专利名称：Hiv－1亚型分离株调节/附加基因及其修饰物和衍生物的制作方法
背景技术：
本发明涉及筛选HIV-1 C亚型(分化体)分离株调节/附加基因的方法，和被选的HIV-1 C亚型分离株调节/附加基因及其修饰物和衍生物用于预防性和治疗性疫苗中以产生蛋白质和多肽而达到预防HIV感染或疾病的目的。
获得性免疫缺陷综合症(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的。全世界超过三千四百万的人口携带HIV/AIDS，且95％以上的感染者生活在发展中国家(UNAIDS，1999)。据估计，二千四百五十万感染人口居住在撒哈拉以南的非洲国家，南非现在已经成为世界上HIV-1流行病蔓延最快的地区之一。到2000年末，南非的政府妇产诊所里超过24％的孕妇呈HIV阳性(卫生部，2001)。从长远角度看，预防性疫苗被认为是控制这种流行病的唯一可行的手段。
HIV表现出显著的遗传多样性，这给疫苗的研制造成很大困难。变异的分子基础在于病毒逆转录酶，它不仅会在每一轮复制中引入错误，还会促使病毒RNA之间发生重组。根据对序列的系统发育学分析，将HIV划分为下列几种类型M(主要类型)、O(异常型)和N(非M、非O型)，其中M类型包括A-H和K亚型。近来，重组体病毒已被更为频繁地鉴别，且许多已经严重传播和形成蔓延(循环重组体形式或CRF)，例如西非的A/G亚型重组体，泰国的CRF A/E重组体(Robertson等人，2000)。
亚型C在南非地区，包括博茨瓦纳、津巴布韦、赞比亚、马拉维、莫桑比克和南非，占有主导地位。而且，在坦桑尼亚的南部地区检测到感染C亚型的人数在增加。这种亚型还主要分布于埃塞俄比亚和印度，并且正在中国变得日益重要。
研制疫苗可能遇到的另一个障碍是，HIV病毒的生物学特性随病情而发生变化。HIV需要两个受体来感染细胞，CD4和共受体，其中CCR5和CXCR4是HIV-1株使用的主要共受体。最常见的传播表型是非合胞体诱导株(NSI)，巨噬细胞嗜性病毒，该病毒利用共受体CCR5作为入口(R5病毒)。粘膜中的朗格汉斯细胞选择入口处的R5变体并将它们转移到淋巴结，在那里R5变体被复制和扩增。当感染加重时，病毒进化，在T细胞系中的复制和生长能力增强。这些合胞体诱导株(SI)T-嗜性病毒联合使用CXCR4和CCR5，或优选使用CCR5，在有些情况下也使用其他次要的共受体(Conner等人，1997；Richman和Bozzette，1994)。但是，HIV-1 C亚型病毒似乎并不常见，表现在它们不容易发生这种表型转换，因为R5病毒在患有严重的AIDS病人体内同样占主导地位(Bjorndal等人，1999；Peeters等人，1999；Tscherning等人，1998；Scarlatti等人，1997)。
HIV疫苗的目的是诱导CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)免疫反应和中和抗体反应。许多目前使用的疫苗手段主要是针对诱导CTL反应。人们认为CTL反应可能更加重要，因为它与感染后病毒复制的最初控制和发病期复制的控制有关，且与病情的发展呈负相关(Koup等人，1994；Ogg等人，1999；Schmitz等人，1999)。CTL保护人体不受感染的重要性表现在，CTL存在于高度暴露的血清阴性个体中，例如肯尼亚的某些性服务者(Rowland-Jones等人，1998)。
对基因多样性的了解与以诱导引起细胞毒素T淋巴细胞(CTL)反应为目的的疫苗设计密切相关。病毒之间存在许多共同的CTL表位(HIV分子免疫数据库，1998)。而且，研究表明，存在可交叉反应的CTL反应以B亚型为基础的疫苗接种的个体能够裂解用多种类型的分离株感染的自体目标(Ferrari等人，1997)；来自非B亚型感染个体的CTL能够裂解B亚型诱导的目标(Betts等人，1997；Durali等人，1998)。对比HIV-1序列数据库中的CTL表位发现，同一个亚型中的细胞毒素T表位比各亚型之间的细胞毒素T表位更保守，且如果攻击病毒是与疫苗株相同的亚型，发生CTL反应的机会将会更大。
HIV的调节基因对于产生免疫反应非常重要。Tat、Rev和Nef在感染循环的初期被表达，从而在感染初期为细胞毒素T淋巴细胞(CTL)提供靶子，这可能导致在病毒传播之前感染病毒的细胞被破坏(Klotman等人，1991；Addo等人，2001)。而且，具有说服力的数据表明，Tat蛋白在感染HIV的无症状的人体中产生有效的免疫反应(Calarota等人，1999；Calarota等人，2001)。近来报道，Tat蛋白是第一种从感染的短尾猿的CTL中逃逸的蛋白之一(Allen等人，2000)。这表明tat有免疫压力，且对Tat蛋白有早期反应。
用于疫苗设计的病毒株必须通过遗传型分析证实是典型的循环型菌株，而不是罕见或异常株。而且，重要的是，疫苗株还具有近来传播病毒的表型，所述病毒是NSI，其使用的共受体是CCR5。
定义在下面的说明书中，特定的术语具有以下含义“野生型”是指自然产生的病毒分离株的HIV密码子变体；“密码子优化”是指利用人类密码子变体取代HIV密码子变体而重新合成基因；“截取”是指将前十个氨基酸从Nef蛋白中截去，从而使其功能灭活但仍保持免疫原性；“改排”是指Tat蛋白的重排，从而使其功能灭活但仍保持免疫原性。
发明概述根据本发明的第一方面，提供一种分子，该分子具有(I)如图1所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.1)；(II)图1所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.1)所相应的RNA序列；(III)一种与图1所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.1)相比具有至少97％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与SEQ I.D.No.1给出的核苷酸序列同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其为(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选如图9和10任一所示的序列，图中所示的序列是Du422和Du151的共有序列(SEQ I.D.Nos.9和10)。
根据本发明的另一方面，提供一种分子，该分子具有(I)如图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)；(II)图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)所相应的RNA序列；(III)一种与图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)相比具有至少97％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其为(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选如图9和10任一所示的序列，图中所示的序列是Du422和Du151的共有序列(SEQ I.D.Nos.9和10)。
根据本发明的第三方面，提供一种分子，该分子具有(I)如图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)；(II)图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)所相应的RNA序列；(III)一种与图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)相比具有至少98％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其为(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选如图12和13(SEQ I.D.Nos.11和13)任一所示的序列。
根据本发明的第四方面，提供一种分子，该分子具有(I)如图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)；(II)图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)所相应的RNA序列；(III)一种与图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)相比具有至少96％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，其显示基本相似的免疫原性；
(IV)一种与图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其为(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选具有与图12和13(SEQ I.D.Nos.12和13)任一所示的分离株Du151的nef基因相似或相同的修饰。
