专利名称：从感染细胞中回收和纯化痘病毒的方法
技术领域：
本发明涉及从感染细胞中回收痘病毒(poxvirus)，特别是改良的安卡拉痘苗病毒(痘苗病毒Ankara，MVA)，的方法。根据本发明，将痘病毒感染细胞进行高压匀浆作用以获得含痘病毒的匀浆物。可将含痘病毒的匀浆物进行至少一个纯化步骤以获得痘病毒富集部分。本发明进一步涉及根据本发明方法获得的含痘病毒部分和含痘病毒的匀浆物。
背景技术：
痘病毒科(poxviridae)由在脊椎动物和无脊椎动物细胞质中复制的庞大复杂DNA病毒家族组成。痘病毒科可分为chordopoxvirinae(脊椎动物痘病毒)和entomopoxvirinae(昆虫痘病毒)两个亚科。
脊椎动物痘病毒包括几种具有重要经济价值的动物痘病毒(分类于不同的属)，例如骆驼痘病毒(camelpox viruses)、绵羊痘病毒(sheeppoxvirus)、山羊痘病毒(goatpox virus)或禽痘病毒(avipoxviruses)，尤其是家禽痘病毒(fowlpoxvirus)。对于预防绵羊天花和山羊天花的家畜接种，可使用减毒活病毒或灭活病毒。对于家禽接种已经开发了以禽痘病毒为载体的重组疫苗。
由于痘病毒可感染人类细胞，因此推测也可将其用作在人体中表达异源基因的载体并诱导相应的免疫反应。US 5736368和US 6051410公开了基因组中含有HIV基因的家禽痘病毒。
到目前为止，作为正痘病毒属成员之一的天花病毒是人类最重要的痘病毒。同为痘病毒科正痘病毒属成员之一的痘苗病毒被用作抵御天花的活疫苗。全世界范围内用痘苗病毒进行的成功接种使天花病毒彻底根除(Theglobal eradication of smallpox。Final report of the global commissionfor the certification of smallpox eradication；History of PublicHealth，No.4，GenevaWorld Health Organization，1980)。自WHO宣布之后，除面临高度感染痘病毒危险的人员(例如实验室工作人员)之外接种已经中断了许多年。由于痘苗病毒可能具有被用于生物战争或被生物恐怖分子利用的危险，使得接种计划再次引起人们的兴趣。
最近，痘苗病毒也已经被用于工程化重组基因表达病毒载体以及作为潜在的重组活疫苗(Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.P.N.A.S.USA 797415 7419；Smith，G.L.，Mackett，M.和Moss，B.Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2，383～407)。这需要借助DNA重组技术将编码所导入外源抗原的DNA序列导入痘苗病毒基因组中。如果该基因整合至病毒DNA上某个病毒生命周期非必需位点，那么该新产生的重组痘苗病毒就可能具有感染性，也就是说能够感染异种细胞并因此表达整合的DNA序列(EP专利申请No.83286和No.110385)。一方面，以这种方式制备的重组痘苗病毒可用作预防传染病的活疫苗，另一方面，也可用于在真核细胞中制备外源蛋白质。
为开发重组活疫苗，痘苗病毒作为载体的用途受到安全问题及法规的影响。文献中描述的大部分重组痘苗病毒都是以痘苗病毒Western Reservestrain为基础的。由于该毒株公知具有强神经毒性因而极不适于在人和动物中使用(Morita et al.，Vaccine 5，65～70)。另一方面，改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)却公知是特别安全的。MVA为痘苗病毒安卡拉株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上经长期连续传代获得(参见Mayr，A.的综述，Hochstein-Mintzel，V.和Stickl，H.Infection 3，6-14；瑞士专利No.568 392)。按布达佩斯条约要求保藏的MVA病毒株有保藏在位于Salisbury(UK)的欧洲动物细胞保藏中心(European Collection of AnimalCell Cultures，ECACC)的毒株MVA 572、MVA 575和MVA-BN，保藏编号分别为ECACC V94012707、ECACC V00120707和ECACC V00083008。MVA之所以特别是由于其极大的减毒作用，也即具有削弱的毒性或感染性但却同时保持良好的免疫原性。为鉴定MVA病毒基因组中相对于野生型CVA毒株的变化已经对MVA病毒进行了分析。已鉴定出6个主要基因组DNA缺失(缺失I、II、III、IV、V和VI)，共计31,000个碱基对(Meyer，H.，Sutter，G.和Mayr A.J.Gen.Virol.，72，1031～1038)。所形成的MVA病毒严格限制于鸟类宿主细胞。此外，MVA的特征在于其极端的减毒作用。用多种动物模型进行试验证明，MVA甚至在免疫抑制动物中都是无毒的。更重要的是，MVA的优越特性已经在广泛的临床试验中得到了证明(Mayr etal.，Zbl.Bakt.Hyg.1，Abt.Org.B 167 375～390，Stickl etal.，Dtsch.med.Wschr.99，2386～2392)。在这些对超过包括高危病人在内的120 000名个体进行的研究中，使用MVA疫苗没有出现副作用。已经构建并在临床试验中使用了可用作疫苗的重组MVA。WO 98/13500公开了一个含有且能够表达一个或多个编码登革热病毒(dengue virus)抗原DNA序列的重组MVA。外源DNA序列在MVA基因组中天然产生缺失的位置重组进病毒DNA。
