专利名称：：一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法
技术领域：
：本发明涉及一种分析微生物群落结构组成的方法。技术背景微生物群落具有生物多样性和群落演替现象，因此采用现有的生物检测和分析方法难以分析微生物群落的生物组成结构。
发明内容本发明的目的是为了解决目前现有的生物检测和分析方法难以分析微生物群落的生物组成结构的问题，而提供的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法。采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法按以下步骤进行一、采用周冀中等人的DNA提取方法(JIZHONGZHOU,MARYANNBRUNS，JAMESM.TIEDJE.DNARecoveryfromSoilsofDiverseComposition.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1996,62:316—322)提取微生物群落DNA;二、PCR扩增PCR扩增正向引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，PCR扩增反向引物序列为TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5，端采用磷酸标记；三、酶切去除反意义链酶切反应体系为50|iL由5jiL10xbuffer缓冲溶液、40jiLPCR扩增产物和5mL浓度为5U&L的义核酸外切酶组成，酶切反应体系在37'C的环境中反应34h，然后纯化酶切产物，再溶解于20pL重蒸馏水中；四、将溶解于重蒸馏水中的酶切产物与等体积的变性剂混合置于95"C的环境中热变性处理10min，然后立即冰浴5min，之后凝胶电泳上样、在4~20°C、电压为250-300V的条件下电泳12~18h;五、将凝胶浸泡于重蒸馏水中10min，然后用灭菌的刀片将DNA条带分别切下放入离心管中并研碎，再向每支离心管中加入50pL裂解液在37'C的环境中处理3h，然后离心、分离上清液，并向上清液中加入上清液体积2倍的无水乙醇，置于-20。C的环境中沉淀2h，再在24000g、4°C的条件下离心15min，沉淀物DNA在37°C的环境中干燥15min后加入TE溶液；六、对步骤五得到的沉淀物DNA分别进行分析，即得出微生物群落的组成结构；步骤四凝胶中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的10%14%、甘油占凝胶总重量的5%~10%，其中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的质量比为49~55:1;步骤四中变性剂由去离子甲酰胺和上样缓冲液组成，其中上样缓冲液由NaOH溶液、EDTA、溴酚蓝、二甲苯氰FF和去离子水组成，上样缓冲液中NaOH的浓度为10mM/L、EDTA的浓度为20mM/L、溴酚蓝的浓度为0.02%(重焉)、二甲苯氰FF的浓度为0.02n/。(重量)，去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为l:3;步骤五中5(VL的裂解液含有0.5M/L的乙酸铵、10mM/L的乙酸镁，lmM/L、pH值为8.0的EDTA、0.1%(重量)的SDS和余量的重蒸馏水。本发明可以对工程系统内复杂的微生物群落进行群落结构分析，具有快速、准确的优点，可以解析群落演替，同步掌握工程系统内微生物菌群变化情况，指导工艺、提高工程系统的运行效率。图1是具体实施方式九对比实验中步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的8%的凝胶电泳图，图2是具体实施方式九对比实验中步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的12%的凝胶电泳图，图3是具体实施方式九对比实验中步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的16%的凝胶电泳图，图4是具体实施方式九对比实验中步骤四中去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1:1的凝胶电泳图，图5是具体实施方式九对比实验中步骤四中去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1:2的凝胶电泳图，图6是具体实施方式九对比实验中步骤四中去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1:3的凝胶电泳图，图7是具体实施方式九同步分析脱氮脱硫工艺系统微生物群落的SSCP图谱。具体实施方式具体实施方式一本实施方式采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法按以下步骤进行一、采用周冀中等人的DNA提取方法(JIZHONGZHOU,MARYANNBRUNS，JAMESM.TIEDJE.DNARecoveryfromSoilsofDiverseComposition.