根据本发明的第五方面，提供一种分子，该分子具有(I)如图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)；(II)图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)所相应的RNA序列；(III)一种与图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)相比具有至少90％或者更高的DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其为(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
根据本发明的第六方面，提供一种分子，该分子具有(I)如图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)；(II)图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)所相应的RNA序列；(III)一种与图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)相比具有至少90％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，其显示基本相似的免疫原性；(IV)一个与图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)或与该核苷酸序列相应的RNA序列同源的序列；或者(V)一种序列，其为(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
根据本发明的第七方面，提供一种多肽，该多肽具有(I)如图2所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.2)；(II)一种与图2所示的序列相比具有至少95％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其为图2所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.2)的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选如图11所示，它是Du422和Du151的共有序列(SEQI.D.No.11)。
根据本发明的第八方面，提供一种多肽，该多肽具有(I)如图4所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.4)；(II)一种与图4所示的序列相比具有至少95％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其为图4所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.4)的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选如图11所示，它是Du422和Du151的共有序列(SEQI.D.No.11)。
根据本发明的第九方面，提供一种多肽，该多肽具有(I)如图6所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.6)；(II)一种与图6所示的序列相比具有至少92％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其为图6所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.6)的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选如图14所示(SEQ I.D.No.14)。
根据本发明的第十方面，提供一种多肽，该多肽具有(I)如图8所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.8)；(II)一种与图8所示的序列相比具有至少95％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其为图8所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.8)的修饰物或衍生物。
所述修饰序列优选具有与图14(SEQ I.D.No.14)所示的分离株Du151的nef基因相似或相同的修饰。
根据本发明的第十一方面，提供一种多肽，该多肽具有(I)如图16所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.16)；(II)一种与图16所示的序列相比具有至少90％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者
(III)一种序列，其为图16所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.16)的修饰物或衍生物。
根据本发明的第十二方面，HIV-1 C亚型的tat基因的共有氨基酸序列如下MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNKCYCKHCSYHCLVCFQTKGLGISYGRKKRRQRRSAPP60SSEDHQNLISKQPLPQTRGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD101(SEQ ID NO18)根据本发明的第十三方面，HIV-1 C亚型的部分nef基因的共有氨基酸序列如下MGGKWSKSSIVGWPAVRERIRRTEPAAEGVGAASQDLDKHGALTSSNTAHNNADCAWLQA60QEEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGAFDLSFFLKEKGGLEGLIYSKKRQEILDLWVYHTQG120FFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCFKLVPVDPREVEEANEGENNCLIHPMSQHGMEDEDRE180VLKWKFDSSLARRHMARELHPEYYKDC207(SEQ ID NO19)根据本发明的第十四方面，HIV-1 C亚型的部分rev基因的共有氨基酸序列如下MAGRSGDSDEALIQAVRIIKILYQSNPYPKPEGTRQARKNRRRRWRARQRQIHSISERIL60STCLGRPAEPVPLQLPPIERLHIDCSESSGTSGTQQSQQTTEGVGSP107(SEQ ID NO20)根据本发明的第十五方面，提供了上述至少一种序列在生产用于治疗或预防HIV感染的疫苗中的应用。优选在疫苗中使用至少两种序列。
根据本发明的第十六方面，提供了一种含有至少两种上述序列的疫苗。
根据本发明的第十七方面，提供了一种疫苗，该疫苗含有至少部分的gag基因序列、逆转录酶(pol)基因序列、改排tat基因序列和截取的nef基因序列，这些基因序列结合在一起形成框内多基因，以grttnC表示(SEQI.D.No30)。
该疫苗可用于治疗或预防HIV。
图1(SEQ I.D.No 1)表示分离株Du422的测序tat基因的核酸序列(cDNA)；图2(SEQ I.D.No 2)表示分离株Du422的测序tat基因的氨基酸序列，它是从核酸序列衍生得到的；图3(SEQ I.D.No 3)表示分离株Du151的测序tat基因的核酸序列(cDNA)；图4(SEQ I.D.No 4)表示分离株Du151的测序tat基因的氨基酸序列，它是从核酸序列衍生得到的；图5(SEQ I.D.No 5)表示分离株Du151的测序nef基因的核酸序列(cDNA)；图6(SEQ I.D.No 6)表示分离株Du151的测序nef基因的氨基酸序列，它是从核酸序列衍生得到的；图7(SEQ I.D.No 7)表示分离株Du422的测序rev基因的核酸序列，它是从核酸序列衍生得到的；图8(SEQ I.D.No 8)表示分离株Du422的测序rev基因的氨基酸序列，它是从核酸序列衍生得到的；图9(SEQ I.D.No 9)表示分离株Du422和Du151的共有序列的野生型、改排和测序tat基因的核酸序列(DNA)；图10(SEQ I.D.No 10)表示分离株Du422和Du151的共有序列的密码子优化、改排和测序tat基因的核酸序列(DNA)，它用于增强表达；图11(SEQ I.D.No 11)表示分离株Du422和Du151的共有序列的改排和测序Tat蛋白的氨基酸序列；图12(SEQ I.D.No 12)表示分离株Du151的野生型、截取和测序nef基因的核酸序列(DNA)；图13(SEQ I.D.No 13)表示分离株Du151的密码子优化、截取和测序nef基因的核酸序列(DNA)，它用于增强表达；图14(SEQ I.D.No 14)表示分离株Du151的截取和测序Nef蛋白的氨基酸序列；图15(SEQ I.D.No 15)表示由分离株Du422和Du151的改排tat(SEQI.D.No 10)-截取Nef(SEQ I.D.No 11)基因组成的野生型多基因的核酸序列(DNA)；图16(SEQ I.D.No 16)表示分离株Du422和Du151的测序的改排Tat(SEQ I.D.No 10)-截取Nef(SEQ I.D.No 12)多蛋白的氨基酸序列；图17(SEQ I.D.No 17)表示由分离株Du422和Du151的改排tat-截取Nef基因组成的测序多基因的核酸序列(DNA)，该序列被修饰以反映人类密码子在表达增加中的应用；图18示意性地表示HIV-1的基因组，并且图示了由逆转录酶产生的测序重叠片断的位置，重叠片断是聚合酶链反应之后产生的，其目的是生成南非共有序列；图19表示基于各种分离株的tat基因序列的各种HIV-1 C亚型分离株的核酸序列的系统发育树，包括大量的共有序列和本发明的南非共有序列以及本发明的筛选分离株Du422和Du151；图20表示基于各种分离株的nef基因序列的各种HIV-1 C亚型分离株的核酸序列的系统发育树，包括大量的共有序列和本发明的南非共有序列以及本发明的筛选分离株Du151；图21表示基于各种分离株的rev基因序列的各种HIV-1 C亚型分离株的核酸序列的系统发育树，包括大量的共有序列和本发明的南非共有序列以及本发明的筛选分离株Du422；图22表示多种分离株的每一种的Tat蛋白序列与根据本发明制备的tat基因的南非共有序列如何不同；图23表示多种分离株的每一种的Nef蛋白序列与根据本发明制备的nef基因的南非共有序列如何不同；图24表示多种分离株的每一种的Rev蛋白序列与根据本发明制备的rev基因的南非共有序列如何不同；图25表示基于各种分离株的Tat蛋白序列的各种HIV-1 C亚型分离株的氨基酸序列的系统发育树，包括大量的共有序列和本发明的南非共有序列以及本发明的筛选分离株Du422和Du151；图26表示基于各种分离株的Nef蛋白序列的各种HIV-1 C亚型分离株的氨基酸序列的系统发育树，它包括大量的共有序列和本发明的南非共有序列以及本发明的筛选分离株Du422和Du151；图27表示基于各种分离株的Tat蛋白序列的各种HIV-1 C亚型分离株的氨基酸序列的系统发育树，它包括大量的共有序列和本发明的南非共有序列以及本发明的筛选分离株Du422和Du151；图28表示各种分离株的测序的Tat蛋白彼此之间相对于筛选的Du422和Du151Tat克隆体以及相对于Tat蛋白的南非共有序列的氨基酸序列同源性百分比，它是基于分离株的Tat蛋白的两两对比；图29表示各种分离株的测序的Nef蛋白彼此之间相对于筛选的Du151Nef克隆体以及相对于Nef蛋白的南非共有序列的氨基酸序列同源性百分比，它是基于分离株的Nef蛋白的两两对比；图30表示各种分离株的测序的Rev蛋白彼此之间相对于筛选的Du422Rev克隆体以及相对于Rev蛋白的南非共有序列的氨基酸序列同源性百分比，它是基于分离株的Rev蛋白的两两对比；图31示意性地表示改排Tat蛋白，其包括用于保持CTL表位的重叠片断；图32a表示由gag(Du422)、RT(Du151)、改排tat(SEQ I.D.No.10)和截取nef(SEQ I.D.No.13)(SEQ I.D.No.29)组成的GrttnC的核酸序列；图32b表示由gag(Du422)、RT(Du151)、改排tat和截取nef(SEQ I.D.No.16)(SEQ I.D.No.30)组成的GrttnC的氨基酸序列；图33表示pTHgrttnC的质粒图，表达GrttnC用于预防或治疗HIV感染的DNA疫苗载体；图34表示形成部分grttnC的Du422gag核苷酸序列(SEQ I.D.No.31)；图35表示形成部分grttnC的Du422Gag氨基酸序列(SEQ I.D.No.32)；图36表示形成部分grttnC的Du151逆转录酶(RT)核苷酸序列(SEQI.D.No.33)；以及图37表示形成部分grttnC的Du151逆转录酶(RT)氨基酸序列(SEQI.D.No.34)。
发明详述本发明涉及HIV-1 C亚型分离株调节和附加基因的筛选，以及这些基因及其修饰物和衍生物在制备抵抗HIV-1 C亚型的预防性和治疗性药物组合物和制剂，特别是疫苗中的应用。因此所述组合物能够用于预防性地防止感染或者治疗性地预防或改善疾病。在研制HIV疫苗时要考虑许多因素，本发明的一个方面涉及筛选合适的HIV分离株附加和调节基因的方法，所述基因可用于研制疫苗。
申请人设想，根据上述方法研制的疫苗可用于抵抗一种或多种HIV亚型和HIV-1 C亚型。
提出了一种鉴定用于研制抗HIV-1 C亚型的疫苗的合适菌株的方法。收集来自急性感染个体的病毒株。对所述分离株的tat、rev和nef区进行测序，并且比较了从这些分离株上得到的tat、rev和nef基因的氨基酸序列。通过筛选在每个位点最常出现的氨基酸，形成了一种共有序列，即南非共有序列。HIV-1 C亚型的tat、rev和nef基因中任一种的共有序列还构成了本发明的一个方面。通过将菌株与共有序列对比并利用表型手段表征，筛选适合疫苗开发的菌株。这些分离株也构成了本发明的一个方面。
为了筛选使用CCR5共受体的NSI菌株，用一群确定的性服务者来鉴定合适的菌株。通过比较菌株和已经形成的共有序列，从急性感染的个体体内鉴定合适的菌株。对来自12个急性感染的人体的病毒株的tat、rev和/或nef区进行测序并进行表型表征。将该序列与来自另一地区的、具有超过500个CD4细胞的15个无症状的人体的病毒株以及来自Gauteng的TB传染病医院的9个AIDS患者和2个患有AIDS的儿童的11个病毒株进行对比。还包括其他存放在Los Alamos数据库中的已公开的C亚型序列(http//ww.hjv-web.lanl.gov/)。
筛选了2个标记为Du422和Du151的潜在疫苗株。这样筛选是基于tat、rev和nef三个基因区的共有序列的氨基酸同源性、CCR5嗜性以及在组织培养物中生长和复制的能力。三个分离株及其修饰物和衍生物的三个基因区的核酸序列和氨基酸序列也构成了本发明的几个方面。
分离和筛选病毒株以设计疫苗使用下面的标准来筛选合适的菌株，以引入南非HIV-1疫苗中该菌株是循环型菌株的遗传性代表；
该菌株不是奇异株；该菌株在HIV-1 C亚型的tat、rev和nef基因方面尽可能地与根据本发明得到的共有氨基酸序列相似；该菌株具有一个R5表型，即与选择性传播有关的表型；以及所述疫苗能够在组织培养物中生长。
按照下述步骤筛选病毒株，用于设计疫苗。用南非夸祖鲁那塔的一群确定的性服务者来鉴定用于HIV疫苗的合适菌株。来自12个急性感染者的病毒株的tat、rev和nef区被测序、分离并采用表型手段表征。将该序列与来自南非Gauteng地区和西开普的开普敦地区的无症状AIDS感染(nef区)个体的相似收集以及其他被公开的C亚型序列进行了对比。
患者来自南非的4个地区的HIV感染者被征集在一起。获得来自夸祖鲁那塔的近期感染的性服务者的血样(n＝12)。将近期感染定义为早先血清反应阴性而在之前一年内变为血清反应阳性的人。还收集了来自开普敦的门诊诊所的患者(n＝2)、来自约翰内斯堡的产前检查诊所的妇女(n＝6)和来自约翰内斯堡外的一个金矿上的STD诊所的男性患者(n＝7)的血样。后面两组在临床上是稳定的，被划分为无症状感染。另外，为了比较nef基因，获得了来自Gauteng的AIDS患者的11个分离株、来自TB传染病医院的患者的9个分离株和来自感染AIDS的儿童的2个分离株。将血样收集在EDTA中，用于确定CD4 T细胞计数和进行病毒基因分析。对于近期感染，为测定血浆病毒量，进行了支链(bDNA)分析(Chiron)，并分离病毒。使用免疫检测法(ELISA)测定HIV-1的血清状态。得到了针对性服务者的CD4 T细胞计数和病毒载量结果，有关血清转化日的临床状态信息、CD4和共受体使用数据如表1所示。
病毒分离采用标准的共培养技术，利用有丝分裂素活化的供体外周血单核细胞(PBMC)，从PBMC中分离HIV。2×106个的患者PBMC与2×106个供体PBMC共培养于具有2mL RPMI1640、20％的FCS、抗生素和5％的IL-2(Boehringer)的12孔培养平板中。每周向培养物中补充两次含有IL-2的新鲜介质，每次使用5×105/mL的供体PBMC。使用商业化的p24抗原分析法(Coulter)每周一次地监控病毒的生长。抗原阳性培养物增大，再培养2周，得到40mL含有病毒的上清液，将其存放在-70℃待用。从商业化的性服务者体内得到的病毒的分离结果如表1所示。
病毒表型使用含病毒上清液，评估MT-2和共受体转染细胞系上的病毒分离株的生物表型。为了进行MT-2分析，使用5×104个MT-2细胞在PRMI、10％FCS和抗生素中培养500μL上清液。为了形成syncitia，每天监控培养物为期6天以上。表达CCR5或CXCR4共受体的U87.CD4细胞在含有10％FCS、抗生素、500μg/mL G418和1μg/mL的嘌呤霉素的DMEM中生长。表达少数共受体的GHOST细胞在含有10％FCS、500μg/mL G418、1μg/mL的嘌呤霉素和100μg/mL的潮霉素的DMEM中生长。通过胰蛋白酶化每周两次将细胞系传代。在12孔的培养平板上进行共受体分析；在每个孔里固定5×104个细胞，使其附着过夜。第二天加入含病毒的500μL上清液，培养过夜，使病毒附着并感染，第三天洗三次。为了形成syncitia和产生p24抗原，在第4、8和12天监控培养物。有syncitia和p24抗原产生浓度增长迹象的培养物被认为对于病毒生长是有利的。来自商业化的性服务者的病毒的共受体处理结果如表1所示。
表1用于筛选候选疫苗的急性感染人群
