专利名称：一种普瑞巴林手性异构体的分离测定方法
技术领域：
本发明属分析化学领域，涉及化合物柱前的衍生化及测定方法，具体涉及Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺与普瑞巴林(C8H17NO2)柱前衍生化后，用高效液相色谱法来分离测定普瑞巴林的手性异构体的方法。
背景技术：
柱前衍生化是提高检测灵敏度的方法，大多数无紫外吸收或紫外吸收较弱的化合物，采用合适的衍生化方法，可以进行包括含量和手性异构体的准确测定。
普瑞巴林是一种治疗癫痫和神经痛的手性药物，其化学名为(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，分子式为C8H17NO2；普瑞巴林的手性异构体，其化学名为(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸。普瑞巴林其紫外吸收很弱，用紫外检测器测定困难。现有技术中已有采用衍生化方法测定普瑞巴林含量的报道“参见Journal of Chromatography B 674(1995)143-148”，但未见采用手性衍生化试剂与普瑞巴林进行衍生化反应，测定其手性异构体的报道。
普瑞巴林的手性异构体为普瑞巴林的杂质，是普瑞巴林质量控制的重要指标。采用手性色谱柱分离测定普瑞巴林的手性异构体不但成本高，而且分离难度大。本发明采用手性衍生化试剂柱前衍生化，实现了用一般的分离色谱柱(C18或C8色谱柱)快速、准确进行普瑞巴林手性异构体的分离和测定，经衍生化后，普瑞巴林与其手性异构体的衍生化产物，其分离度达到4.5，从而实现了普瑞巴林手性杂质的控制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用液相色谱法分离测定普瑞巴林的手性异构体的方法，其特征在于普瑞巴林用衍生化试剂进行柱前衍生化，其中衍生化试剂为Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物。普瑞巴林在被衍生化的同时，其手性异构体也被衍生化，从而实现采用一般色谱柱进行普瑞巴林及其手性异构体(杂质)的分离测定。这里说的普瑞巴林手性异构体被视为普瑞巴林的重要杂质。
本发所说的普瑞巴林的异构体是指(R)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸。
上述的衍生化试剂选自下述化合物Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-缬胺酰胺，优选Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺。
普瑞巴林进柱前衍生化是指普瑞巴林及其手性异构体与衍生化试剂经定量反应生成衍生化物，普瑞巴林与衍生化试剂的用量摩尔比为1∶1～1∶500，优选1∶1～1∶5。
上述说的液相色谱法是指高效液相色谱法或是高效液相色谱法与质谱法联合应用。
上述所说的分离测定方法主要包括以下步骤①、取普瑞巴林或含普瑞巴林的制剂适量，用稀酸溶液溶解，再用碱溶液调pH值至6.0～8.0，加水适量，摇匀，配制成含普瑞巴林0.5％～5.0％的溶液；②、取普瑞巴林溶液和1mol/L碳酸盐溶液，混合，加入Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L--氨基酸类化合物溶液，混匀；③、于20～60℃反应20～120分钟，反应完毕加入2mol/L盐酸溶液；④、反应物在预置五氧化二磷与氢氧化钾的干燥系统中干燥至溶剂充分挥尽后，加二甲亚砜或N，N-二甲基甲酰胺4ml使剩余物溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；⑤、用高效液相色谱法或高效液相色谱—质谱法分离测定普瑞巴林上一步供试品溶液上述步骤①所说的普瑞巴林可以是含有其手性异构体(称为普瑞巴林消旋体)，或是含极少量其手性异构体(杂质)，或不含其手性异构体。
上述步骤①所说的稀酸溶液或是无机酸如稀盐酸，稀硫酸，稀磷酸等溶液，还可以是有机酸如甲酸、乙酸、三氟乙酸；所说的碱溶液或是无机碱溶液如氢氧化钠，氢氧化钾，氨水，还可以是有机碱溶液如三乙胺，上述步骤②所说的碳酸盐溶液可以是碳酸氢钠，碳酸氢钾，碳酸钾，碳酸钠溶液；还可以上述碳酸盐按照任意比混合后所得的组合物。