用痘病毒或重组痘病毒接种前，必须将病毒纯化至一定程度以符合规章要求。传统纯化痘病毒，特别是MVA和重组MVA，的方法如下述第一步培养易感细胞及其对应的痘病毒。MVA的易感细胞例如是鸡胚成纤维细胞。用痘病毒感染易感细胞并培养一段足够允许病毒子代产生的时间。之后冻融细胞以从培养物表面分离并部分破碎细胞。离心沉淀完整细胞和破碎细胞的混合物。用超声制备匀浆物。用蔗糖垫层(sucrose cushions)离心自匀浆物纯化病毒(Joklik WK.“The purification of four strains ofpoxvirus”Virology 1962；189～18)。该过程中的关键步骤是用超声波进行匀浆(Hedstrom，K.G.和Lindberg，U.，Z.Immun.Forsch.1969137421～430；Stickl，H.，Korb，W.和Hochstein-Mintzel，V.，Zbl.Bakt.，1.Abt.Orig.(1970)，215，38～50)。在工业过程中，优选所有的处理步骤都易于控制和重复。然而用超声波匀浆病毒细胞悬液的缺点是超声步骤难于以相同的方式重复、难于调节且难于将该方法从实验室规模放大至工业规模。
发明目的因此，本发明的一个目的是提供一种从痘病毒感染细胞回收痘病毒的方法，特别是痘苗病毒例如MVA毒株，其中对感染细胞的匀浆作用是可重复、易于控制的且易于从实验室规模扩到至工业规模。
发明详述本发明涉及从感染细胞回收痘病毒的方法，尤其是痘苗病毒，例如Elstree株或改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)。根据本发明的从感染细胞回收痘病毒的方法包括将痘病毒感染细胞进行高压匀浆作用以获得含痘病毒匀浆物的步骤。
根据本发明的方法可以回收完整、具感染力的痘病毒是预料不到的。高压匀浆作用常用于在从真核或原核细胞中分离蛋白质和脂质时破碎细胞和亚细胞结构。US 3 983 008公开了将一种经高压匀浆作用从微生物细胞中抽提有用成分的方法。所抽提的化合物是酵母蛋白质、细菌酶和酵母脂质。DE 19918619公开了高压匀浆用于从酵母细胞中分离HbsAg的用途。US 4 255521描述了一种经高压释放从微生物细胞中抽提葡萄糖异构酶的方法。高压匀浆也被用于自重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离病毒样颗粒(VLP)(Milburn和Dunnill(1994)Biotechnology andBioengineering 44，736～744)，以及腺病毒载体的生产和纯化(US 6 194191)。VLP和腺病毒是无包膜并相当小且简单的病毒，因而类似细胞蛋白质结构。因此，已显示出适于从细胞中分离蛋白质的高压匀浆作用也可以被用于自真核细胞中分离腺病毒和VLP并不令人感到惊奇。相反，细胞内成熟的痘病毒病毒体(IMV，参见下述，参见Fields et al.，Fields Virology，1996，Lippincott-Raven publishers，Philadelphia，USA，ISBN0-7817-0253-4，第83章，第2654～5页)具有非常复杂、涉及其它脂膜的形态学构造。在某些方面，与跟无包膜病毒的形态学及物理特性相比，痘病毒IMV的形态学及物理特性更接近于细胞的形态学和物理特性。因而可以期望用于经高压匀浆作用破坏细胞的条件也可由于破坏痘病毒。因此，高压匀浆作用破碎了细胞但是却留下足够用于进一步提纯的完整痘病毒这样的结果是令人惊奇的。换言之，人们无法预测到高压匀浆可用于从感染细胞中回收痘病毒。事实上，已知的从感染细胞回收痘病毒的方法采用的是超声波匀浆，这是一种相当温和的匀浆方式。与采用超声波的回收方法相反，根据本发明的方法允许对感染细胞的可重复匀浆；该方法易于控制且易于将该过程从实验室规模放大至工业规模。
本发明上下文中术语“痘病毒”是指属于痘病毒科的任意一种病毒。根据本发明的方法优选用痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科实施，更优选正痘病毒(orthopoxvirus)属、禽痘病毒(avipoxvirus)属、山羊痘病毒(capripoxvirus)和猪痘病毒(suipoxvirus)属。本发明最优选涉及回收和纯化选自包括痘苗病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、金丝雀痘病毒(canarypoxvirus)及家禽痘病毒的组中的痘病毒的方法。特别优选的是痘苗病毒。根据本发明方法所使用的痘苗病毒株的例子有毒株Elstree、Wyeth、Copenhagen、Temple of Heaven、NYCBH、Western Reserve。该发明并不受限于那些特别提到的痘苗病毒株，而是可以用任一痘苗病毒株代替。痘苗病毒株的一个优选例子是改良的安卡拉痘苗病毒株(MVA)。一个典型的MVA毒株是保藏于欧洲动物细胞保藏中心、保藏编号为ECACCV00120707的MVA575。最优选的是MVA-BN或其衍生物。MVA-BN已描述于WO 02/42480(PCT/EP01/13628)。所述的国际申请公开了能够鉴定某一MVA株是否为MVA-BN或其衍生物的生物检测方法以及能够获得MVA-BN或其衍生物的方法。该申请的内容在本申请中用作参考。MVA-BN已保藏于欧洲动物细胞保藏中心，保藏编号为ECACC V00083008。
所要回收的病毒可以是天然病毒、减毒病毒或重组病毒。
术语“重组病毒”是指任意一种病毒基因组中插入了一个外源基因的病毒，该外源基因不是病毒基因组的天然部分。外源基因可以是治疗基因、编码包括至少一个表位以诱导免疫反应的抗原或多肽的基因、反义表达盒或核酶。获得重组病毒的方法是本领域技术人员公知的。外源基因优选插入病毒基因组的非必需区域。在本发明的另一优选实施例中，外源核酸序列插入MVA基因组上天然产生缺失的部位(公开在PCT/EP96/02926)。
“减毒病毒”是指与非减毒亲本病毒相比在感染后导致宿主微生物较低死亡率和/或发病率的病毒。减毒痘苗病毒的一个例子是MVA毒株，尤其是MVA-575和MVA-BN。
痘病毒，例如痘苗病毒，已知以两种不同的形式存在在感染细胞的细胞质中附着于细胞膜的痘病毒(细胞内的成熟病毒粒子(IMV))和已经外化的病毒(细胞外的包膜病毒粒子(EEV))(Vanderplasschen A，Hollinshead M，Smith GL“Intracellular and extracellular vacciniavirions enter cells by different mechanisms”J.Gen.Virol.(1998)，79，877～887)。IMV和EEV都具有感染性，但由于EEV含有一酯蛋白包膜因而它们在形态上不相同。正常情况下IMV粒子比EEV更丰富，但是根据本发明的方法两种类型的粒子都可得到。
根据本发明匀浆步骤的起始材料是被各自痘病毒感染的细胞。根据本发明，用于定义匀浆起始材料的术语“被感染细胞”是指用各自病毒感染的完整细胞、各自病毒所附着的被感染细胞的部分或片断、或完整细胞和酶解/破碎细胞的混合物。被感染细胞的部分或片断的粒子有各自病毒所附着的破碎/酶解细胞的细胞膜。起始材料也包括既未附着于细胞膜也未定位于细胞内的游离病毒粒子。
为获得作为本发明方法起始材料的被感染细胞用各自的痘病毒感染真核细胞。真核细胞是对各自痘病毒的易感细胞并允许有感染力病毒的复制和产生。对于所有痘病毒这样的细胞是本领域技术人员公知的。对MVA和痘苗病毒株Elstree来说，该类型细胞的一个例子是鸡胚成纤维细胞(CEF)(Drexler I.，Heller K.，Wahren B.，Erfle V.和Sutter G。“高度减毒的改良安卡拉痘苗可在幼鼠肾细胞，一种病毒增殖的潜在宿主，中复制但是不能在各种人转化或原代细胞中复制”J.Gen.Virol.(1998)，79，347～352)。CEF细胞可以在本领域技术人员公知的条件下培养。优选CEF细胞固定或摇瓶培养于无血清培养基。优选于37±2℃下培养48至72小时。感染优选采用感染复数(MOI)为0.05至1 TCID50的痘病毒，且优选于37±2℃下培养48至72小时。
可通过查看细胞病变效应(CPE)来观察感染过程，典型出现被感染细胞显著变圆(rounding)。
本发明允许从被感染细胞中回收痘病毒，例如Elstree或MVA。术语“回收”的意思是，本发明的方法允许破碎被痘病毒感染的细胞和/或将痘病毒从它们通常结合的细胞膜上分离，以达到进一步可以进一步纯化痘病毒的程度。因此，从被感染细胞回收痘病毒的产物(本申请中指“含痘病毒的匀浆物”)是一种游离痘病毒和细胞碎片的均质混合物，其仅含有微量完整、未破碎细胞以及结合于细胞膜的病毒。
如果被感染细胞是可经悬浮培养培养的细胞，那被感染细胞可以容易地经通过离心收集。如果被感染细胞或多或少是完整贴壁细胞，应当在将它们进行高压匀浆前将它们从培养瓶中收集也就是清除下来。这样的方法对本领域技术人员是公知的。实用方法有机械方法(例如使用橡皮细胞刮刀)、物理方法(例如将培养容器于-15℃以下冷冻和+15℃以上融化)或生化方法(用酶处理，例如胰蛋白酶，将细胞从培养容器上分离下来)。若为该目的而使用酶，则应当控制温育时间，因为温育过程中这些酶可能会破坏病毒。