*来自98年11月的数据测序从血浆分离RNA，用逆转录酶从RNA扩增基因片断，接着通过聚合酶链反应(PCR)生成扩增的DNA片断。PCR引物的位置如下，(用HIV-1HXBr序列编码)tat向外向前引物(5’GGC CGC AGA GGG AAC CATAC3’(SEQ ID NO21)5584-5703bp)，或者rev向外逆引物(5’GCC CTG TCTTAT TCT TCT AGG3’(SEQ ID NO22)8753-8774bp)。余下的用于巢式PCR的引物是tat向外逆引物(5’CCT CAA TAT CCC CAT CAC TCT C3’(SEQ IDNO23)6226-6248bp)、tat向内向前引物(5’TGC CAG CAT AGC AGA ATAGG3’(SEQ ID NO24)5785-5804bp)和tat向内逆引物(5’CTA TCA ATG CTCCTA CTC CTA ATC3’(SEQ ID NO25)6078-6101bp)，以及rev向外向前引物(5’GAT AGT AGG AGG CTT GAT AGG3’(SEQ ID NO26)8285-8302bp)、rev向内向前引物(5’GGT GTA CTC GCT ATA GTG3’(SEQ IDNO27)8321-8339bp)和rev向内逆引物(5’CCT TCA GCT ACT GCT ATTGC3’(SEQ ID NO28)8689-8698bp)。
用QIAQUICK PCR纯化设备(Qiagen，德国)对扩增的DNA片断进行纯化。然后，使用上游PCR引物作为测序引物对DNA片断测序。采用Sanger双脱氧终止剂法，用附着在双脱氧核苷酸的荧光染料进行测序。通过电泳，用ABI377测序仪测定序列。表示进行上述测序的tat、rev和nef基因的HIV-1前病毒基因组的示意图见图18。
遗传型特征为了筛选疫苗分离株，对包括tat(101个密码子，306个碱基)、rev(107个相邻密码子，324个碱基)和nef(207个密码子，618个碱基)的三个HIV基因进行了测试(图18)。图18表示5’长终端重覆区域，结构和功能基因(gag、pol和env)以及调节和附加蛋白(vif、tat、rev、nef、vpr和vpu)。gag开放式阅读框表示编码p17基质蛋白、p24核蛋白以及p7和p6核衣壳蛋白的区域。pol开放式阅读框表示蛋白酶(PR)p15、逆转录酶(RT)p66和核糖核酸酶H整合酶p51。env开放式阅读框表示编码gp120和gp41的区域。
在所有的38个分离株中，有12个来自德班群(DU)、24个来自约翰内斯堡(GG、RB、COT和SW)、2个来自开普敦(CT)。其中有17个的tat基因被测序，有17个的rev基因被测序，有32个的nef基因被测序。被测序的分离株如表2所示。
表2分离株和被测序的基因区域列表
将来自德班(Du)、约翰内斯堡(GG、RB、SW和COT)和开普敦(CT)的核酸序列与大量可得的已公开的C亚型序列(来自Los Alamos HIV序列数据库)进行系统发育学对比，后者包括来自其他南非国家的序列和来自Los Alamos HIV序列数据库的所有C亚型共有序列。对比的目的是保证被选的疫苗分离株与南非序列相比，不是系统发育学上的异常株，对比结果如图19、图20和图21所示。图19-21表示南非序列是不同的，印度序列通常会形成与非洲序列不同的分离簇。南非序列并非独一无二的，一般来说，它们相互之间是有联系的，就像它们与来自南非的其他序列有关一样。这表明印度序列与南非C亚型序列不同，在南非没有无性传染病，但是南非病毒反映出南非地区的C亚型病毒具有多样性。
共有序列的测定氨基酸序列来自如表2所示的序列，这些序列被用来测定南非共有序列。选择在每个位置出现最频繁的氨基酸作为该位置处的共有氨基酸。这样，沿着每个被测序基因(tat、rev和nef基因)的线性长度测定共有序列。使用DNAMAN程序(DNAMAN2输出)进行排列，产生共有序列。这样会在每个基因区域产生共有序列。氨基酸序列和产生的共有序列的排列如图22、23和24所示。氨基酸相似性如图25-27所示。
最终选用哪个分离株是根据一个特定分离株的tat、rev和nef基因序列与上面得到的南非共有序列的相似性，以及表1所示的具有好的复制动力学的R5分离株的可获得性来确定的。
疫苗分离株的筛选基于上述考虑和方法，从急性感染的人群筛选两个菌株作为疫苗株。第一个菌株是用于tat和nef基因的Du151，第二个菌株是用于tat和rev基因的Du422。筛选这三个菌株的原因如下1.当获得样品时，Du151已被感染长达6周，CD4计数达到367个细胞每μL血液，病毒载量大于500000个拷贝每mL血浆。考虑到高的病毒载量和从感染开始的记录时间，患者可能还处于免疫系统控制HIV复制之前的病毒血症初期。
2.当获得样品时，Du422已被感染长达4个月，CD4计数达到397个细胞每μL血浆，病毒载量达到17118个拷贝每mL血浆。与Du151相比，该患者体内的病毒复制已经得到了一定程度的控制。
这两个分离株能够在细胞培养物中生长，而且对它们的整个基因组进行了序列分析。
根据图28所示的Du151和Du422Tat蛋白序列以及其他分离株的氨基酸两两对比分析，所示的Du151和Du422tat序列与图19和22所示的南非共有序列非常相似。它们与共有序列具有89.4％(Du151)和91.6％(Du422)的氨基酸序列一致性。因此Du151和Du422用于生成野生型(非密码子优化)或人化(密码子优化)的、再合成的改排Tat。它们是在与南非共有序列略微相关的病毒株中筛选出来的，原因是它们能够在组织培养物中生长，两分离株的整个基因组都已被测序和表征。
Nef基因表现出最大的序列不同性。根据如图29所示的与SA共有序列的Nef氨基酸两两同一的分数(93.4％)的分析结果，选用Du151分离株作为nef基因源。当与其他近期血清转换体相比时，与任一种Du151分离株序列的所有两两同一分数都在80.2％以上，如图29所示。该结果中的其他贡献性因素是，这是为env和pol基因源筛选的相同分离株，且其在生物体内具有优异的生长性能。
Rev基因是三个之中最保守的。根据与SA共有序列的氨基酸两两同一分数(95.2％)，筛选Du422 rev基因。另外，当与其他近期血清转换体相比时，与Du422分离株序列的所有两两同一的分数都在83％以上，如图29所示。这些两两分数使得Du422与该序列库中的最佳分数相似，该两两分数将与R5病毒的相似水平与好的细胞培养物复制动力学结合起来。
基因的再合成多蛋白基因Tat-nef是通过合成寡核苷酸片断制备的，GeneArt(geneart股份有限公司，雷根斯堡(Regensburg))将所述寡核苷酸片断连接起来组成整个基因。合成了密码子优化和非密码子优化的基因，并将其克隆到pPCR-Script(Stratagene)载体。通过将插入物的两股测序，并将其与原始序列对比，从而鉴定插入物。Du422/Du151和单独的Du151的tat和nef基因序列以及Tat-nef多蛋白基因序列的修饰物如SEQ I.D.Nos.9-17所示。
将Tat蛋白分成三个重叠片断并改排(如图31所示)，使蛋白失活从而更加安全，但不会失去潜在的CTL表位。Nef蛋白被截去10个氨基酸，去掉了允许Nef蛋白离开细胞的N终端十四烷基化部位(SEQ I.D.No.12)。除了使蛋白更安全外，还希望当蛋白陷落到细胞中时会产生更有效的CTL反应。
疫苗的研制本发明的疫苗可以使用多种不同的载体用多种不同的方法制备。所述疫苗包括来自多种不同载体的病毒的胶囊式RNA或转录的DNA序列。这些疫苗可以含有至少部分的来自Du422分离株的tat和rev基因以及至少部分的来自本发明的Du151分离株或其衍生物或修饰物的tat和nef基因。
用于DNA疫苗中的基因被再合成以反映人密码子的用途。Tat Du422基因被分为三个具有重叠端的片断，使得没有潜在的CTL表位被丢失和重新改排以提高Tat蛋白的安全性。鉴于安全原因，Du151nef基因的前10个氨基酸被截去，以除去十四烷基化部位。将改排tat和截短的nef合成在同一个阅读框中，以构成Tat-Nef多蛋白。合成人型和非人型Tat-nef多蛋白用于其他替代性疫苗。相似的密码子优化的rev基因可以由DNA疫苗表达。
其他疫苗含有从来自Du422和Du151分离株的tat基因的RNA转录的DNA、从来自Du151分离株的nef基因的RNA转录的DNA和从来自Du422分离株的rev基因的RNA转录的DNA。这些基因也可以被表达为寡聚包膜糖蛋白复合物(Progenics，USA)，其公开见J Virol 2000 Jan；74(2)627-43(Binley，J.L.等人)，或在腺相关病毒(AAV)(Target Genetics)、委内瑞拉马脑炎病毒(美国专利申请USSN 60/216,995，引为本文参考)、变性牛痘病毒安卡拉(MVA)(Amara等人，2002)、BCG以及其他正在开普敦大学研发的疫苗中表达。
含有框内多基因、GrttnC(图32a和32b；SEQ I.D.Nos.29和30)和重组tat-截取nef(SEQ I.D.No.17)的疫苗构造已被研制，并将被引入多个候选疫苗中，包括DNA疫苗、用pTH DNA疫苗载体(Hanke等人，2000)的pTHgrttnC(图33)，以及MVA疫苗(Amara等人，2002)，所述GrttnC包括密码子优化的Du422gag(图34和35；SEQ I.D.Nos.31和32)和Du151RT(逆转录酶)(图36和37；SEQ I.D.Nos.33和34)(WO 02/04494，其内容引为本文参考)。从Du422和Du151分离出来的gag和pol基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ I.D.Nos.35-38所示。