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1996,62:316-322)提取微生物群落DNA;二、PCR扩增PCR扩增正向引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,PCR扩增反向引物序列为TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5'端采用磷酸标记；三、酶切去除反意义链酶切反应体系为50nL由5^L10xbuffer缓冲溶液、40^LPCR扩增产物和5nL浓度为5U/nL的义核酸外切酶组成，酶切反应体系在37°。的环境中反应34h,然后纯化酶切产物，再溶解于20pL重蒸馏水中；四、将溶解于重蒸馏水中的酶切产物与等体积的变性剂混合置于95'C的环境中热变性处理10min，然后立即冰浴5min，之后凝胶电泳上样、在4~20°C、电压为250300V的条件下电泳12~18h;五、将凝胶浸泡于重蒸馏水中10min，然后用灭菌的刀片将DNA条带分别切下放入离心管中并研碎，再向每支离心管中加入50^iL裂解液在37。C的环境中处理3h，然后离心、分离上清液，并向上清液中加入上清液体积2倍的无水乙醇，置于-20"C的环境中沉淀2h，再在24000g、4"C的条件下离心15min，沉淀物DNA在37"C的环境中干燥15min后加入10(iLTE溶液；六、对步骤五得到的沉淀物DNA分别进行分析，即得出微生物群落的组成结构；步骤四凝胶中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的10%14%、甘油占凝胶总重量的5%10%，其中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的质量比为4955:1;步骤四中变性剂由去离子甲酰胺和上样缓冲液组成，其中上样缓冲液由NaOH溶液、EDTA、溴酚蓝、二甲苯氰FF和去离子水组成，上样缓冲液中NaOH的浓度为10mM/L、EDTA的浓度为20mM/L、溴酚蓝的浓度为0.02%(重量)、二甲苯氰FF的浓度为0.02。/。(重量)，去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1:3;步骤五中50mL的裂解液含有0.5m/l的乙酸铵、10mM/L的乙酸镁，lmM/L、pH值为8.0的EDTA、0.1%(重量)的SDS和余量的重蒸馏水。核糖体小亚基RNA(SSUrRNA)基因因其进化上的保守性以及操作上的简便性成为本实施方式的靶基因。本实施方式PCR扩增正向引物对应E.coli16SrRNA基因827bp，PCR扩增反向引物对应E.coli16SrRNA基因533~515bp，本实施方式以16SrRNA基因V1V3区(大约为500bp的序列)为耙序列，相对于己有的单链构象多态性技术(仅以V3区的200bp作为耙序列)本实施方式可减少杂带的干扰，为系统发育分析提供更多的信息，分析结果更为准确。微生物群落结构复杂、再加之同源或异源链的相互作用，采用现有的单链构象多态性技术(SSCP)会产生大量的非特异性DNA条带，给群落结构的分析造成很大困难；本实施方式步骤三酶切去除反意义链可以至少减少一半的dna条带数，形成单链SSCP图谱，为后续微生物分析提供很大方便、简化操作。本实施方式方法中每一种微生物只有一条特征DNA条带。本实施方式反向引物5'端采用磷酸标记由生物工程公司合成并标记。本实施方式步骤四凝胶中加入甘油可以增加单链构象多态性技术(SSCP)的灵敏度和分离更长片段的能力。本实施方式步骤五中放入离心管中的DNA条带用微量移液枪的枪头和管壁作用挤压、研碎。本实施方式步骤六中分别以步骤五得到的沉淀物DNA为模板进行扩增、克隆、测序及系统发育学分析。因为生物素分子相对较大(MW-244.3Da)会影响PCR结果，所以反向引物5'端采用磷酸标记。本实施方式使用A核酸外切酶不需要事先对核酸纯化。本实施方式步骤一采用周冀中等人的DNA提取方法(JIZHONGZHOU,MARYANNBRUNS，JAMESM.TIEDJE.DNARecoveryfromSoilsofDiverseComposition.APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1996,62:316-322)保证了微生物种群基因样品的多样性。本实施方式步骤六可将步骤五得到的DNA通过GenBank进行相似性检索和比对，或者采用phylip或ClustalW软件包对相似序列的对齐及系统进化树的绘制，最后通过Treeview软件将进化树输出，进行分析。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中PCR反应程序为94'C预热5min，第一循环94。C变性40s、55""C退火40s、72"延伸60s，循环30次，每循环退火温度依次降低O.rC，最后72匸延伸10min。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤二中PCR反应体系为50(iL由5nL10xPCRbuffer、4j^LdNTP、1.5|iL浓度为20pmol/L的正向引物、1.5nL浓度为20pmol/L的反向引物、0.125UEXTaqDNA聚合酶、l~5ng微生物群落DNA和余量的去离子水组成；10xPCRbuffer中含有2.5mmol/LMg2+;dNTP中各种脱氧核苷三磷酸的浓度均为2.5|omol/L。