在根据本发明的方法中对被感染细胞，更特别是收集的被感染细胞，施加高压匀浆步骤。本说明书中，术语“高压匀浆”有时简写为“HPH”。高压匀浆具有双重作用。一方面，高压匀浆导致完整细胞的破碎。这样，IMV被释放并可用于进一步纯化。另一方面，高压匀浆具有使痘病毒从细胞膜分离或至少细胞-膜-病毒聚合体的大小被减小的效果。此外，这简化了对痘病毒的进一步纯化。
本领域技术人员熟悉高压匀浆的一般原理(White MD，Marcus D.，“Disintegration of microorganisms”，Adv.Biotechnol.Processes1988；851～96)。HPH系统是以在受控且可重复的条件下利用高压迫使样品高速通过一固定小孔为基础的。本说明书中术语“喷头”“孔”“喷嘴”可交替使用。
每个细胞破碎仪的心脏是破碎头。破碎头优选包括(I)高压腔/缸，(II)移入腔/缸并从而提高腔/缸内压力的高压活塞，以及(III)喷头/喷嘴，通过它来喷射腔内容物。所喷射出的腔内容物被指向一个靶表面，例如一片优选具有允许冷却的热交换表面的金属。为收集破碎的腔内容物，系统中配备了收集破碎样品的装置(称作“收集腔”)。典型的高压匀浆单元有Constant Cell Disruption Systems(Low March，Daventry，Northants，NN114SD，United Kingdom)的Basic Z+。
在一个优选实施方式中，用高压匀浆系统实现细胞破碎有三个阶段。(I)将样品导入高压腔/缸。随后升高腔/缸中的压力。最终高压活塞下降。(II)随后高压活塞推动样品以高速通过喷嘴。样品从高压区域向低压区域的快速转移导致细胞破碎。(III)样品击中靶并放射状覆盖于冷却的热交换表面。随后产物流至一腔以收集。重调水压并继续该循环。在该过程末期将喷射的匀浆物视体积收集至适宜小瓶中。
根据本发明，为回收痘病毒，喷嘴直径范围在0.10～0.6mm、0.15～0.6mm、0.15～0.50mm之间，优选范围在0.15～0.40mm、0.20～0.50mm，更优选在0.20～0.40mm之间，最优选在0.25mm～0.35mm之间。最优选直径的例子是在0.25～0.35mm之间。
设定压力腔/缸中的压力值为200～1000巴，优选400～1000巴、200～800巴，更优选400～800巴、600～1000巴，甚至更优选600～900巴，最优选700～900巴。最优选压力为800巴。
匀浆物在出口的温度优选不超过+25℃，且优选低于15℃，最优选低于10℃。
根据本发明的方法可以被几乎线性放大，并或以分批方式或以连续方式运作。
分批方法中，所要匀浆的每批细胞可以接受一次或多次高压匀浆步骤。优选每批接受一至三次匀浆步骤，最优选仅一次。
优选可通过测定如上所定义起始材料和经匀浆步骤后所获得材料的病毒滴度(等于有感染力病毒粒子的数量，测定组织培养感染量(TCID50)或噬斑形成单位(pfu))来检查匀浆步骤的成功与否。换言之，也就是在高压匀浆前、后测定病毒滴度。起始材料包含或多或少的完整细胞和占有高百分比的包含结合于细胞膜的痘病毒颗粒大聚合体。若用这一材料测定病毒滴度，则所获得的滴度低于实际具感染力颗粒的数量。这是由于用于测定病毒滴度的测试系统通常是细胞培养物系统(例如实施例2中所公开的系统)，该系统中对被感染细胞数量或菌斑数量进行计数。这一系统不能区分仅由一个病毒粒子造成的一个细胞感染和由例如结合于细胞膜的病毒颗粒大聚合体造成的细胞感染所产生的阳性结果。高压匀浆后痘病毒从细胞膜分离和/或细胞膜-病毒聚合体的大小显著减小，从而产生大量小聚合体。若用该材料用于滴度测定则所获得的结果较高，即使实际具感染力颗粒的数量并没有改变。因此，优选用至少平均值或与起始材料相比匀浆物较高的TCID50/ml(“TCID”是“组织培养感染量”的缩写)来反映匀浆步骤的成功与否。实施例部分中详细说明了如何测定TCID50/ml值。作为选择，可用电子显微镜来鉴定高压匀浆的质量及成功与否。
为进一步纯化，将获得的匀浆物进行至少一次纯化步骤以获得痘病毒-富集部分。特别地，这些步骤可被用于含痘苗病毒的匀浆物，如果要用该匀浆物进一步所述的痘苗病毒。
除其他因素外，纯化步骤可以是——分批离心(例如用蔗糖垫层(sucrose cushions))或连续的流式超离心(蔗糖梯度)(Hilfenhaus，J.，Kohler，R.和Gruschkau，H.，J.Biol.Stand.(1976)4，285～293；Madalinski，W.，Bankovski，A.和Korbecki，M.，Acta Virol.(1977)21，104～108)，——超滤(例如用孔径大于500kDa但等于或小于0.1μm的膜进行交叉流过滤)，——柱层析(例如离子交换，疏水作用，大小排阻或组合)(Hedstrom，K.G.和Lindberg，U.，Z.Immun.Forsch.1969 137421～430；Stickl，H.，Korb，W.)和Hochstein-Mintzel，V.，Zbl.Bakt.，1.Abt.Orig.(1970)，215，38～50)或——上述全部的组合(Masuda，N.，Ellen，R.P.和Grove，D.A.，J.Bacteriol.(1981)，147(3)，1095～1104).
