专利名称：普瑞巴林及其手性异构体的分离检测方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，涉及化合物柱前的衍生化反应及测定方法，具体涉及Na-(5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-缬胺酰胺与普瑞巴林及其手性异构体在高沸点的非质子性有机溶剂中于微波辅助条件下进行快速衍生化反应后，用非手性高效液相色谱法或非手性高效液相色谱与质谱联用分离测定普瑞巴林手性异构体的方法。
背景技术：
众所周知，柱前衍生化方法作为测定手性化合物含量的常用方法，也是一种高检测灵敏度的检测方法。对有手性中心且无紫外吸收或紫外吸收较弱的化合物，可采用合适的衍生化方法进行含量和手性异构体的准确测定。 普瑞巴林是一种弱紫外吸收的手性化合物，其化学名称为(S)-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，用于治疗癫痫和神经疼痛。普瑞巴林手性异构体几乎没有药理活性，其化学名称为00-3-(氨甲基)-5-甲基己酸，是普瑞巴林的重要杂质，也是控制普瑞巴林质量的重要指标。 通常，普瑞巴林原料药或用其制成的药物制剂中含有微量的普瑞巴林手性异构体，由于普瑞巴林及其手性异构体的紫外吸收很弱，使用常规的紫外检测普瑞巴林存在一定困难，检测微量普瑞巴林手性异构体就更加困难。现有技术中，使用手性高效液相色谱柱直接分离测定普瑞巴林手性异构体不但分离较差，且灵敏度低，试验成本高(参见:Journal ofChromatogr即hB 875 (2008) 148-153)。中国发明专利(专利号200510057381. 8，
公开日2006年6月14日)公开了一种普瑞巴林手性异构体的衍生化分离测定方法。该方法采用最为常用的Na-(5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物，例如Na - (5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-L-丙胺酰胺，作为衍生化试剂，与普瑞巴林在柱前通过水浴加热进行衍生化反应后，经减压干燥除去低沸点有机溶剂后重组，再用非手性高效液相色谱法分离测定普瑞巴林手性异构体。该方法的主要缺点在于使用N。-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物与普瑞巴林衍生化反应后，普瑞巴林手性异构体衍生物在普瑞巴林衍生物之后洗脱，因此其色谱峰展宽较大，两衍生物之间的分离度较小时，普瑞巴林手性异构体检测的灵敏度较低，准确性较差；使用该方法进行柱前衍生化反应需在水浴中进行长时间加热，且反应结束后需在五氧化二磷和氢氧化钾的体系中进行减压干燥以去除低沸点的有机溶剂，再用其他有机溶剂溶解并过滤以制备供试品溶液，后处理步骤非常繁琐，且五氧化二磷、低沸点有机溶剂废气的处理将增加分离检测成本并对环境造成影响；高效液相色谱所采用的流动相含有不挥发的无机磷酸盐，不适用于高效液相色谱-质谱联用分析系统。
发明内容
本发明中所提及的名词解释如下 普瑞巴林指的是化学名称为(3)-3-(氨甲基)-5_甲基己酸。
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普瑞巴林手性异构体指的是(R)-3-(氨甲基)_5-甲基己酸。 普瑞巴林消旋体指的是含(3)-3-(氨甲基)-5_甲基己酸和(R)-3-(氨甲
基)-5_甲基己酸，且含00-3-(氨甲基)-5-甲基己酸大于10%以上。 本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏、简便、快速并更经济的普瑞巴林及
其手性异构体的分离检测方法，所述方法具有检测灵敏度更高，成本更低，分析过程简单、
快速，且所使用的流动相更适合高效液相色谱与质谱联用等特点。 本发明提供了一种普瑞巴林及其手性异构体的分离检测方法，包括A)在进色谱柱前，将普瑞巴林与衍生化试剂溶解在高沸点的非质子性溶剂中，于微波辅助条件下进行快速衍生化反应，所述衍生化试剂为Na - (5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-氨基酸类化合物；
B)对衍生物采用非手性高效液相色谱或非手性高效液相色谱与质谱联用分离测定。 上述Na_(5-氟_2，4- 二硝基苯基)-D-氨基酸类化合物选自以下任一化合物Na - (5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-丙胺酰胺、Na - (5-氟_2， 4- 二硝基苯基)_D_苯丙胺酰胺、Na - (5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-脯胺酰胺或Na - (5-氟-2， 4- 二硝基苯基)_D_缬胺酰胺。优选Na - (5-氟-2 ， 4- 二硝基苯基)-D-缬胺酰胺。 使用Na_(5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-氨基酸类化合物为衍生化试剂，可使普瑞巴林手性异构体衍生物在普瑞巴林衍生物之前洗脱，而使用Na-(5-氟-2，4- 二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物作为衍生化试剂，则普瑞巴林手性异构体衍生物在普瑞巴林衍生物之后洗脱，因此使用Na-(5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-氨基酸类化合物为衍生化试剂与使用Na-(5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物为衍生化试剂相比，因为先洗脱的普瑞巴林手性异构体衍生物峰展宽较小，故检测灵敏度更高。此外，使用疏水性较强的Na-(5-氟-2，4- 二硝基苯基)-D-缬胺酰胺为衍生化试剂，在同一非手性高效液相色谱系统中，普瑞巴林与其手性异构体的衍生物之间的分离度大于采用Na - (5-氟-2， 4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺为衍生化试剂所得到的分离度，故检测结果的准确性较高。