本发明并不仅限于所描述的具体实施方式
。
保藏下述材料已经保藏在欧洲细胞培养物中心(ECACC)，它是应用微生物学与研究中心，位于英国威尔特郡SP4OJG索尔兹伯里。
材料ECACC保藏号保藏日HIV-1病毒分离株Du151保藏号000727242000年7月27日HIV-1病毒分离株Du422临时保藏号000727262000年7月27日临时保藏号010321142001年3月22日保藏是根据用于专利程序微生物保藏的国际公约布达佩斯条约的有关规定及其细则而做出的。
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序列表PA134027-mrcuct2.ST25SEQUENCE LISTING<110> South African Medical Research Council and University of Cape Town<120> HIV-1 Subtype Isolate Regulatory/Accessory Genes，and Modifications andDerivatives Thereof<130> PA134027/PCT<140> ZA 2001/8978<141> 2001-10-31<160> 38<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 306<212> PRT<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 1Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala Ala Thr Ala Gly Ala Thr Cys1 5 10 15Cys Thr Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly20 25 30Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Thr35 40 45Cys Ala Gly Cys Cys Thr Ala Ala Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Thr50 55 60Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly65 70 75 80Thr Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Gly Cys Thr Ala Cys85 90 95Cys Ala Thr Thr Gly Thr Cys Thr Ala Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr100 105 110Thr Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr115 120 125
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PA134027-mrcuct2.ST2550 55 60His Gln Asn Pro Ile Ser Lys Gln Pro Leu Ser Gln Thr Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Ser Glu Glu Ser Lys Lys Lys Val Glu Ser Lys Thr Lys85 90 95Thr Asp Pro Phe Asp100<210> 3<211> 306<212> DNA<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 3atggagccaa tagatcctaa cctagagccc tggaaccatc caggaagtca acctaacact60ccttgtacta aatgctattg taaatactgc agctatcatt gtctagtttg ctttcagaca 120aaaggcttag gcatttccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag cactcctcca 180agcagtgagg atcatcaaaa tcttatatca gagcagccct taccccaagc ccgaggggtc 240ccgacaggct cggaagaatc gaagaagaag gtggagagca agacaaaaac agatccattc 300gattag 306<210> 4<211> 101<212> PRT<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 4Met Glu Pro Ile Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Asn Thr Pro Cys Thr Lys Cys Tyr Cys Lys Tyr Cys Ser Tyr20 25 30His Cys Leu Val Cys Phe Gln Thr Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Ser Thr Pro Pro Ser Ser Glu Asp50 55 60His Gln Asn Leu Ile Ser Glu Gln Pro Leu Pro Gln Ala Arg Gly Val65 70 75 80Pro Thr Gly Ser Glu Glu Ser Lys Lys Lys Val Glu Ser Lys Thr Lys85 90 95
PA134027-mrcuct2.ST25Thr Asp Pro Phe Asp100<210> 5<211> 618<212> DNA<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 5atggggggca agtggtcaaa aagcagcata gtgggatggc ctgctgtaag agaaagaata60agaagaactg agccagcagc agagggagta ggaccagcat ctcaagactt agataaacat 120ggagcgctta caagcagcaa cacagcccac aataatcctg actgtgcctg gctacaagca 180caagaggagg aagaagacgt aggttttcca gtcagacctc aggtgcctct aagaccaatg 240acttataagg cagcattcga tctcagcttc tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg 300ttaattcact ctaagagaag acaagacatt cttgatttgt gggtctatca cacacaaggc 360tacttccctg attggcaaaa ctacacgccg ggaccaggag tcagataccc actgaccttt 420ggatggtgct tcaagctagt gccagttgat ccaagggaag tagaagaggc caacaaagga 480gaaaacaact gtttgctaca ccctatgagc cagcatggaa tggaggatgc agacagagaa 540gtattaagat gggtgtttga cagcagtcta gcacgcagac acctggcccg cgagaaacat 600ccggagtatt acaaagac 618<210> 6<211> 207<212> PRT<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 6Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Ile Val Gly Trp Pro Ala Val1 5 10 15Arg Glu Arg Ile Arg Arg Thr Glu Pro Ala Ala Glu Gly Val Gly Ala20 25 30Ala Ser Gln Asp Leu Asp Lys His Gly Ala Leu Thr Ser Ser Asn Thr35 40 45Ala His Asn Asn Pro Asp Cys Ala Trp Leu Gln Ala Gln Glu Glu Glu50 55 60Pro Glu Val Gly Phe Pro Val Arg Pro Gln Val Pro Leu Arg Pro Met65 70 75 80Thr Tyr Lys Ala Ala Phe Asp Leu Ser Phe Phe Leu Lys Glu Lys Gly85 90 95Gly Leu Glu Gly Leu Ile Tyr Ser Lys Lys Arg Gln Asp Ile Leu Asp