上述步骤②所说的Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L--氨基酸类化合物选自Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-缬胺酰胺。
上述步骤⑤所说的高效液相色谱法或高效液相色谱—质谱法使用的色谱柱可以是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，还可以是辛基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱。
上述步骤⑤所说的高效液相色谱法测定普瑞巴林及其手性异构体，检测波长为200～380nm，最佳检测波长为340±3nm。
本发明所说的采用高效液相色谱法分离测定普瑞巴林及其手性异构体的方法，流动相可以是三乙胺水溶液—乙腈体系，还可以是三乙胺水溶液—甲醇体系，三乙胺溶液与乙腈或甲醇的比例为1∶2～2∶1，其中三乙胺的浓度为0.1～5％，用磷酸调pH2.0～5.0。
本发明方法具体通过以下技术方案和步骤实现取普瑞巴林或含普瑞巴林的制剂样品，加稀盐酸溶液振摇使溶解，并用稀碱溶液调至pH值至5.0～9.0(优选pH值6.0～8.0)，加水摇匀，取溶液加手性衍生化试剂和碳酸氢钠溶液适量，于20～60℃(优选35～45℃)，反应20～120分钟(优选30～60分钟)。反应完毕，加稀盐酸溶液，减压抽干，再加二甲亚砜或N，N-二甲基甲酰胺适量配制溶液，采用高效液相色谱方法或高效液相色谱—质谱法测定。
本发明采用Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺与普瑞巴林进行柱前衍生化，不但使衍生化后的产物有较强的紫外吸收，而且可方便快捷地测定普瑞巴林的手性异构体；本发明具有反应条件温和、反应速度快、过量衍生化试剂不干扰测定等优点。且本发明衍生化产物稳定、分析灵敏度高，可以准确测定普瑞巴林中0.05％的手性异构体。该方法既克服了普瑞巴林紫外吸收弱，用紫外检测器测定困难，又解决了用普通色谱柱(C18或C8色谱柱)分离测定普瑞巴林及其制剂的手性杂质的问题。
图1试剂空白的高效液相色谱2普瑞巴林消旋体(R与S构型)的高效液相色谱3普瑞巴林的高效液相色谱4普瑞巴林胶囊的高效液相色谱图
具体实施例方式以下实施例用于进一步理解本发明，但不限于本实施的范围。
实施例1仪器与条件美国Agilent 1100型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；紫外检测波长340nm；流动相三乙胺溶液(取三乙胺5ml，加水1000ml，用磷酸溶液调节pH值至3.0)—乙腈(55∶45)。
实验步骤取普瑞巴林的消旋体约160mg至10ml量瓶中，用1mol/L盐酸溶液适量，振摇使溶解，并用1mol/L氢氧化钠溶液中和，加水稀释至刻度。摇匀，作为样品溶液；另取Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺10.0mg，加丙酮1ml，摇匀，作为衍生化试剂溶液。取样品溶液50μl、衍生化试剂溶液200μl和1mol/L碳酸氢钠溶液20μl置2ml样品瓶中，密闭，在40℃加热反应45分钟；反应完毕后加入2mol/L盐酸溶液10μl，在预置五氧化二磷与氢氧化钾的减压干燥系统中干燥至溶剂充分挥尽。再加二甲亚砜4ml振摇使剩余物溶解，滤过，滤液作为供试品溶液。取供试品溶液在上述条件下进行高效液相色谱分析，结果见图2。
图2中保留时间3.608分钟的色谱峰为过量的衍生化试剂峰；保留时间7.904分钟和9.397分钟的色谱峰分别为普瑞巴林(S构型)及其手性异构体(R构型)的色谱峰。表明普瑞巴林与其手性异构体和过量的衍生化试剂可以达到基线分离。
实施例2取普瑞巴林约80mg至10ml量瓶中，以下按照实施例1的实验步骤制备供试品溶液，并按实施例1的条件下进行高效液相色谱分析，结果见图3。
图3中保留时间3.666分钟的色谱峰为过量的衍生化试剂峰；保留时间8.212分钟和9.9.8067分钟的色谱峰分别为普瑞巴林(S构型)及其手性异构体杂质(R构型，0.5％)的色谱峰。图3表明普瑞巴林与其手性异构体和过量的衍生化试剂可以达到基线分离，并能准确测定普瑞巴林中含有的手性异构体杂质。
实施例3取普瑞巴林胶囊内容物适量(约相当于普瑞巴林80mg)至10ml量瓶中，以下按照实施例1的实验步骤制备供试品溶液，并按实施例1的条件进行高效液相色谱分析，结果见图4。