本领域技术人员公知的其它任一纯化方法也在本发明范围内。
优选纯化步骤为超滤步骤。最优选超滤为交叉流过滤。交叉流过滤的原理是本领域技术人员公知的。参见，例如Richards，G.P.和Goldmintz，D.，J.Virol.Methods(1982)，4(3)，第147～153页“Evaluation ofa cross-flow filtration technique for extraction of poliovirusesfrom inoculated oyster tissue homogenates”。
尽管一个纯化步骤可能足以满足生物医疗产品的规章要求，为获得甚至更纯的产品可以采用两次或更多次上面提及的纯化步骤。
在最优选实施方式中，纯化步骤为交叉流过滤之后进行至少一次柱层析步骤。最优选柱层析步骤为离子交换或疏水作用。
可选地将获得的病毒富集部分冻干。冻干方法为本领域技术人员公知(Day J.和McLellan M.，Methods in Molecular Biology(1995)，38，Humana Press，“Cryopreservation and freeze-drying protocols”)。
本发明进一步涉及根据本发明回收痘病毒的方法，即包含对被感染细胞进行高压匀浆步骤的方法，所获得的痘病毒富集部分和/或含痘病毒的匀浆物。特别地，本发明涉及根据本发明的回收/纯化方法，即其中将经HPH获得的含痘病毒匀浆物进行至少一次纯化步骤的方法，所获得的痘病毒富集部分。痘病毒可以是如上所述的任一痘病毒。特别地，根据本发明的痘病毒是象Elstree或改良的安卡拉痘苗病毒这样的任一适合接种的痘苗病毒，最优选MVA-BN。
根据本发明包括一个HPH步骤的方法所获得的含痘病毒的匀浆物和/或痘病毒富集部分，HPH步骤其特征在于非常高的游离IMV痘病毒与EEV痘病毒比率。术语“游离IMV”用于指代在破碎被感染细胞前、后或过程中已经从细胞膜分离且从而可以被进一步纯化的IMV。在所有的工业方法中制备痘病毒的起始材料包括被感染细胞以及培养上清液。因此，起始材料包括被感染细胞中所含的IMV痘病毒以及主要存在于上清中的EEV痘病毒。已知的破碎细胞和随后的匀浆方法(例如使用超声波)并不能象高压匀浆一样有效地破碎细胞和/或从细胞碎片中分离IMV痘病毒。换言之，大部分IMV仍然结合于细胞膜和细胞碎片。因此，游离IMV与EEV的比率低于根据本发明的方法。在使用超声波的方法中，该比率在进一步纯化步骤过程中并不发生显著变化，因为通常IMV所依旧结合的细胞碎片被去除了。与已知回收痘病毒的方法相反，根据本发明的回收方法可非常有效地破碎被感染细胞而且IMV可非常有效地从细胞膜分离。因此，可用于进一步纯化的总游离IMV量高于现有技术中的已知方法，且因此游离IMV与EEV的比率也更高。
根据本发明的方法获得含痘病毒的匀浆物和/或痘病毒富集部分可用作疫苗。
若含痘病毒的匀浆物和/或痘病毒富集部分包含未改良的痘病毒或减毒痘病毒，例如痘苗病毒Elstree株或MVA，则其可用于抵御痘病毒感染的接种。例如，包含痘苗病毒，例如Elstree株或MVA尤其是MVA-BN，的含病毒匀浆物和/或病毒富集部分可用作抵御天花感染的疫苗。
若含痘病毒的匀浆物和/或痘病毒富集部分包含含有且表达一个或多个外源基因的痘病毒，则该含痘病毒的匀浆物和/或痘病毒富集部分可进一步被用于接种包括人类在内的动物以抵御由该外源基因所表达的蛋白质。
为制备疫苗，将根据本发明方法所获得的含痘病毒匀浆物和/或痘病毒富集部分转换为一种生理可接受的形式。这可以根据制备用于预防天花接种的痘病毒疫苗(如Stickl，H.et al.Dtsch.Med.Wschr.99，2386～2392所述)的实践来完成。例如，含痘病毒的匀浆物和/或痘病毒富集部分以5×108TCID50/ml的滴度于-80℃保存于约10mM Tris、140mM NaCl、pH 7.4中。为制备针剂疫苗，将保存于含有2％蛋白胨、1％人白蛋白、磷酸缓冲盐溶液(PBS)的安瓿瓶，优选玻璃安瓿瓶，中例如103～109TCID50的病毒冻干。作为选择，针剂疫苗可由将处方中的病毒逐步冷冻-干燥获得。该处方可包含其它添加剂，例如甘露醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其它适于体内给药的添加剂，例如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白(例如人血清白蛋白)。适于冻干的典型的含病毒处方包含10mM Tris缓冲液、140mM NaCI、18.9g/l葡聚糖(MW 36000～40000)、45g/l蔗糖、0.108g/l L-谷氨酸单甲盐一水化物(mono potassiumsalt monohydrate)，pH为7.4。随后将玻璃安瓿瓶密封，且可于4℃至室温之间保存数月。然而如果不需使用的话，优选将安瓿瓶低于-20℃保存。
为进行接种可将冻干或冷冻干燥的产品于0.1～0.5ml水溶液优选生理盐水或Tris缓冲液中溶解，并全身或局部给药，即经非肠道、肌内或任一其它熟练从业人员已知的给药途径。给药形式、剂量和次数可由本领域熟练技术人员以已知的方式进行优化。对于痘病毒载体最优选采用皮下或肌内给药。