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PA134027-mrcuct2.ST25Gln Arg Gln Ile His Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Ser Thr Cys Leu50 55 60Gly Arg Ser Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Ile Glu Arg65 70 75 80Leu His Ile Asp Cys Ser Glu Ser Ser Gly Thr Ser Gly Thr Gln Gln85 90 95Ser Gln Gly Thr Ala Glu Arg Val Gly Ser Pro100 105<210> 9<211> 392<212> DNA<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 9ggatccgcgg ccgcaagctt gccaccatgg taggcatttc ccatggcagg aagaagcgga60gacagcgacg aagcactcct ccaagcagtg aggatcatca aaatcctata tcaaagcagc 120ccttacccca aacccgaggg gacccgacag gctcggaaga atcgaagaag aaggtggaga 180gcaagacaaa aacagatcca ttcgattgta aatactgcag ctatcattgt ctagtttgct 240ttcagacaaa aggcttaggt attagctatg gaaggaagaa acggatggag ccaatagatc 300ctaacctaga gccctggaac catccaggaa gtcaacctaa cactccttgt aataaatgct 360attgtaagta ctgttcatat cattgcctag tt 392<210> 10<211> 392<212> DNA<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 10ggatccgcgg ccgcaagctt gccaccatgg tgggcatcag ctacggccgc aagaagcgcc60gccagcgccg cagcaccccg cccagcagcg aggaccacca gaaccccatc agcaagcagc 120ccctgcccca gacccgcggc gaccccaccg gcagcgagga gagcaagaag aaggtggaga 180gcaagaccaa gaccgacccc ttcgactgca agtactgcag ctaccactgt ctggtgtgct 240tccagaccaa gggcctgggc atctcctacg ggcgcaagaa acggatggag cccatcgacc 300ccaacctgga gccctggaac caccccggca gccagcccaa caccccctgc aacaagtgct 360actgcaaata ctgctcctac cactgcctcg tg 392<210> 11<211> 122<212> PRT<213> Human immunodeficiency virus type 1
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PA134027-mrcuct2.ST25<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 30Lys Leu Ala Thr Met Ala Ala Arg Ala Ser Ile Leu Arg Gly Glu Lys1 5 10 15Leu Asp Lys Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys His20 25 30Tyr Met Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe35 40 45Ala Leu Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile50 55 60Met Lys Gln Leu Gln Pro Ala Leu Gln Thr Gly Thr Glu Glu Leu Lys65 70 75 80Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys Ile85 90 95Glu Val Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln100 105 110Asn Lys Cys Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gly Lys115 120 125Val Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val130 135 140His Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile145 150 155 160Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Thr Ala Leu165 170 175Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val180 185 190Gly Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu195 200 205Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile210 215 220Ala Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr225 230 235 240Thr Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Ala Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro245 250 255Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn260 265 270
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PA134027-mrcuct2.ST25<210> 36<211> 492<212> PRT<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 36Met Gly Ala Arg Ala Ser Ile Leu Arg Gly Glu Lys Leu Asp Lys Trp1 5 10 15Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys His Tyn Met Leu Lys20 25 30His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro35 40 45Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Met Lys Gln Leu50 55 60Gln Pro Ala Leu Gln Thr Gly Thr Glu Glu Leu Lys Ser Leu Tyr Asn65 70 75 80Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys Ile Glu Val Arg Asp85 90 95Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Cys Gln100 105 110Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gly Lys Val Ser Gln Asn115 120 125Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile130 135 140Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala145 150 155 160Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Thr Ala Leu Ser Glu Gly Ala165 170 175Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln180 185 190Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu195 200 205Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln210 215 220Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu225 230 235 240Gln Glu Gln Ile Ala Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly245 250 255