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中采用浓酚/氯仿核酸纯化法提纯核酸。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的12%。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式六本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中上样量为1520kiL。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式七本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四电泳后采用核酸电泳银染技术显示DNA条带。其它步骤及参数与实施方式一相同。本实施方式可以提高单链构象多态性技术的灵敏度，可检测到lpg(每条DNA条带)的双链DNA。现有技术SYBRGreenI(MolecularProbesInc.)只能检测到20pg(每条DNA条带)以上的双链DNA，而EB技术的敏感性则更低。具体实k方式八本实施方式与具体实施方式一的不同点是步骤四中在4°C、电压为300V的条件下电泳18h。其它步骤及参数与实施方式一相同。具体实施方式九本实施方式采用单链构象多态性技术分析脱氮脱硫工艺系统微生物群落结构，方法与具体实施方式一相同。本实施方式同步分析脱氮脱硫工艺系统微生物群落SSCP图谱如图7所示，图7中"M"泳道标样为Marker,"0d"泳道标样为0天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品，"5d"泳道标样为5天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品，"10d"泳道标样为IO天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品，"15d"泳道标样为15天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品，"20d"泳道标样为'20天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品，"25d"泳道标样为25天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品，"30d"泳道标样为30天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品，"35d"泳道标样为35天脱氮脱硫工艺系统微生物群落DNA样品。对图7中显著性条带1~11(图7中标注)进行回收，再扩增并克隆后，每个条带随机选取14个转化子进行测序，长度约500bp，共测得32个转化子，采用S叫uencher5.0比较32个测得的克隆子，设置最小匹配95%，最小重叠100bp，得到23个不同的操作分类单元(OTU);由于对图谱中的主要条带均进行了克隆测序分析，其多样性能够代表反应器的微生物种群结构。23个OTU通过B，LASTn比较结果如表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结合图7和表1可以明显发现同步脱氮脱硫反应器启动过程中发生了微生物群落生态演替现象。第12天后反应器的硝酸盐去除率已达到100%，比较前15天的电泳图谱，发现第15天时群落生物多样性已远远低于初始状态(第0天)，而且群落结构也发生了很大变化，其中条带l、2、4、10所指示的微生物类群^加^0//"^、5/z/om'a、Oc/w"0&"c/rww、Bra^rA&o6/ww、F/av/附o"os、及ose/vzVga、开始大量富集，条带8所指示的微生物类群呈现出由无到有的变化过程。尤其是启始污泥样品中大量的种群消亡和一些特定功能微生物的大量富集，微生物群落由一个自然的稳定的群落开始向一个定向驯化的人工的群落进行演替'。从第10天开始，条带5所指示的Z^w//om/craZ>/wm^.开始出现并逐渐富集，而硫酸扭的去除效率也开始提高，但去除率不够稳定。第25天后，随着硫酸盐去除率达到100%,0^"//0脂'^06/"附15/7.已经成为优势菌群。第20天与第15天相比，条带2(5iz/om'a、Oc/zra6ac/rwm、5ra办r/w!zo6z'w/w)消亡，条带3(尸aracocc"s)、出现并富集，克隆测序分析，得知其与尸aracoccwssp.序列最相似，相似性高达到97%，/^raco"^sp.是一类兼性自养硝酸盐还原硫化物氧化细菌。