该发明进一步涉及接种包括人在内的动物的方法，包括给动物包括人根据需要用根据本发明的方法获得的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分进行接种。
发明概述除其它因素，本发明包括以下内容的单独或组合自被感染细胞中回收痘病毒的方法，包括将被感染细胞进行高压匀浆以获得含痘病毒匀浆的步骤。
上述方法的特征在于，痘病毒选自正痘病毒、禽痘病毒、猪痘病毒和山羊痘病毒。
上述方法的特征在于，痘病毒选自痘苗病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、金丝雀痘病毒和家禽痘病毒。
上述方法的特征在于，痘苗病毒是改良的安卡拉痘苗病毒株(MVA)，尤其是保藏编号为ECACC V00083008的MVA-BN。
上述方法的特征在于，痘病毒是重组痘病毒。
上述方法的特征在于，通过将被感染细胞置于高压腔中、提高腔中压力并将被感染细胞经喷嘴射出完成高压匀浆。
上述方法的特征在于，腔中的压力值升至200至1000巴范围。
上述方法的特征在于，喷嘴直径范围为0.10至0.6mm。
上述方法的特征在于，将含痘病毒的匀浆物经至少一次纯化步骤以获得痘病毒富集部分。
上述方法的特征在于，该至少一次纯化步骤是超滤步骤。
上述方法的特征在于，该超滤为交叉流过滤。
上述方法的特征在于，交叉流过滤步骤中所使用的膜具有大于500kDa但等于或小于0.1μm的孔径。
上述方法的特征在于，超滤后进行至少一次柱层析步骤。
上述方法的特征在于，获得的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分为冷冻-干燥的。
经上述方法获得的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分。
用作疫苗的上述含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分。
上述含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分用于制备疫苗的用途。
根据需要接种动物包括人的方法，其特征在于向动物体施以含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分或如上所述的疫苗。
附图1将用MVA-BN感染的CEF细胞经冻融循环处理以获得病毒-细胞悬液。不经对细胞-病毒-悬液的进一步纯化如实施例2中所述测定悬液的病毒滴度(“0-值”)。根据现有技术已知的一种匀浆方法用超声波处理病毒-细胞-悬液(“超声波仪(Sonifier)”)，或如实施例1所述用根据本发明的匀浆方法处理(“HPH”)。HPH步骤中的压力为800巴，喷嘴直径为0.25mm。匀浆步骤末期在此测定表达滴度。
实施例以下实施例将进一步阐明本发明。本领域技术人员很容易理解，所提供的实施例决不能以将本发明所提供技术的应用限制与这些实施例的方式进行解释。
实施例1用高压匀浆器对痘病毒-细胞-悬液进行的匀浆用MVA-BN(ECACC V00083008)感染培养于摇瓶的鸡胚成纤维细胞(CEF)。冻融被感染细胞以获得病毒-细胞-悬液。
Constant Cell Disruption Systems(Low March，Daventry，Northants，NN114SD，United Kingdom)的Basic Z+匀浆器每次装载粗病毒-细胞-悬液50ml。为确定优化匀浆条件，检测了0.18至0.40范围的喷嘴直径和200至1000巴范围的压力。高压匀浆粗悬液一、二或三次。根据产品说明操作匀浆器。通过检测实施例2中所述滴度对该方法进行评估。
在预备试验中发现，若喷头直径大于0.4mm不会对匀浆效果产生积极影响。若喷嘴直径为0.18mm、0.25mm及0.35mm则将病毒细胞悬液于800巴压力下进行一次匀浆可获得最佳结果。在这些条件下未观察到大的滴度差异。
比较根据本发明的方法以及现有技术已知的经超声波直流法。结果概括于附图1。与超声波处理相比，根据本发明的方法产生了更高的病毒滴度以及更好的悬液匀浆性，因此其更适于下游进一步的加工处理。
实施例2改良安卡拉痘苗病毒(MVA)的滴定用基于TCID50的检测方法以10倍稀释液于96孔板中完成改良安卡拉痘苗病毒(MVA)滴定。
于检测末期用抗痘苗病毒抗体和适宜染色液将被感染细胞可视化。
将2～3日龄的原代CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞于7％RPMI中稀释至1×105细胞/ml。每份稀释液制备8个10倍稀释液。稀释后于96孔板中每孔接种100μl。随后于37℃、5％CO2下过夜培养细胞。
用无胎牛血清的以10倍步骤(适宜为10-1至10-12)制备含病毒溶液稀释液。
之后将每份100μl的病毒样品添加至含细胞板孔中。
37℃、5％CO2下温育96孔板5天以容许病毒感染和复制。