PA134027-mrcuct2.ST25Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg260 265 270Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu275 280 285Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu290 295 300Gln Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Asp Thr Leu Leu Val305 310 315 320Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Arg Ala Leu Gly Pro325 330 335Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly340 345 350Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Ala Asn355 360 365Ser Gly Asn Ile Met Met Gln Arg Ser Asn Phe Lys Gly Pro Arg Arg370 375 380Ile Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Arg Asn385 390 395 400Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly405 410 415His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys420 425 430Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Asn Arg435 440 445Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ser Phe Arg Phe Glu Glu Thr450 455 460Thr Pro Ala Pro Lys Gln Glu Pro Ile Glu Arg Glu Pro Leu Thr Ser465 470 475 480Leu Lys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Leu Ser Gln485 490<210> 37<211> 2997<212> DNA<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 37tttagggaaa atttggcctt cccacaaggg gaggccaggg aatttccttc agaacagacc60
PA134027-mrcuct2.ST25agagccaaca gccccaccag cagagagctt caggttcgaa gaaacaaccc ccgctccgaa 120acaggagccg agagaaaggg aacccttaac ttccctcaaa tcactctttg gcagcgaccc 180cttgtctcaa taaaaatagg gggccagaca agggaggctc tcttagacac aggagcagat 240gatacagtat tagaagacat aaatttgcca ggaaaatgga aaccaaaaat gataggagga 300attggaggtt ttatcaaagt aagacagtat gatcaaatac ttatagaaat ttgtggaaaa 360aaggctatag gtacagtatt agtagggcct acacctgtca acataattgg cagaaacatg 420ttgactcagc ttggatgcac actaaacttt ccaatcagtc ccattgaaac tgtaccagta 480aaactgaagc caggaatgga tggcccaaag gttaaacaat ggccgttaac agaagagaaa 540ataaaagcat taacagcaat ttgtgaagaa atggaaaagg aaggaaaaat tacaaaaatt 600gggcctgaaa atccatataa cactccaata tttgccataa aaaagaaaga cagcactaag 660tggagaaaat tagtagattt cagggaactc aataaaagaa ctcaagactt ttgggaggtt 720caattaggaa taccacaccc agcagggtta aaaaagaaaa aatcagtgac agtactggat 780gtgggagatg catatttttc agttccttta gatgaaggct tcaggaaata tactgcattc 840accataccta gtataaacaa tgaaacacca gggattagat atcaatataa tgtgcttcca 900caaggatgga aagggtcacc agcaatattc cagggtagca tgacaaaaat cttagagccc 960tttagagctc aaaatccaga aatagtcatc tatcaatata tggatgactt gtatgtagga1020tctgacttag aaatagggca acatagagca aaaatagaag agttaagaga acatctatta1080aagtggggat ttaccacacc agacaaaaaa catcagaaag aacccccatt tctttggatg1140gggtatgaac tccatcctga caaatggaca gtacagccta tacagctgcc agaaaaggat1200agctggactg tcaatgatat acagaagtta gtgggaaaat taaactgggc aagtcagatt1260tacccaggga ttaaagtaag gcaactttgt aagctcctta gggggaccaa agcactaaca1320gacatagtac cactaactga agaagcagaa ttagaattgg cagagaacag ggaaattcta1380aaagaaccag tgcatggagt atattatgac ccatcaaaag acttgatagc tgaaatacag1440aaacaggggg atgaccaatg gacatatcaa atttaccaag aaccattcaa aaacctgaag1500acaggaaagt atgcaaaaag gaggactacc cacactaatg atgtaaaaca gttaacagag1560gcagtgcaaa aaatatcctt ggaaagcata gtaatatggg gaaagactcc taaatttaga1620ctacccatcc aaaaagaaac atgggaaata tggtggacag actattggca agccacatgg1680attcctgagt gggagtttgt taatacccct cccctagtaa aactatggta ccagctagaa1740aaagaaccca tagcaggagc agaaactttc tatgtagatg gagcagctaa tagggaaact1800aaaataggaa aagcggggta tgttactgac agaggaaggc agaaaattgt aactctaagt1860gaaacaacaa atcagaagac tgaattacaa gcaattcagc tagctttgca agattcagaa1920tcagaagtaa acataataac agactcacag tacgcattag gaatcattca agcacaacca1980gataggagtg aatcagagtt ggtcaatcaa ataatagaac aattaataaa aaaggaaagg2040gtctatctgt catgggtacc agcacacaac ggacttgcag gaaatgaaca tgtagataaa2100ttagtaagta ggggaatcag gaaagtgctg gttctagatg gaatagataa ggctcatgaa2160gagcatgaaa agtatcacag caattggaga gcaatggcta gtgagtttaa tctgccaccc2220gtagtagcaa gagaaatagt agccagctgt gataaatgtc agctaaaagg ggaagccata2280catggacaag tagattgtag tccggggata tggcaattag attgtacaca tttagaagga2340