所述高沸点的非质子性溶剂优选二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
本发明所提供一种普瑞巴林及其手性异构体的分离检测方法主要包括以下步骤 1)取普瑞巴林或含普瑞巴林的制剂适量，用水溶解并稀释后，配制成普瑞巴林溶液； 2)取衍生化试剂适量，用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺溶解，配制成衍生化试剂溶液； 3)取普瑞巴林溶液、衍生化试剂溶液和三乙胺溶液各适量，混合后密封成混合溶
液，该溶液含普瑞巴林与衍生化试剂的摩尔比为i : i i : ioo; 4)上述混合溶液在微波辅助的条件下进行衍生化反应1 5min，反应完毕，加入醋酸溶液，混匀，作为供试品溶液； 5)用非手性高效液相色谱或非手性高效液相色谱与质谱法联用分离测定步骤4)所得供试品溶液。 所述的衍生化试剂如上文所述，在步骤3)所述的衍生化反应前的混合溶液中，所
含普瑞巴林与衍生化试剂的摩尔比为i : i i : ioo，优选i : 2 i : 5，更优选i : 3。
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所述步骤4)微波辅助的条件可以使用能产生微波的装置产生微波，衍生化反应时间1 5min，优选2 4min，更优选3min。 本发明实施例使用微波炉，其功率可选择100W 1500W，优选400w 800W，更优选600W。 由于上述衍生化反应为双分子亲核取代反应，本发明采用了可促进该类反应且沸点较高的非质子性有机溶剂(二甲亚砜或二甲基甲酰胺)，并在微波辅助条件下进行快速衍生化反应1 5分钟，反应完毕勿需减压干燥除去溶剂后再重组，可直接用非手性高效液相色谱法分离测定普瑞巴林的手性异构体，因此大大縮短了供试品溶液的配制时间，操作更简便，成本更低，并且减少了低沸点有机溶剂对大气环境的污染。 在所述的分离检测方法中，非手性高效液相色谱或非手性高效液相色谱与质谱联
用所使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱或以辛基硅烷键合硅胶为
填料的色谱柱。高效液相色谱法的检测波长为200 380nm，优选340nm。 本发明所述的分离检测方法中，所使用的流动相为甲酸铵水溶液-乙腈体系，甲
酸铵水溶液与乙腈的比例为3 : 7 7 : 3，优选i : i或接近i : i。 所述甲酸铵水溶液的浓度为0. 01 lmol/L，优选0. lmol/L ;所述甲酸铵水溶液的pH值为2. 0 7. 0，优选pH值为3. 0。 本发明采用的流动相具有挥发性，调节甲酸铵水溶液的pH值所使用的有机酸选自挥发性的甲酸或乙酸，有机碱选自挥发性的氨水，而非不挥发的无机酸或无机碱，可适用于高效液相色谱_质谱联用分离系统。
图1为衍生化试剂空白的高效液相色谱图 图2为普瑞巴林消旋体(R构型与S构型)的高效液相色谱图
图3为普瑞巴林的高效液相色谱图
具体实施例方式
下面将结合实施例对本发明作进一步说明，可以使本领域专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
仪器与条件 美国Agilent 1100型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱；紫外检测波长340nm ;流动相0. lmol/L甲酸铵溶液(用甲酸调节pH值至3.0)-乙腈(49 : 51)。
实施步骤 取普瑞巴林消旋体约20mg置10ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；另取Na - (5-氟-2，4_ 二硝基苯基)-D-缬胺酰胺50mg，加入二甲亚砜溶解并稀释至50ml，摇匀，作为衍生化试剂溶液。取样品溶液20iU、衍生化试剂溶液200 iil和0. 05mol/L三乙胺溶液20 y 1置聚丙烯进样小瓶中，摇匀，用封口膜密封，置微波炉内，在600W加热衍生化3分钟，取出，冷却至室温，加入0. 05mol/L醋酸溶液20iU，摇匀，作为供试品溶液。取供试品溶液在上述条件下进行高效液相色谱分析，结果见图2。 图2中保留时间3. 867分钟的色谱峰为过量的衍生化试剂峰；保留时间8. 143分
钟和10. 192分钟的色谱峰分别为普瑞巴林手性异构体(R构型)衍生物和普瑞巴林(S构
型)衍生物的色谱峰。表明普瑞巴林衍生物与其手性异构体衍生物以及过量的衍生化试剂
