专利名称：Bmp-7在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制备防治慢性肝病肝纤维化、肝硬化技术的药物领域。
背景技术：
肝纤维化是各种慢性肝病病情发展的共同病理基础和病理特征。进展性的 肝纤维化可出现肝功能的减退，进而出现以肝小叶再生为特征的肝硬化，最终 导致肝功能的衰竭。近年来人们对肝纤维化的发生机制进行了深入广泛的探讨， 逐渐改变了传统肝纤维化不可逆转的观点[1]。但在实际临床工作中，人们对肝纤 维化的治疗仍然缺乏行之有效的措施。我国是一个肝病高发国家，每年因慢性 肝病纤维化以至发展成肝硬化都给众多患者及社会都带来巨大的损失，因此积 极探寻肝纤维化治疗的有效方法显得尤为紧迫。
骨形态发生蛋白(BMPs, Bone Morphogenic Proteins)是一组具有诱导新骨形 成的蛋白，也称骨形成蛋白(OPs, Osteogenic Proteins)。其中骨形态发生蛋白7 (BMP-7，也称OP-l)因其在骨折时能够促进断面骨小梁的形成，2001年已被美 国FDA批准用于临床121。但近年来的深入研究却表明，BMP-7在治疗组织纤维 化的领域中可能有着更为诱人的应用前景[3'4]。 BMP-7从形态和结构上分析，可 与转化生长因子卩l (TGF-betal, Transforming Growth factor f31) —起归属于 TGF-(3超家族中的一员，通过与细胞表面的受体结合，BMP-7却发挥了与TGF-(M 截然不同的作用[5]。早在2000年，Hruska等就发现，在单侧输尿管结扎的大鼠 肾损模型中，给予BMP-7五天即可以改善肾小管和肾间质的损害问。Bottiglio 等在研究狼疮性肾炎的小鼠模型中也观察到，持续给予BMP-7十六周可有效缓 解肾间质的炎症并阻止间质纤维化的形成和发生[7]。在随后的研究中，Klahr等 又证明了 BMP-7具有抗纤维化的类似现象[8]。这种种有趣现象的发现，引起了 人们对BMP-7作用机制的深思和探讨。新近的研究终于揭示了 BMP-7抗纤维化 作用的初步机制。ZeisbergM等在体内和体外均发现BMP-7可以逆转由TGF-|31 诱导的上皮细胞向间质细胞的转变，从而揭开了 BMP-7抗肾纤维化机制的一角 [3]; WangS等在肾病模型中也观察到了类似的BMP-7对TGF-pl的拮抗作用[91; 而Marie I等在对研究炎症性肠病模型的研究中又发现，BMP-7可以下调局部 TGF-pl的表达，从而显著改善了局部肠段的病理改变[1()。综合分析以上新近的 研究结果，强烈提示BMP-7具有抗组织纤维化的作用，其机制与拮抗TGF-(31 的作用或下调TGF-(31的表达密切相关。在慢性肝病时，TGF-(31是目前已知最强烈的纤维化促进因子，通过与细胞 表面的受体结合，产生至关重要的致纤维化的病理生理效应"'"'^。能否将BMP-7 应用于慢性肝病肝纤维化的防治？BMP-7在肝脏中是否也能够对抗TGF-pi的病 理生理效应？目前这方面的研究鲜见报道[13]。目前国内有关BMP-7的研究报道 还很少，仅有的几篇尚都局限于骨骼系统的研究[14'15]。国外的研究表明，生理状 态时，体内循环的BMP-7主要来自于肾脏，肝脏并无表达[16。但125[1]同位素 示踪实验已观察到，肝脏具有很强的与BMP-7结合的能力t17]。本专利发明人在 美国哈佛大学医学院研究肝脏再生的动物模型时，进一步发现了肝细胞和肝星 状细胞的表面分布有BMP-7的结合受体[18]。这些研究结果对BMP-7应用于实 验性肝纤维化治疗的设想已经提供了一定的基础性的依据，但BMP-7与肝脏中 的细胞结合以后能否产生抗纤维化的作用，能否进一步应用于临床，仍需要深 入地研究和观察，这也正是课题组专家的关注点所在。经过国家自然科学基金 项目(30570847)和上海市浦江人才计划项目(05PJ14098)资助的研究，本发 明人终于发现，BMP-7具有显著的预防和治疗实验性肝纤维化的作用，其作用 机制可能与以下因素有关(1)抑制细胞中促纤维化生长因子TGF-(31的信号通 道蛋白Smadl/3的活性；(2)抑制TGF-pl的表达。本研究同时也表明，BMP-7 在影响TGF-pi表达和信号的同时，对TGF-pi受体TPRI和TpRII的表达并无 明显影响。目前为止，关于BMP-7对实验性肝纤维化影响的研究，国内外尚未 见报道。
发明内容