图4中保留时间3.633分钟的色谱峰为过量的衍生化试剂峰；保留时间8.116分钟的色谱峰为普瑞巴林的色谱峰。图4表明普瑞巴林与过量的衍生化试剂可以达到基线分离，如果样品中含有普瑞巴林的手性异构体杂质，用本法能准确测定。
实施例4按照实施例1的实验步骤制备试剂空白溶液，并按实施例1的条件下进行高效液相色谱分析，结果见图1。
图1中保留时间3.684分钟的色谱峰为衍生化试剂峰；在保留时间5～10分钟范围无色谱峰，表明衍生化试剂不干扰测定。
权利要求
1.一种用液相色谱法分离测定普瑞巴林的手性异构体的方法，其特征在于普瑞巴林在进柱前用衍生化试剂进行衍生化，其中衍生化试剂为Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物。
2.如利要求1所述的方法，所说的衍生化试剂Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物包括Nα(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-缬胺酰胺。
3.如权利要求1所述的方法，普瑞巴林在进柱前需和衍生化试剂经定量反应生成衍生化物，其特征在于普瑞巴林与衍生化试剂的摩尔比为1∶1～1∶500。
4.如权利要求1所述的方法，所说的液相色谱法为高效液相色谱法；或是高效液相色谱法与质谱法联合应用。
5.如权利要求1所述方法，所说的分离测定方法包括以下步骤①、取普瑞巴林或含普瑞巴林的制剂适量，用稀酸溶液溶解，再用碱溶液调pH值至6.0～8.0，加水适量，摇匀，配制成含普瑞巴林0.5％～5.0％的溶液；②、取普瑞巴林溶液和碳酸盐溶液，混合，加入Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物溶液，混匀；③、于20～60℃反应20～120分钟，反应完毕加入盐酸溶液；④、反应物在预置五氧化二磷与氢氧化钾的干燥系统中干燥至溶剂充分挥尽后，加二甲亚砜或N，N-二甲基甲酰胺使剩余物溶解，滤过，滤液作为供试品溶液；⑤、用高效液相色谱法或高效液相色谱-质谱法分离测定上一步的供试品溶液。
6.如权利要求5所述的方法，其中步骤①所说的稀酸溶液或是无机酸如稀盐酸，稀硫酸，稀磷溶液，还可以是有机酸如甲酸、乙酸、三氟乙酸；所说的碱溶液是无机碱溶液如氢氧化钠、氢氧化钾、氨水，或是有机碱溶液如三乙胺。
7.如权利要求5所述的方法，其中，步骤②所说的Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物选自Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-苯丙胺酰胺、Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-脯胺酰胺或Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-缬胺酰胺。
8.如权利要求5所述的方法，其中，步骤②所说的碳酸盐溶液选自碳酸氢钠，碳酸氢钾，碳酸钾或碳酸钠溶液或它们按照任意比混合后所得的组合物。
9.如权利要求5所述的方法，其中，步骤⑤所说的高效液相色谱法或高效液相色谱-质谱法使用的色谱柱可以是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，或者是以辛基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱。
10.如权利要求5所述的方法，其中，步骤⑤所说的高效液相色谱法，其检测波长为200～380nm，最佳检测波长为340±3nm。
11.如权利要求1所述的的分离测定方法；其特征是采用高效液相色谱法或其与质谱法联用分离测定普瑞巴林的手性异构体，其流动相可以是三乙胺水溶液-乙腈体系，还可以是三乙胺水溶液-甲醇体系。
12.如权利要求11所述的测定方法，其特征是三乙胺溶液中三乙胺的浓度为0.1～5％，用磷酸调pH 2.0～5.0。
13.如权利要求11所述的测定方法，其特征是流动相三乙胺溶液与乙腈或甲醇的比例为1∶2～2∶1。
全文摘要
本发明属分析化学领域，涉及普瑞巴林经衍生化后用高效液色谱法分离测定普瑞巴林的手性异构体(杂质)的方法。具体涉及以N
文档编号G01N30/74GK1786703SQ20051005738
公开日2006年6月14日 申请日期2006年2月5日 优先权日2006年2月5日
发明者张道林, 付晓泰, 诸葛明, 蔡教泉, 樊斌 申请人:重庆医药工业研究院有限责任公司, 上海复星医药(集团)股份有限公司