感染5天后用痘苗病毒特异抗体染色细胞。用偶联了二级抗体的辣根过氧化物酶(HRP)检测该特异抗体。MVA特异抗体是一种抗痘苗病毒抗体，兔多克隆抗体，IgG片断(Quartett，Berlin，Germany&num；9503-2057)。二级抗体是抗兔IgG抗体，偶联了山羊单克隆抗体的HRP(Promega，Mannheim，Germany，&num；W4011)。用已知技术进行进行显色反应。
将每个在显色反应中呈阳性带细胞板孔标记为阳性以计算TCID50。
根据Spearman[1]和Kaerber[2]的公式计算滴度。由于所有检测参数都是恒定的，因此使用了以下简化公式。
病毒滴度[TCID50/ml]=10[a+1,5+xa8+xb8+xc8]]]>a＝最后一栏中的稀释因子，其中所有8个孔都呈阳性Xa＝a+1栏中的阳性板孔数Xb＝a+2栏中的阳性板孔数Xc＝a+3栏中的阳性板孔数
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
微生物国际保藏证明(译文)PLMD5898A
微生物国际存活证明(译文)PLMD5898A
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
微生物国际保藏证明(译文)PLMD5898A
微生物国际存活证明(译文)PLMD5898A
分析证明产品描述 MVA-575保藏号00120707试验描述 细胞病变的病毒滴度TCID50的确定。(SOP ECACC/055)细胞接受标准/说明/规定阴性对照需要显示没有影响的信号。测试样品系列稀释到每一进行稀释的指示细胞株的4个孔中。细胞病变效果指示病毒存在。病毒滴度计算采用下述公式，其中作为展示每一稀释少于4个阳性孔的分布结果，x表示得自标准TCID50表的值，y是所有4个孔都是阳性的最高稀释度的值TCID50＝(1/y)×101+x时间19/01/01结果指示细胞株 BHK 21 CLONE 13阴性对照 没有CPE测试样品 CPE少于4个阳性孔的分布4，4，0X 0.50Y 10-5TCID50＝(1/10-5)×101+0.50＝100.65整体结果 病毒存在试验描述 通过在支原体猪血清琼脂上和在支原体马血清培养基中分离测定支原体。SOP QC/MYCO/01/02接受标准/说明所有阳性对照(M.pneumoniae&M.orale)需要通过在琼脂板上的典型的菌落形成显示支原体证据。培养基再次培养到支原体猪血清琼脂上，通过典型的菌落形成评价支原体。所有的阴性对照琼脂平板必须显示没有微生物生长。
阳性试验结果的标准是在琼脂板上的典型的菌落形成的支原体证据。阴性结果不显示此证据。
测试数21702时间 12/02/01结果 阳性对照阳性阴性对照阴性试验结果阴性整体结果通过授权 ECACC，质量负责人，时间5/3/01
分析证明产品描述 MVA-575保藏号00120707试验描述 采用Vero指示细胞系和Hoechst33258荧光检测系统测定支原体。(SOP QC/MYCO07/05)接受标准/说明 阴性对照中的Vero细胞明确可见为荧光细胞核，没有细胞质荧光。阳性对照(M.orale)必须显示支原体证据为荧光细胞核加支原体DNA的核荧光。阳性试验结果显示为支原体DNA的额外的核荧光。阴性对照不显示细胞质荧光。
测试数21702时间12/02/01结果 阳性对照 阳性阴性对照 阴性试验结果 阴性整体结果 通过试验描述 通过在胰蛋白胨大豆培养基(TSB)上和液体巯乙醇酸盐中分离细菌和真菌的检测。(SOP QC/BF/01/02)接受标准/说明 所有的阳性对照(枯草芽孢杆菌，产芽胞梭状芽胞杆菌，白色念珠菌)表现出微生物生长的证据(浑浊)，阴性对照显示没有微生物生产的证据(澄清)。
阳性试验的标准是在任一试验培养基中的混浊。对于阴性试验结果所有培养基必须是澄清的。
测试数21702时间12/02/01结果 阳性对照 阳性阴性对照 阴性试验结果 阴性整体结果 通过授权 ECACC，质量负责人，时间5/3/01
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
微生物国际保藏证明(译文)PLMD5898A
微生物国际存活证明(译文)PLMD5898A
产品描述 MVA-BN保藏号00083008试验描述 通过在支原体猪血清琼脂上和在支原体马血清培养基中分离测定支原体。SOP QC/MYCO/01/02接受标准/说明 所有阳性对照(M.pneumoniae&M.orale)需要通过在琼脂板上的典型的菌落形成显示支原体证据。培养基再次培养到支原体猪血清琼脂上，通过典型的菌落形成评价支原体。所有的阴性对照琼脂平板必须显示没有微生物生长。
阳性试验结果的标准是在琼脂板上的典型的菌落形成的支原体证据。阴性结果不显示此证据。
测试数21487时间27/11/00结果 阳性对照 阳性阴性对照 阴性试验结果 阴性整体结果 通过试验描述 采用Vero指示细胞系和Hoechst33258荧光检测系统测定支原体。(SOP QC/MYCO07/05)接受标准/说明 阴性对照中的Vero细胞明确可见为荧光细胞核，没有细胞质荧光。阳性对照(M.orale)必须显示支原体证据为荧光细胞核加支原体DNA的核荧光。阳性试验结果显示为支原体DNA的额外的核荧光。阴性对照不显示细胞质荧光。