现有技术问题在于目前临床除中药外，尚无有效治疗肝纤维化、肝硬化现 代单分子药物。
本发明提出了骨形态发生蛋白BMP-7在制备预防或/和治疗哺乳动物慢性 肝病肝纤维化、肝硬化药物中的应用；所述哺乳动物包括人。
如上所述应用，其中骨形态发生蛋白BMP-7在制备预防或/和治疗哺乳动 物实验性肝纤维化药物中的应用；所述哺乳动物包括人。
如上所述应用，其中将骨形态发生蛋白BMP-7用于哺乳动物腹腔隔日注 射，注射剂量为50-300pg/kg/次，时间在5 7周之间。
一种组合物，包括骨形态发生蛋白BMP-7，以及氰甲垸、三氟乙酸、牛血 清蛋白辅料、药学上可接受的缓冲液。
如上所述组合物，其中BMP-7的储存浓度在1.0-3.0mg/ml之间，使用浓度 为10-100|ng/ml。
该组合物在制备预防或/和治疗哺乳动物慢性肝病肝纤维化、肝硬化的药物 中的应用。
制备该组合物的方法，将骨形态发生蛋白BMP-7与氰甲烷，三氟乙酸，牛血清蛋白辅料，以药学上可接受的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液NaCl 137mmol/L， KC12.7mmol/L， Na2HP04 4.3mmol/L， KH2P041.4mmol/L)溶解，
以溶液的方式混合制备药剂。
本发明发现将BMP-7应用于预防和治疗实验性肝纤维化具有显著的作用。 其可以(1)抑制细胞中促纤维化生长因子TGF-pi的信号通道蛋白Smadl/3 的活性；(2)抑制TGF-pi的表达。
本发明的优点在于
(1)
(2)
(3)
(4)
BMP-7是体内存在的天然多肽，对人体无免疫原性、无致病性。 BMP-7在美国己被FDA批准用于骨折的辅助治疗，具有较好的安全 性。
BMP-7能够拮抗TGF-pi的病理生理作用，而TGF-pl是目前慢性肝 病中已知最强烈的纤维化促进因子，所以其应用于肝纤维化防治的 效果具备理论基础。
我国存在巨大的慢性肝病人群，BMP-7若能产业化推出，将具有较 好的应用前景。
图1猪血清腹腔注射法制备大鼠肝纤维化模型的肝组织Masson染色照片。
A为正常对照组(40倍)，B为2周模型组(40倍)，C为6周模型组(40倍)，
D为8周模型组(40倍)。
图2为双酶门脉灌注和梯度离心法分离的原代大鼠肝星状细胞和肝细胞。A
为原代分离的大鼠肝星状细胞，B为原代分离的大鼠肝细胞。
图3 10ng/ml的BMP-7对肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。
图4 10ng/ml的BMP-7对肝细胞分泌细胞外基质的影响。
图5 50ng/ml的BMP-7对肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。
图6 50ng/ml的BMP-7对肝细胞分泌细胞外基质的影响。
图7 100ng/ml的BMP-7对肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。
图8 100ng/ml的BMP-7对肝细胞分泌细胞外基质的影响。
图9 50ng/ml的BMP-7对肝星状细胞中TGF-pi表达的影响。A为处理前，
B为处理后。
图10 BMP-7对实验性大鼠肝纤维化的预防和治疗作用。A、 B、 C、 D和E 分别为不同实验组的肝组织病理学表现(Masson胶原染色，40倍)，A为正常 对照组，B为肝纤维化模型组，C为早期治疗组，D为逆转组(后期治疗组)，E 为预防组。
图11 BMP-7对实验性肝纤维化大鼠肝组织中TGF-pl表达的影响。其中泳 道1为模型组，2为后期治疗组，3为早期治疗组，4为预防组，5为正常对照组。
图12 BMP-7对实验性肝纤维化大鼠肝组织中TGF-pl表达的影响。A为模 型组，B为早期治疗组。
具体实施例方式
1. 成功地制备了大鼠肝纤维化模型
运用猪血清腹腔反复注射法，诱导免疫性大鼠肝纤维化模型。猪血清0.5ml/ 次，腹腔注射实验大鼠，每周两次，共8周。如图1所示。
2. 从模型动物中成功地分离、培养肝细胞和肝星状细胞。
运用双酶(I型胶原酶和链霉蛋白酶E)门脉灌注及剃度离心法，分别分离 实验动物的肝细胞和肝星状细胞。如图2所示。
3. 观察BMP-7分别对原代肝细胞胶原产生和分泌能力的影响。 本发明中的BMP-7购于美国Sigma公司，纯度大于95%(每个包装的BMP-7
冻干粉剂，含0.2拜BMP-7， 33%氰甲垸，0.1%三氟乙酸，0.5mg牛血清蛋白)， 使用前储存于-20。C，无需其它处理。
