专利名称：致病性构象异构体的分析的制作方法
致病性构象异构体的分析相关申请的交叉引用本申请要求2008年4月30日提交的美国临时专利申请61/049，396的优先权，通 过引用将该申请的内容纳入本文。
背景技术：
蛋白质构象疾病(protein conformational disease)包括各种临床上不相关的 疾病，例如传染性海绵状脑病、阿尔茨海默病、ALS和糖尿病，这些疾病因正常蛋白质构象异 常转换成致病性构象异构体所致。这种转换进而造成伴有后续组织沉积的致病性构象异构 体的自身缔合并且假设可导致周围组织损伤。这些疾病在临床表现上也惊人相似，通常经 历时间长度不同的潜伏期后从诊断快速发展为死亡。在活体对象和由活体对象获取的样品中检测构象疾病蛋白的致病性构象异构体 已证明是困难的。目前证实活体患者中存在致病性构象异构体的技术粗略且具有侵入性。 例如，组织病理学检查要求对患者存在风险的活组织检查。组织病理学固有地存在取样误 差，因为病损和淀粉样沉积可能由于进行活组织检查区域的不同而被忽略。因此，在对象死 亡之前对这些病症进行确定诊断和治标疗法仍然是一个巨大的尚未实现的挑战。淀粉样-β蛋白(Α β )聚集体主要是A β 1-40 (Α β 40)和1-42 (Α β 42)，这些聚集 体排他性地与阿尔茨海默病(AD)有关，被视作该疾病的黄金标准标记物。然而，AD唯一的 确定性检验是在死后对脑样品进行Aβ斑块的免疫组织化学染色。目前，尚没有FDA批准 的AD死前诊断试验。血浆或CSF样品可用于死前试验。一些死前AD试验聚集于脑脊液 (CSF)，试图对可溶性A β 42进行定量。然而，这种生物标记物仅仅用作AD的间接测量。可以特异性地检测直接来自CSF或其他体液如血浆中的聚集的A β的试验将具有 巨大的优势。聚集的Αβ的早期检测能实现对阿尔茨海默病更快且更有效的诊断以及可能 疗法的评价。能够检测其他构象疾病蛋白的致病性构象异构体的试验也是需要的，因为它们也 能实现对这些构象疾病更快和更有效的诊断以及可能疗法的评价。优选实施方式的简要描述本发明部分地涉及致病性构象异构体特异性结合试剂(PCSB试剂)，该试剂优先 与致病性朊病毒蛋白和其他非朊病毒致病性构象异构体发生相互作用。在一些实施方式 中，PCSB 试剂源自朊病毒蛋白片段，例如 ft~P19-30(SEQ ID NO :242)、PrP23_30 (SEQ ID NO: 243),PrPlOO-Ill(SEQ ID NO :244),PrPlOl-IlO(SEQ ID NO :245)、PrP154_165(SEQ ID NO: 246)和(SEQ ID NO :247)。在其它实施方式中，致病性构象异构体特异性结合 试剂的氨基酸序列为SEQ ID NO :242, SEQ ID NO :243, SEQ ID NO :244, SEQ ID NO 245, SEQ ID NO 246 和 SEQ ID NO :247。在其它实施方式中，PCSB试剂是朊病毒蛋白片段的拟肽类似物。在一些实施方式
中，所述拟肽类似物具有以下结构
权利要求
1.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成复合物的 条件下相接触；和通过其与所述致病性构象异构体特异性结合试剂的结合来检测所述样品中如果有的 话所述非朊病毒致病性构象异构体；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优先与致病性 朊病毒蛋白相互作用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性构象异构体是与淀粉 样蛋白疾病相关的构象异构体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述淀粉样蛋白疾病选自系统性淀粉样 变、tau病变和共核蛋白病。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性构象异构体是与选自 下组的疾病相关的构象异构体阿尔茨海默病、ALS、免疫球蛋白相关疾病、血清淀粉样蛋白 A相关疾病和II型糖尿病。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性构象异构体是阿尔茨 海默病构象异构体。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阿尔茨海默病构象异构体是淀粉样蛋 白-β (Αβ)蛋白。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阿尔茨海默病构象异构体是tau蛋白。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源 自选自下组的化合物PrP19_3。(SEQ ID NO 242),PrP23^30 (SEQ ID NO 243),PrP100_m (SEQ ID NO 244), PrP101_110 (SEQ ID NO 245), PrP154_165 (SEQ ID NO 246) ,PrP226_237 (SEQ ID NO :247)， SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :68，
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品选自器官、全血、血液成分、血液 组分、血浆、血小板、血清、脑脊液(CSF)、脑组织、神经系统组织、肌肉组织、骨髓、尿、眼泪、 非神经系统组织、活检或尸检。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包括血浆或脑脊液。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述朊病毒蛋白片段选自以下肽 PrP19_30 (SEQ ID NO 242) ,PrP23_30 (SEQ ID NO :243)，PrP100_m (SEQ ID NO :244)，PrP101_110(SEQ ID NO :245)，PrP154_165 (SEQ ID NO :246), PrP226_237 (SEQ ID NO :247)，SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO 50 禾口 SEQ ID NO :68。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，朊病毒蛋白片段选自PrP19_3C1(SEQID NO 242), PrP23_30 (SEQ ID NO :243), PrP100_m (SEQ ID NO :244), PrP101_110 (SEQ ID NO :245)，SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :50 和 SEQ ID NO :68。