测试数21487时间27/11/00结果 阳性对照 阳性阴性对照 阴性试验结果 阴性整体结果 通过授权 ECACC，质量负责人，时间4/12/02
试验描述 通过在胰蛋白胨大豆培养基(TSB)上和液体巯乙醇酸盐中分离细菌和真菌的检测。(SOP QC/BF/01/02)接受标准/说明 所有的阳性对照(枯草芽孢杆菌，产芽胞梭状芽胞杆菌，白色念珠菌)表现出微生物生长的证据(浑浊)，阴性对照显示没有微生物生产的证据(澄清)。
阳性试验的标准是在任一试验培养基中的混浊。对于阴性试验结果所有培养基必须是澄清的。
测试数21487时间27/11/00结果 阳性对照 阳性阴性对照 阴性试验结果 阴性整体结果 通过试验描述 细胞病变的病毒滴度TCID50的确定。(SOP ECACC/055)细胞接受标准/说明/规定阴性对照需要显示没有影响的信号。测试样品系列稀释到每一进行稀释的指示细胞株的4个孔中。细胞病变效果指示病毒存在。病毒滴度计算采用下述公式，其中作为展示每一稀释少于4个阳性孔的分布结果，x表示得自标准TCID50表的值，y是所有4个孔都是阳性的最高稀释度的值TCID50＝(1/y)×101+x时间19/01/01结果指示细胞株 BHK 21(CLONE 13)阴性对照没有CPE测试样品CPE少于4个阳性孔的分布 4，4，4，3，0X 1.25Y 10-3TCID50＝(1/10-7)×101+01.25＝105.25整体结果病毒存在授权 ECACC，质量负责人，时间4/12/0权利要求
1.一种从感染细胞中回收痘病毒的方法，包括如下步骤，将感染细胞进行高压匀浆处理以获得含痘病毒匀浆物。
2.根据权利要求1中的方法，其特征在于所述痘病毒选自由正痘病毒、禽痘病毒、猪痘病毒和山羊痘病毒构成的组。
3.根据权利要求1～2中任一项的方法，其特征在于所述痘病毒选自痘苗病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、金丝雀痘病毒和家禽痘病毒。
4.根据权利要求3中的方法，其特征在于痘苗病毒是Elstree或改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，尤其是保藏号为ECACC V00083008的MVA-BN。
5.根据权利要求1～4中任一项的方法，其特征在于痘病毒为重组痘病毒。
6.根据权利要求1～5中任一项的方法，其特征在于通过将被感染细胞置于高压腔中、提高腔中压力并将被感染细胞经喷嘴射出进行高压匀浆。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于腔中的压力值升至200至1000巴范围。
8.根据权利要求6～7中任一项的方法，其特征在于喷嘴直径范围为0.10至0.6mm。
9.根据权利要求1～8中任一项的方法，其特征在于将含痘病毒的匀浆物经至少一次纯化步骤以获得痘病毒富集部分。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于该至少一次纯化步骤是超滤步骤。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于该超滤为交叉流过滤。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于交叉流过滤步骤中所使用的膜具有大于500kDa但等于或小于0.1μm的孔径。
13.根据权利要求10～12中任一项的方法，其特征在于超滤后进行至少一次柱层析步骤。
14.根据权利要求1～13中任一项的方法，其特征在于对含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分进行冷冻干燥。
15.根据权利要求1～14任一方法获得的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分。
16.用作疫苗的如权利要求15的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分。
17.如权利要求15的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分用于制备疫苗的用途。
18.根据需要接种包括人在内的动物的方法，其特征在于向动物体施以权利要求15的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分或权利要求16的疫苗。
全文摘要
本发明涉及从感染细胞中回收痘病毒的方法，尤其是改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。根据本发明，将病毒感染细胞进行高压匀浆以获得含病毒匀浆物。对含病毒匀浆物处理至少一次纯化步骤以获得痘病毒富集部分。本发明进一步涉及根据本发明的方法获得的含病毒部分和含病毒匀浆物。
文档编号C12N7/02GK1606616SQ02825526
公开日2005年4月13日 申请日期2002年12月13日 优先权日2001年12月20日
发明者卡尔·赫勒, 贾塔·克拉默 申请人:巴法里安诺迪克有限公司