硝酸盐还原硫化物氧化细菌是以硝酸盐为电子供体，以各种类型的含硫化合物，如硫化物，聚硫化物，元素硫，硫代硫酸盐和亚硫酸盐为电子受体的自养型反硝化菌(Nica^"/,2000)，分为几种不同亚类群(1)严格化能自养型菌(Obligatelychemolithoautotrophicbacteria)，如77w'o6acz7/ws(iemVri/cam1，772/06ac/〃Msf/z/o/"/-ws禾口7Tz/o附/cras//ra(2)兼性自养型菌(acultativeautotrophicbacteria),如尸aracoccwsfifemVr诉cam1，7TH'o6ofc/〃ws必/ca加，7Tn》6ac/〃ws鄉os77^s禾口7T2/os//^era/朋tofro/to，这类微生物除了还原硫之外，还能利用有机酸(Sorokin"a/,2003;OhWa/,2001);(3)巨大丝状菌(filamentousbacteria),如5egg/atoa禾口77w'o//<3ca中的成员，是存在于沉积物中的巨大丝状菌，用液泡贮存大量的硝酸盐，用于硫化物的自养氧化(Sorokin&a/，2003;SchulzandJorgensen,2001)。尸aracocciwsp.的生理特性如下，球状细胞(直径为0.50.9^m)或短杆菌(长度为0.91.2^im)，单个、成对或堆状，形成聚-P-羟基丁酸盐颗粒，革兰氏阴性，不运动，好氧，呼吸代谢；当硝酸盐、亚硝酸盐或氧化氮存在时，能以它们为电子受体营厌氧生长；在厌氧条件下还原硝酸盐到亚硝酸盐到氧化氮和N2。据此认为尸aracocc"ssp.在脱氮脱硫工艺系统反应器中起到了关键的反硝化脱硫作用。此后，硫酸盐的去除率一直稳定在100%,说明以Dew//ow/craZ>/Mmsp.和尸aracocc"ssp.为主要脱硫和脱氮功能菌群的微生物群落已经基本形成。从第26天起反应器的硫酸盐和硝酸盐的去除率均已达100%，此后，微生物群落结构基本不再发生变化，群落的演替已经完成，形成了具有同步脱氮脱硫功能的顶级群落。但是分析电泳图谱(图3中第30天和第35天)不难发现，微生物群落中不同微生物种群的相对数量仍存在一些因每天进水中的营养物浓度细微变化导致的和人工配水引起的细微变化，但不影响对微生物群落结构以及群落演替的分析。从35天的图谱看，虽然群落演替规律明显，但是也可以看出反应器启动过程中，条带l、6、7、9、10在活性污泥微生物群落中一直稳定存在，并且它们的相对，量基本不变，当pH和碱度变化时，这些条带波动幅度较小，称之为常驻种群。根据表1，常驻菌群与下列各属菌株的相似较大^wera//"^、jB/zfow/a、7Vo/^om7j"cten'mw、柳co;/awa、Sywerg/sfes、5W^^ovmw。这些属多为厌氧微生物，存在于各种厌氧环境中，部分种属能够利用广泛的底物发酵产酸，它们在反应器中具有发酵产酸功能，为硫酸盐还原菌提供有机底物。对比实验1、在4。C条件下进行凝胶电泳(其它条件均相同)，图l是步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的8%的凝胶电泳图，图2是步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的12%的凝胶电泳图，图3是步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的16%的凝胶电泳图。根据图l、2和3可以看出丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺浓度低(8%)条带模糊、无可读性；丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺浓度高(16%)虽然能够分离一定数量的微生物类群，但由于胶浓度过大，导致很多条带无法分开，导致微生物群落多样性没有表达出来；丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺浓度为12%效果最佳。2、在20。C、步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的12%条件下进行凝胶电泳(其它条件均相同)，图4是步骤四中去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1:1的凝胶电泳图，图5是步骤四中去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1:2的凝胶电泳图，图6是步骤四中去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1:3的凝胶电泳图。去离子甲酰胺有助于提高凝胶电泳的敏感性，去离子甲酰胺可以防止单链之间形成无效的退火，增强SSCP图谱的可读性。但根据本实验结果表明去离子甲酰胺浓度过高不但不能增强SSCP的分辨率，还会导致分析的失败；其主要原因是因为过高浓度的去离子甲酰胺会导致单链内部无法形成链内的氢键，不能形成稳定的三维结构，进而导致SSCP图谱无法完成。3、通过图2和图6的比较可以看出4。C条件下凝胶电泳的结果优于20°C条件下凝胶电泳的结果，4。C条件下凝胶电泳条带整齐，分辨率高，可读性强。序列表<110>哈尔滨工业大学<120>—种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据E.eoli16SrRNA基因8~27bp设计PCR扩增正向引物序列。<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据E.coli16SrRNA基因533~515bp设计PCR扩增反向引物序列。