使用10ng/ml、 50ng/ml和100ng/ml浓度的BMP-7分别加入肝星状细胞和 肝细胞的培养液中，分别于培养24小时和96小时后，收集细胞培养液和细胞 匀浆液，用酶联免疫吸附法检测其中的细胞外基质。如图3-图8所示，结果发 现，与对照组相比，BMP-7可显著减少肝星状细胞中细胞外基质的产生和分泌，
特别是i、 m型胶原影响较为明显，对IV型胶原的影响相对较小；但实验发现，
BMP-7对肝细胞中细胞外基质的产生和分泌影响较小。浓度为50ng/ml BMP-7 的作用较10ng/ml的作用为强，但与100ng/ml的浓度无明显区别。
4. 在体外水平上研究BMP-7可能存在的作用机制。 (1) BMP-7对TGF-pi结合受体的影响。
在体外水平观察BMP-7对实验性肝纤维化的影响机制运用双标记免疫荧 光技术，分别通过细胞免疫双荧光和组织免疫双荧光技术检测BMP-7受体在纤 维化肝脏中的定位，并检测TGF-pl受体和磷酸化Smad信号通道蛋白的改变， 运用Real time PCR检测TGF-pl的表达，分别观察BMP-7对TGF-卩1结合受体 的影响，BMP-7对TGF-(31细胞内信号传导通道的影响以及BMP-7对肝星状细 胞TGF-pi表达的影响。
设立实验组与正常对照组，使用50ng/ml的BMP-7加入肝星状细胞的培养 液中，培养96小时后，观察BMP-7分别对肝星状细胞表面T|3R-I和T卩R-II的 影响。结果发现，BMP-7对肝星状细胞表面TGF-pl结合受体TPR-I的表达或TpR-II的表达均无明显影响。
(2) BMP-7对TGF-pi细胞内信号传导通道的影响。
Smad蛋白为TGF-P超家族成员的细胞内信号传导通道蛋白，被激活后可发 生磷酸化并移行至细胞核内。Smad2/3为TGF-pl的信号传导蛋白。使用50ng/ml 的BMP-7分别加入肝星状细胞和肝细胞的培养液中，培养96小时后，观察 BMP-7分别对肝细胞和肝星状细胞中的影响。结果发现，BMP-7可以明显抑制 肝星状细胞和肝细胞中Smad2/3激活表达。
(3) BMP-7对肝星状细胞TGF-pi表达的影响。 对分离培养的激活后的肝星状细胞，用50ng/ml的BMP-7进行处理，96小
时后，作Real-time PCR检测TGF-pl的表达。使用引物为 rat TGF P 1 f: 5，-ACTACACGCGAAGGCACAGC國3， rat TGF 0 1 r: 5，-CTGCTCCTTCTTGTCTCCCGA-3' rat TGF P 1 probe: fam-5，-ctggagcccgcggtgattgtagagc-3，-tamara 73 如图9所示，结果发现，BMP-7可显著抑制激活后的肝星状细胞中TGF-pi
的表达。
5.在活体水平上研究BMP-7对大鼠肝纤维化的影响及其机制。
(1) 制备免疫性大鼠肝纤维化模型。运用猪血清腹腔反复注射法，诱导免 疫性大鼠肝纤维化模型。猪血清0.5ml/次，腹腔注射实验大鼠，每周两次，共8 周。
(2) BMP-7预防、治疗大鼠肝纤维化。实验动物分为5组①肝纤维化模 型组；②治疗组自第二周起(肝纤维化开始发生)，给予100ng/kg的BMP-7，
(BMP-7制剂为冻干粉剂，含0,2nmBMP-7， 33%氰甲烷，0.1%三氟乙酸，0.5mg 牛血清蛋白，用磷酸盐缓冲液(NaCl 137mmol/L， KC1 2.7mmol/L， Na2HP04 4.3腿ol/L， KH2P04 1.4mmol/L)或枸橼酸盐缓冲液(取2.1 %枸橼酸水溶液， 用50%氢氧化钠溶液调节pH值至6.2)溶解，配成BMP-7的浓度为 1.0mg/ml-3.0mg/ml的溶液储存。使用时，用磷酸盐缓冲液或枸橼酸盐缓冲液稀 释成50问/ml的浓度使用液。也可以根据实际情况配成稍浓或者更稀的溶液， 以便于给药时精确取量而同时又不明显影响实验动物的循环体液量为准。根据 剂量，给予使用液腹腔注射，隔日一次。③逆转组自第四周起(肝纤维化已经 形成)，给予lOOpg/kg的BMP-7使用液，腹腔注射，隔日一次。④预防组自 实验开始起(肝纤维化尚未发生)，给予lOOpg/kg的BMP-7使用液，腹腔注射， 隔日一次。⑤正常对照组即阴性对照组，给予等量磷酸盐缓冲液腹腔注射， 隔日一次。各组治疗时间分别为5 7周。如图10所示，结果发现，BMP-7对实验性肝纤维化具有明显的预防和治疗 作用；使用越早，效果越明显。