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性结合试剂包 含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO :242, SEQ ID NO :243，SEQ ID NO :244，SEQ ID NO 245，SEQ ID NO :246，SEQ ID NO :247，SEQ ID NO :14，SEQ ID NO 50 和 SEQ ID NO :68。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性结合试剂包 含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO :242, SEQ ID NO :243，SEQ ID NO :244，SEQ ID NO 245，SEQ ID NO :14，SEQ ID NO 50 和 SEQ ID NO :68。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性结合试剂包 括选自下组的拟肽试剂(a)SEQID NO :229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240 或 241 ；(b)SEQID NO :229，230，232，233，237，238，239 或 240 ；(c)SEQID NO :230，237，238，239 或 240 ；(d)SEQID NO 240 ；(e)
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性结合试剂在 生理学pH下具有至少正3的净电荷。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述试剂在生理学pH下具有至少正4的 净电荷。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性结合试剂经 可检测标记。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述试剂用生物素进行可检测标记。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试剂连接于固相支持体。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述固相支持体选自硝基纤维素、聚苯 乙烯胶乳、聚氟乙烯、重氮化纸、尼龙膜、活化珠和磁敏性珠。
22.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合 试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成复合物的 条件下相接触；使所述复合物与构象疾病蛋白特异性结合试剂在适合结合的条件下相接触；和 通过其与所述构象疾病蛋白特异性结合试剂的结合来检测所述样品中如果有的话所 述非朊病毒致病性构象异构体的存在；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优先与致病性 朊病毒蛋白相互作用。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在形成所述复合物之后 去除未结合的样品材料。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述构象疾病蛋白特异性结合试剂是标 记抗体。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性构象异构体是Αβ蛋 白，所述构象疾病蛋白特异性结合试剂是抗-Αβ抗体。
26.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合 试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成第一复合 物的条件下相接触；去除未结合的样品材料；使所述非朊病毒致病性构象异构体从所述第一复合物解离下来，从而形成解离的非朊 病毒致病性构象异构体；使所述解离的非朊病毒致病性构象异构体与第一构象疾病蛋白特异性结合试剂在允 许结合以形成第二复合物的条件下相接触；和通过检测所述第二复合物的形成来检测样品中如果有的话所述非朊病毒致病性构象 异构体的存在；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优先与致病性 朊病毒蛋白相互作用。
27.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，利用可检测标记的第二构象疾病蛋白特 异性结合试剂来检测第二复合物的形成。
28.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性试剂偶联 于固相支持体。
29.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，所述第一构象疾病蛋白特异性结合试剂 偶联于固相支持体。
30.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，通过使所述第一复合物暴露于硫氰酸胍 而使所述非朊病毒致病性构象异构体从所述第一复合物解离。
31.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，通过使所述复合物暴露于高PH或低pH而 使所述非朊病毒致病性构象异构体从所述第一复合物解离。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在解离之后中和高pH或 低PH的步骤。
33.如权利要求沈所述的方法，其特征在于，所述非朊病毒致病性构象异构体是Αβ蛋 白，所述构象疾病蛋白特异性结合试剂是抗-Αβ抗体。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，通过使所述复合物暴露于高pH条件而使 所述Aβ蛋白从所述第一复合物解离。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述高pH条件是约80°C下约0.IN的 NaOH0
36.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与第一致病性构象异构体特异性 结合试剂在能使所述第一试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成 第一复合物的条件下相接触；使所述疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与第二致病性构象异构体特 异性结合试剂在能使所述第二试剂与所述第一复合物中的所述非朊病毒致病性构象异构 体结合的条件下相接触，其中所述第二试剂包含可检测的标记；和通过其与所述第二试剂的结合来检测所述样品中如果有的话所述非朊病毒致病性构 象异构体；其中，所述第一和第二致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优 先与致病性朊病毒蛋白相互作用。