<400>2ttaccgcggctgctggca18权利要求1、一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法按以下步骤进行一、采用周冀中等人的DNA提取方法提取微生物群落DNA；二、PCR扩增PCR扩增正向引物序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，PCR扩增反向引物序列为TTACCGCGGCTGCTGGCA，反向引物5’端采用磷酸标记；三、酶切去除反意义链酶切反应体系为50μL由5μL10×buffer缓冲溶液、40μLPCR扩增产物和5μL浓度为5U/μL的λ核酸外切酶组成，酶切反应体系在37℃的环境中反应3～4h，然后纯化酶切产物，再溶解于20μL重蒸馏水中；四、将溶解于重蒸馏水中的酶切产物与等体积的变性剂混合置于95℃的环境中热变性处理10min，然后立即冰浴5min，之后凝胶电泳上样、在4～20℃、电压为250～300V的条件下电泳12～18h；五、将凝胶浸泡于重蒸馏水中10min，然后用灭菌的刀片将DNA条带分别切下放入离心管中并研碎，再向每支离心管中加入50μL裂解液在37℃的环境中处理3h，然后离心、分离上清液，并向上清液中加入上清液体积2倍的无水乙醇，置于-20℃的环境中沉淀2h，再在24000g、4℃的条件下离心15min，沉淀物DNA在37℃的环境中干燥15min后加入10μLTE溶液；六、对步骤五得到的沉淀物DNA分别进行分析，即得出微生物群落的组成结构；步骤四凝胶中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的10％～14％、甘油占凝胶总重量的5％～10％，其中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺的质量比为49～55∶1；步骤四中变性剂由去离子甲酰胺和上样缓冲液组成，其中上样缓冲液由NaOH溶液、EDTA、溴酚蓝、二甲苯氰FF和去离子水组成，上样缓冲液中NaOH的浓度为10mM/L、EDTA的浓度为20mM/L、溴酚蓝的浓度为0.02％(重量)、二甲苯氰FF的浓度为0.02％(重量)，去离子甲酰胺与上样缓冲液的体积比为1∶3；步骤五中50μL的裂解液含有0.5M/L的乙酸铵、10mM/L的乙酸镁，1mM/L、pH值为8.0的EDTA、0.1％(重量)的SDS和余量的重蒸馏水。2、根据权利要求1所述的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于步骤二中PCR反应程序为94。C预热5min，第一循环94-C,变性40s、55。C退火40s、72。C延伸60s，循环30次，每循环退火温度依次降低O.rC,最后72。C延伸10min。3、根据权利要求1所述的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于步骤二中PCR反应体系为50nL由5^L10xPCRbuffer、4|xLdNTP、1.5|xL浓度为20pmol/L的正向引物、1.5joL浓度为2(Himol/L的反向引物、0.125UEXTaqDNA聚合酶、15ng微生物群落DNA和余量的去离子水组成；10xPCRbuffer中含有2.5mmol/LMg2、dNTP中各种脱氧核苷三磷酸的浓度均为2.5nmol/L。4、根据权利要求1所述的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于步骤三中采用浓酚/氯仿核酸纯化法提纯核酸。5、根据权利要求1所述的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于步骤三中丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺占凝胶总重量的12%。6、根据权利要求1所述的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于步骤四中上样量为1520jiL。7、根据权利要求1所述的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于步骤四电泳后采用核酸电泳银染技术显示DNA条带。8、根据权利要求1所述的一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，其特征在于步骤四中在4t:、电压为300V的条件下电泳18h。全文摘要一种采用单链构象多态性技术分析微生物群落结构组成的方法，它涉及一种分析微生物群落结构组成的方法。它解决了目前现有的生物检测和分析方法难以分析微生物群落的生物组成结构的问题。方法一、提取微生物群落DNA；二、PCR扩增；三、酶切去除反意义链；四、凝胶电泳；五、纯化DNA；六、微生物群落的组成结构分析。本发明可以对工程系统内复杂的微生物群落进行群落结构分析，具有快速、准确的优点，可以解析群落演替，同步掌握工艺系统内微生物菌群变化情况，指导工艺、提高工程系统的运行效率。文档编号C12Q1/04GK101210262SQ20071014491公开日2008年7月2日申请日期2007年12月24日优先权日2007年12月24日发明者于振国,任南琪,刘春爽,张运晴,王爱杰,赵阳国,阚洪晶申请人:哈尔滨工业大学