(3) BMP-7对实验性肝纤维化大鼠肝组织中TGF-P1表达的影响。 运用免疫印迹(Western Blot)的方法。如图11所示，结果发现，BMP-7
可以显著抑制肝纤维化大鼠肝组织中TGF-pi的表达。
(4) 免疫组化检测BMP-7对实验性肝纤维化大鼠肝组织中TGF-pl表达的影响。
如图12所示，结果发现，BMP-7可以抑制纤维化肝组织中TGF-pi的表达。 6.结论
综上所见，该课题通过体内、体外的研究，在活体水平上观察BMP-7对实 验性肝纤维化大鼠肝组织中TGF-pl表达的影响实验大鼠做肝组织切片免疫荧 光染色，分别检测肝纤维化模型组与治疗组中TGF-pl的表达，结果发现，治疗 组中TGF-pl表达降低，BMP-7可以抑制纤维化肝组织中TGF-pi的表达。BMP-7 具有显著的预防和治疗实验性肝纤维化的作用。
参考文献
1. 程明亮，杨长青.肝纤维化的基础研究及临床.第二版，北京人民卫生出
版社，2002
2. Friedlaender GE， Perry CR， Cole JD， et al. Osteogenic protein-1 (Bone porphogenetic protein-7) in the treatment of tibial nonunions. J Bone Joint Surg， 2001;83-A:S1，151-158
3. Gregory KE， Ono RN, Charbonneau NL, et al. The Prodomain of BMP-7 Targets the BMP-7 Complex to the Extracellular Matrix. J Biol Chem， 2005; 280: 27970-27980
4. Negri AL. Prevention of progressive fibrosis in chronic renal diseases: antifibrotic agents. J Nephrol, 2004; 17: 496-503
5. Heldin CH， Miyazono K, Dijke PT. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature, 1997; 390: 465-471
6. Haruska KA， Guo Q Wozniak M， et al. Osteogenic protein-1 prevents renal fibrogenesis associated with ureteral obstruction. Am J Physiol Renal Physiol， 2000; 279:F130-F149
7. Bottiglio C， Maeshima Y， Kalluri R. Osteogenic protein-1 reduces glomerulonephritis associated with a mouse model for lupus nephritis. J Am Soc N印hrol， 2000; 11:524A
8. Klahr S, Morrissey J， Hruska K， et al. Comparative effects of ACE inhibition andangiotensin II receptor blockade in the prevention of renal damage. Kidney Int， 2002; S卿l: 23-26
9. Wiang S， Hirschberg R. BMP-7 antagonizes TGF-beta-dependent fibrogenesis in mesangial cells. Am J Physiol Renal Physiol, 2003; 284: F1006-1013
10. Maric I， Poljak L， Zoricic S， et al. Bone morphogenetic protein-7 reduces the severity of colon tissue damage and accelerates the healing of inflammatory bowel disease in rats. J Cell Physiol, 2003; 196: 258-264