37.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤(a)使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与构象疾病蛋白特异性结合试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成复合物的条 件下相接触；(b)去除未结合的样品材料；(C)使所述复合物与致病性构象异构体特异性结合试剂在能使所述致病性构象异构体 特异性结合试剂与所述非朊病毒致病性构象异构体结合的条件下相接触，其中所述致病性 构象异构体特异性结合试剂包含可检测的标记；和通过其与所述致病性构象异构体特异性结合试剂的结合来检测所述样品中如果有的 话所述非朊病毒致病性构象异构体；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优先与致病性 朊病毒蛋白相互作用。
38.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤提供包含致病性构象异构体特异性结合试剂的固相支持体；合并所述固相支持体与可检测标记的配体，其中，所述致病性构象异构体特异性结合 试剂对所述可检测标记的配体的结合亲和力比所述试剂对所述非朊病毒致病性构象异构 体的结合亲和力弱；在能使所述样品中可能存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合所述试剂并置换 所述配体的条件下合并样品与所述固相支持体；和检测所述试剂与所述样品中的所述非朊病毒致病性构象异构体之间形成的复合物； 其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优先与致病性 朊病毒蛋白相互作用。
39.一种用于区分非朊病毒致病性构象异构体和非朊病毒非致病性构象异构体的方 法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合 试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成复合物的 条件下相接触；和通过所述致病性构象异构体与所述试剂的结合来区分所述非朊病毒致病性构象异构 体和所述非朊病毒非致病性构象异构体；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优先与致病性 朊病毒蛋白相互作用。
40.一种诊断非朊病毒构象疾病的方法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合 试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成复合物的 条件下相接触；和通过其与所述试剂的结合来检测所述样品中如果有的话所述非朊病毒致病性构象异 构体；如果检测到所述非朊病毒致病性构象异构体则诊断为构象疾病； 其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂源自朊病毒蛋白片段并且优先与致病性 朊病毒蛋白相互作用。
41.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合 试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成复合物的 条件下相接触；和通过其与所述致病性构象异构体特异性结合试剂的结合来检测所述样品中如果有的 话所述非朊病毒致病性构象异构体；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂包括具有SEQ ID NO =229,230,231,232, 233，234，235，236，237，238，239，240 或 241 的拟肽区域。
42.一种用于检测非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下步骤使疑似含有所述非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合 试剂在能使所述试剂与如果存在的所述非朊病毒致病性构象异构体结合以形成复合物的 条件下相接触；和通过其与所述致病性构象异构体特异性结合试剂的结合来检测所述样品中如果有的 话所述非朊病毒致病性构象异构体；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂选自
43. 一种用于检测致病性阿尔茨海默病构象异构体的存在的方法，所述方法包括以下 步骤使疑似含有所述致病性阿尔茨海默病构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性 结合试剂在能使所述试剂与如果存在的所述致病性阿尔茨海默病构象异构体结合以形成 复合物的条件下相接触；使所述复合物与构象疾病蛋白特异性结合试剂在适合结合的条件下相接触；和 通过其与所述构象疾病蛋白质特异性结合试剂的结合来检测所述样品中如果有的话 所述致病性阿尔茨海默病构象异构体的存在；其中，所述致病性构象异构体特异性结合试剂是
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述致病性阿尔茨海默病构象异构体是 Αβ蛋白，所述构象疾病蛋白特异性结合试剂是抗_Αβ抗体。
45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述致病性阿尔茨海默病构象异构体是tau蛋白，所述构象疾病蛋白特异性结合试剂是抗-tau抗体。
46.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述致病性构象异构体特异性试剂偶联 于磁珠。
全文摘要
本发明提供了用于检测样品中非朊病毒致病性构象异构体的存在的方法，该方法包括使疑似含有非朊病毒致病性构象异构体的样品与致病性构象异构体特异性结合试剂在能使所述试剂结合致病性构象异构体(如果存在的话)的情况下相接触；和根据其与试剂的结合检测样品中的致病性构象异构体(如果有的话)；其中，致病性构象异构体特异性结合试剂通常源自朊病毒蛋白片段并优先与致病性朊病毒蛋白相互作用。本发明还提供了用于诊断构象疾病的方法。
文档编号G01N33/53GK102083450SQ200980115911
公开日2011年6月1日 申请日期2009年4月29日 优先权日2008年4月30日
发明者A·刘, A·杨, D·佩列兹, M·(C·)高, P·吴, X·王 申请人:诺华有限公司