可以达到基线分离。 实施例2 取普瑞巴林约20mg置10ml量瓶中，以下按照实施例1的实验步骤制备供试品溶液，并按实施例1的条件下进行高效液相色谱分析，结果见图3。 图3中保留时间3. 864分钟的色谱峰为过量的衍生化试剂峰；保留时间8. 140分钟和10. 188分钟的色谱峰分别普瑞巴林手性异构体(R构型，O. 3% )衍生物和普瑞巴林(S构型)衍生物衍生物的色谱峰。表明普瑞巴林衍生物与其手性异构体衍生物以及过量的衍生化试剂可以达到基线分离，并能准确测定普瑞巴林中含有的手性异构体杂质。
实施例3 按照实施例1的实验步骤配制试剂空白溶液，并按实施例1的条件下进行高效液相色谱分析，结果见图1。 图1中保留时间3. 871分钟的色谱峰为衍生化试剂峰；在普瑞巴林手性异构体(R构型)衍生物和普瑞巴林(S构型)衍生物的保留时间处无色谱峰，表明衍生化试剂不干扰
权利要求
一种普瑞巴林及其手性异构体的分离检测方法，包括A)在进色谱柱前，将普瑞巴林与衍生化试剂溶解在高沸点的非质子性有机溶剂中，于微波辅助条件下进行快速衍生化反应，所述衍生化试剂为Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-D-氨基酸类化合物；B)对衍生物采用非手性高效液相色谱或非手性高效液相色谱与质谱联用分离测定。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的衍生化试剂选自以下任一化合物Na - (5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-丙胺酰胺、Na - (5-氟-2， 4- 二硝基苯基)_D_苯丙胺酰胺、Na - (5-氟-2 ， 4- 二硝基苯基)-D-脯胺酰胺、Na - (5-氟-2 ， 4- 二硝基苯基)-D-缬胺酰胺。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的衍生化试剂为Na-(5-氟-2， 4- 二硝基苯基)-D-缬胺酰胺。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高沸点的非质子性有机溶剂为二甲基亚砜或二甲基甲酰胺。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤1) 取普瑞巴林适量，用水溶解并稀释后，配制成普瑞巴林溶液；2) 取衍生化试剂适量，用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺溶解，配制成衍生化试剂溶液；3) 取普瑞巴林溶液、衍生化试剂溶液和三乙胺溶液各适量，混合后密封成混合溶液，该溶液含普瑞巴林与衍生化试剂的摩尔比为1 : 1 1 : 100;4) 上述混合溶液在微波辅助的条件下进行衍生化反应1 5min，反应完毕，加入醋酸溶液，混匀，作为供试品溶液；5) 用非手性高效液相色谱或非手性高效液相色谱与质谱联用分离测定步骤4)所得的供试品溶液。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤4)在微波辅助条件下进行衍生化反应2 4min。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤3)的混合溶液含普瑞巴林与衍生化试剂的摩尔比为1 : 1 1 : 5。
8. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述非手性高效液相色谱或非手性高效液相与质谱联用所使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱或以辛基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱。
9. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述高效液相色谱法的检测波长为200 380nm。
10. 根据权利要求l-9所述的任一方法，其特征在于所述的高效液相色谱法或高效液相与质谱联用使用的流动相为甲酸铵水溶液_乙腈体系，所述甲酸铵水溶液的pH值为`2. 0 7. 0。
11. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述甲酸铵水溶液与乙腈的比例为`3 : 7 7 : 3。
12. 根据权利要求IO所述的方法，其特征在于所述甲酸铵水溶液的pH值使用甲酸、乙酸或氨水调节。
13. 根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的甲酸铵水溶液浓度为O. lmol/L。
全文摘要
本发明涉及一种普瑞巴林及其手性异构体的衍生化及分离检测方法。本发明提供的方法使用Nα-(5-氟-2，4-二硝基苯基)-D-氨基酸类化合物与普瑞巴林在高沸点的非质子性有机溶剂中于微波辅助条件下进行快速衍生化反应，反应完毕，对衍生物采用非手性高效液相色谱或非手性高效液相色谱与质谱联用分离测定。本发明所提供的方法适合分离检测普瑞巴林及其手性异构体，尤其适合分离检测含微量的普瑞巴林手性异构体的普瑞巴林药物或制剂。本发明所述的方法具有检测灵敏度更高，成本更低，分析过程简单、快速，并且所使用的流动相更适合高效液相色谱与质谱联用等特点。
文档编号G01N30/78GK101788542SQ20091004592
公开日2010年7月28日 申请日期2009年1月22日 优先权日2009年1月22日
发明者严翠霞, 凌文婷, 刘浩, 吴晓毅, 徐明明, 潘颖, 王伟毅 申请人:上海臣邦医药科技有限公司;上海市食品药品检验所