11 .Bauer M， Schuppan D. TGF-betal in liver fibrosis: time to change paradigms FEBS Lett, 2001;502:1-3
12. Friedman SL. Liver fibrosis-from bench to bedside. J Hepatol, 2003; 38:S35-S53
13. Changqing Yang, Hikaru Sugimoto, Valerie S LeBleu, Mary A Soubasakos, Mauricio Giraldo， Michael Zeisberg， and Raghu Kalluri. BMP-7 functions as a novel hormone to facilitate liver regeneration. FASEB J. 2007; 21 (1)256-264 (Changqing Yang and Hikaru Sugimoto contributed equally to this paper)
14. 孟国林，胡蕴玉.骨形态发生蛋白-7 (BMP-7)在骨骼系统中的作用.中国矫 形外科杂志，2000;7:274-276
15. 鱼兵，范清宇，阎露，等.人骨形成蛋白7基因的克隆及其在兔骨髓基质干 细胞中的瞬时表达.中国现代医学杂志，2005; 15: 985-988
16.0zkaynak E， Schnegelsberg PN， Oppermann H. Murine osteogenic protein (OP-l》high levels of mRNA in kidney. Biochem Biophys Res Commun. 1991; 30; 179:116-23
17. Bosukonda DA， Shih MS， Sampath KT. Characterization of receptors for osteogenic protein-1/bone morphogenetic protein-7(OP國l/BMP-7) in rat kidneys. Kidney Int， 2000; 58: 1902-1911
18. Yang C， Sugimoto H, Akulapalli S， et al. Effects of BMP-7 on liver regeneration after partial hepatectomy in mice. Gastroenterology. 2003; 124(4)Suppl 1: A-75权利要求
1.骨形态发生蛋白BMP-7在制备预防或/和治疗哺乳动物慢性肝病肝纤维化、肝硬化药物中的应用。
2. 如权利要求1所述应用，特征在于骨形态发生蛋白BMP-7在制备预防或/ 和治疗哺乳动物实验性肝纤维化药物中的应用；所述哺乳动物包括人。
3. 如权利要求l所述应用，特征在于，将骨形态发生蛋白BMP-7用于哺乳 动物腹腔隔日注射，注射剂量为50-300吗/kg/次，时间在5 7周之间。
4. 一种组合物，包括骨形态发生蛋白BMP-7，以及氰甲烷、三氟乙酸、牛血 清蛋白辅料、药学上可接受的缓冲液。
5. 如权利要求4所述的组合物，特征在于BMP-7的储存浓度在1.0-3.0mg/ml 之间，使用浓度为10-100吗/ml。
6. 如权利要求4所述的组合物在制备预防或/和治疗哺乳动物慢性肝病肝纤 维化、肝硬化的药物中的应用。
7. 制备权利要求4所述组合物的方法，特征在于将骨形态发生蛋白BMP-7 与氰甲垸、三氟乙酸、牛血清蛋白辅料，以药学上可接受的缓冲液溶解， 以溶液的方式混合制备药剂。
全文摘要
本发明BMP-7在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用，属于医疗技术领域。通过动物模型及体外细胞实验，制备大鼠肝纤维化模型，分离实验动物的肝细胞和肝星状细胞，观察骨形态发生蛋白BMP-7对实验性肝纤维化的影响。结果发现，BMP-7可以抑制细胞中TGF-β1的信号通道蛋白Smad 1/3的活性，并抑制TGF-β1的表达。动物实验结果表明，BMP-7对实验性肝纤维化具有明显的预防和治疗作用。
文档编号A61P1/00GK101301467SQ200810036429
公开日2008年11月12日 申请日期2008年4月22日 优先权日2008年4月22日
发明者常义忠, 丽 杨, 杨长青, 王胜兰 申请人:同济大学