通过WST-8方法计算活细胞的数目，从而进行这些多种肽对抗淀粉状蛋白的神经保护作用的比较和检测。如果神经肽具有神经保护作用，则能观察到在加入神经肽和不加入神经肽的情况之间活细胞计数有明显的不同。在加入每个多种神经肽的PC12细胞中，与不加入神经肽的组相比观察到更高的细胞存活率(P＜0.05)的情况下被判定具有神经保护作用。结果在表1和表2中表示。
表1PACAP-相关神经肽(10-9M)
(+，与不加入神经肽的组比较时P＜0.05)
表2VIP-相关的神经肽(10-7M)
(+，与不加入神经肽的组比较时P＜0.05)[实施例7]神经肽PACAP27、VIP和humanin、以及细胞可渗透的cAMP衍生物的神经保护作用把β-淀粉状蛋白加入到以类似实施例5的方式培养的PC12细胞中。这时使得神经肽PACAP27、VIP和humanin以及细胞可渗透的cAMP衍生物分别得以共存，从而证实这些神经肽对抗由β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡的作用。使用WST-8方法评定细胞数，然后通过计算细胞存活率检测细胞死亡。图5表示试验结果。在β-淀粉状蛋白的存在下，约70％的细胞死亡。另一方面，在使得二丁酰基-cAMP(cAMP衍生物)共存的情况中，细胞死亡被很强烈地抑制，因此证实了cAMP的神经保护作用。另外，PACAP27(10-9M)还表现出独特的强神经保护作用。已知PACAP通过cAMP的增加发挥作用。这些结果暗示了神经肽对抗β-淀粉状蛋白的神经保护作用也可能通过cAMP来发挥作用。此外，VIP(一种PACAP27的类似物)表现出对抗β-淀粉状蛋白的神经保护作用，虽然其作用弱于PACAP27。还检测了最近发现的来自人的神经保护物质humanin(Proc Natl Acad SciUSA(2001)98(11)6336-6341)的神经保护作用，尽管其作用也弱于PACAP27，但Humanin仍表现出神经保护作用。
神经肽的浓度和神经保护作用之间的关系把β-淀粉状蛋白加入到以类似实施例5的方式培养的PC12细胞中。这时使各种浓度的神经肽得以共存，从而研究神经保护作用和浓度之间的关系。使用WST-8方法评价细胞，然后数字化地表示出由β-淀粉状蛋白引起的细胞死亡的减少程度。图6表示试验结果。神经肽PACAP甚至在极低的浓度下也表现出神经保护作用，该作用在10-9到10-13M最强。另外，VIP也在相对高的浓度下表现出强的神经保护作用。这些结果清楚地表明PACAP比VIP的神经保护作用至少大1×104倍。
β-淀粉状蛋白的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化作用和神经肽对该作用的抑制作用使几乎类似于实施例4的方式培养的PC12细胞在24孔板(2×105细胞/孔)中培养。把10-5M的β-淀粉状蛋白加到板中。这时分别加入cAMP衍生物(10-4M)和神经肽PACAP(10-9M)，然后检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化作用，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3为一种与细胞程序死亡相关的酶。使用Ac-DEVD-AMC检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活化作用，Ac-DEVD-AMC为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的特异性底物。图7表示试验结果。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3的活性通过加入β-淀粉状蛋白得到增强，但是该作用通过加入cAMP衍生物显著地减弱。另外，通过加入神经肽PACAP，表现出一种不完全的、约50％的抑制作用。这些结果暗示了神经肽对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶系统的作用可能在很大程度上与对抗β-淀粉状蛋白的神经保护作用有关。考虑到该抑制作用是不完全的，其抑制作用也可能与其它作用机制有关。
工业实用性本发明的治疗剂和/或预防剂和药学组合物具有神经保护作用和可有效地用于治疗和/或预防构象病。
本文引用的所有公开、专利和专利申请被全文引用作为参考。
序列表<110>伊藤火腿株式会社(ITOHAM FOODS INC.)<120>用于构象病的药学组合物(Pharmaceutical composition for conformation disease)<130>PH-1709-PCT<150>JP 2001-386699<151>2001-12-19<160>49<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>27<212>PRT<213>人工序列(Artificial Sequence)<220>
<223>合成肽(Synthetic Peptide)<220>
<221>肽(Peptide)<222>4<223>Xaa代表Ala或Gly<220>
<221>肽<222>5<223>Xaa代表Ile或Val<220>
<221>肽<222>9<223>Xaa代表Asn或Ser<220>
<221>肽<222>11
<223>Xaa代表Thr或Ser<220>
<221>肽<222>13<223>Xaa代表Leu或Tyr<220>
<221>肽<222>15<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>17<223>Xaa代表Met或Leu或nLeu<220>
<221>肽<222>20<223>Xaa代表Lys或Arg或Gln<220>
<221>肽<222>21<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>24<223>Xaa代表Asn或Ala<220>
<221>肽<222>25<223>Xaa代表Ser或Ala<220>
<221>肽<222>26<223>Xaa代表Ile或Val
<400>1His Ser Asp Xaa Xaa Phe Thr Asp Xaa Tyr Xaa Arg Xaa Arg Xaa Gln1 5 10 15Xaa Ala Val Xaa Xaa Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Leu20 25<210>2<211>2<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>2Gly Lys1<210>3<211>2<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>3Gly Arg1<210>4<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
<400>4Gly Lys Arg1<210>5<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>5Gly Arg Arg1<210>6<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>6Asn Gly Lys1<210>7<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>7Asn Gly Arg1
<210>8<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>8Asn Gly Lys Arg1<210>9<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>9Asn Gly Arg Arg1<210>10<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<220>
<221>肽<222>2<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>3<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>5<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>7<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>9<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>11<223>Xaa代表Lys或Arg<400>10Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Val Xaa Asn Xaa1 5 10<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<220>
<221>肽<222>3<223>Xaa代表Lys或Arg
<220>
<221>肽<222>4<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>6<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>8<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>10<223>Xaa代表Lys或Arg<220>
<221>肽<222>12<223>Xaa代表Lys或Arg<400>11Asn Gly Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Xaa Val Xaa Asn Xaa1 5 10<210>12<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>12His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val Lys Asn Lys35<210>13<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>13His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu20 25<210>14<211>28<212>PRT<213>人工肽<220>
<223>合成肽<400>14His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn20 25<210>15<211>38<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>15His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg Tyr Arg20 25 30Gln Arg Val Arg Asn Arg35<210>16<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>16His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Gln Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg Tyr Arg20 25 30Gln Arg Val Arg Asn Lys35<210>17<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>17His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu20 25<210>18<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>18His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu20 25<210>19<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>19His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu20 25
<210>20<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>20His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn20 25<210>21<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>21His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn20 25<210>22<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>22His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln
1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys20 25 30<210>23<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>23His Ser AsP Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Lys Arg20 25 30<210>24<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>24His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg Arg20 25 30<210>25<211>30<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成肽<400>25His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln1 5 10 15Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg Arg20 25 30<210>26<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>26His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys20 25<210>27<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>27His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg20 25 30
<210>28<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>28His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Arg Gln1 5 10 15Leu Ala Val Arg Arg Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Arg Arg20 25 30<210>29<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>29His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Arg Gln1 5 10 15Ala Val Arg Arg Tyr Leu Asn Ser Ile Leu Asn Gly Arg Arg Tyr Arg20 25 30Gln Arg Val Arg Asn Arg35<210>30<211>23<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成肽<400>30His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu20<210>31<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>31His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu20<210>32<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>32His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30
Pro Lys Arg Arg Asn Ser Gly Arg Arg Val Phe Tyr35 40<210>33<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>33His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn20<210>34<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>34His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser20 25<210>35<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽
<400>35His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile20 25<210>36<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>36His Ser AsP Ala Val Phe Thr AsP Asn Tyr Thr Arg Leu Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu20 25<210>37<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>37His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala20<210>38
<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>38His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala20 25<210>39<211>26<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>39His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val20 25<210>40<211>28<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>40His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15
Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly20 25<210>41<211>29<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>41His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys20 25<210>42<211>30<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>42His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg20 25 30<210>43<211>31<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成肽<400>43His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr20 25 30<210>44<211>32<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>44His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30<210>45<211>33<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>45His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30
Gln<210>46<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>46His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg<210>47<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>47His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val35
<210>48<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>48His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val Lys35<210>49<211>37<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>49His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys Gln1 5 10 15Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr Lys20 25 30Gln Arg Val Lys Asn3权利要求
1.构象病的治疗剂和/或预防剂，其含有具有神经保护作用的神经肽或其药理学可接受的盐作为活性成分。
2.权利要求1的治疗剂和/或预防剂，其中神经肽包括至少23个得自下式(I)的肽的N末端残基His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N(I)其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分别表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一个F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；和N表示-NH2或Asn-NH2。
3.权利要求1的治疗剂和/或预防剂，其中神经肽由下式(II)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-P-Gly-Q-R(II)其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F和J分别表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一个F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；P表示Asn或化学键；Q表示Lys、Arg、Lys-Arg、Arg-Arg或化学键；和R表示-OH或-NH2。
4.权利要求1的治疗剂和/或预防剂，其中神经肽由下式(III)表示His-Ser-Asp-A-B-Phe-Thr-Asp-C-Tyr-D-Arg-E-Arg-F-Gln-G-Ala-Val-I-J-Tyr-Leu-K-L-M-Leu-N-Gly-O-P-Tyr-Q-Gln-R-Val-S-Asn-T-U(III)其中A表示Ala或Gly；B表示Ile或Val；C表示Asn或Ser；D表示Thr或Ser；E表示Leu或Tyr；F、J、O、P、Q、R、S和T分别表示Lys或Arg；I表示Lys、Arg或Gln；但至少一个F、I和J表示Arg；G表示Met、Leu或nLeu；K表示Asn或Ala；L表示Ser或Ala；M表示Ile或Val；N表示化学键或Asn；和U表示-OH或-NH2。
5.权利要求1到4中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中构象病是通过朊病毒蛋白质、聚谷氨酸、α-共核蛋白、β-淀粉状蛋白、SOD1、Tau、Abri或neuroserpin的蓄积产生的。
6.权利要求1到5中任一项的治疗剂和/或预防剂，其中构象病是库贾氏病、疯牛病(牛海绵状脑病)、格-施病、延髓性肌萎缩、亨廷顿疾病、脊髓小脑共济失调、齿状红核苍白球萎缩、帕金森病、路易体痴呆、多元萎缩、阿尔茨海默病、唐氏综合症、家族性肌萎缩性侧索硬化、FTDP-17、进行性核上麻痹、皮层-基底神经节退化、皮克病、家族性British痴呆或家族性痴呆。
7一种药学组合物，其包含权利要求1到6中任一项的治疗剂和/和预防剂。
全文摘要
本发明提供构象病的治疗剂和/或预防剂。本发明的一个目的是提供构象病的治疗剂和/或预防剂，其包括具有神经保护作用的神经肽或其药理学可接受的盐作为活性成分。
文档编号C12N15/12GK1606451SQ02825490
公开日2005年4月13日 申请日期2002年12月19日 优先权日2001年12月19日
发明者尾上诚良, 樫本和久 申请人:伊藤火腿株式会社