PA134027-mrcuct2.ST25aaaatcatcc tggtagcagt ccatgtagcc agtggctaca tagaagcaga ggttatccca 2400gcagaaacag gacaagaaac agcatactat atactaaaat tagcaggaag atggccagtc 2460aaagtaatac atacagacaa tggcagtaat ttcaccagtg ctgcagttaa ggcagcctgt 2520tggtgggcag gtatccaaca ggaatttggg attccctaca atccccaaag tcagggagta 2580gtagaatcca tgaataaaga attaaagaaa atcatagggc aggtaagaga tcaagctgag 2640caccttaaga cagcagtaca aatggcagta ttcattcaca attttaaaag aaaagggggg 2700attggggggt acagtgcagg ggaaagaata atagacataa tagcaacaga catacaaact 2760aaagaattac aaaaacaaat tataaaaatt caaaattttc gggtttatta cagagacagc 2820agagatccta tttggaaagg accagccaag ctactctgga aaggtgaagg ggcagtagta 2880atacaagaca acagtgacat aaaggtagta ccaaggagga aagtaaaaat cattagggac 2940tatggaaaac agatggcagg tgctgattgt gtggcaggta gacaggatga agattag 2997<210> 38<211> 998<212> PRT<213> Human immunodeficiency virus type 1<400> 38Phe Arg Glu Asn Leu Ala Phe Pro Gln Gly Glu Ala Arg Glu Phe Pro1 5 10 15Ser Glu Gln Thr Arg Ala Asn Ser Pro Thr Ser Arg Glu Leu Gln Val20 25 30Arg Arg Asn Asn Pro Arg Ser Glu Thr Gly Ala Glu Arg Lys Gly Thr35 40 45Leu Asn Phe Pro Gln Ile Thr Leu Trp Gln Arg Pro Leu Val Ser Ile50 55 60Lys Ile Gly Gly Gln Thr Arg Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp65 70 75 80Asp Thr Val Leu Glu Asp Ile Asn Leu Pro Gly Lys Trp Lys Pro Lys85 90 95Met Ile Gly Gly Ile Gly Gly Phe Ile Lys Val Arg Gln Tyr Asp Gln100 105 110Ile Leu Ile Glu Ile Cys Gly Lys Lys Ala Ile Gly Thr Val Leu Val115 120 125Gly Pro Thr Pro Val Asn Ile Ile Gly Arg Asn Met Leu Thr Gln Leu130 135 140Gly Cys Thr Leu Asn Phe Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro Val145 150 155 160
PA134027-mrcuct2.ST25Lys Leu Lys Pro Gly Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu165 170 175Thr Glu Glu Lys Ile Lys Ala Leu Thr Ala Ile Cys Glu Glu Mer Glu180 185 190Lys Glu Gly Lys Ile Thr Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr195 200 205Pro Ile Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu210 215 220Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val225 230 235 240Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val245 250 255Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Glu260 265 270Gly Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Asn Asn Glu275 280 285Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys290 295 300Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Gly Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro305 310 315 320Phe Arg Ala Gln Asn Pro Glu Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Mer Asp Asp325 330 335Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Ala Lys Ile340 345 350Glu Glu Leu Arg Glu His Leu Leu Lys Trp Gly Phe Thr Thr Pro Asp355 360 365Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu370 375 380His Pro Asp Lys Trp Thr Val Gln Pro Ile Gln Leu Pro Glu Lys Asp385 390 395 400Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp405 410 415Ala Ser Gln Ile Tyr Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu420 425 430Leu Arg Gly Thr Lys Ala Leu Thr Asp Ile Val Pro Leu Thr Glu Glu435 440 445Ala Glu Leu Glu Leu Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro Val450 455 460
PA134027-mrcuct2.ST25His Gly Val Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln465 470 475 480Lys Gln Gly Asp Asp Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Glu Pro Phe485 490 495Lys Asn Leu Lys Thr Gly Lys Tyr Ala Lys Arg Arg Thr Thr His Thr500 505 510Asn Asp Val Lys Gln Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile Ser Leu Glu515 520 525Ser Ile Val Ile Trp Gly Lys Thr Pro Lys Phe Arg Leu Pro Ile Gln530 535 540Lys Glu Thr Trp Glu Ile Trp Trp Thr Asp Tyr Trp Gln Ala Thr Trp545 550 555 560Ile Pro Glu Trp Glu Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp565 570 575Tyr Gln Leu Glu Lys Glu Pro Ile Ala Gly Ala Glu Thr Phe Tyr Val580 585 590Asp Gly Ala Ala Asn Arg Glu Thr Lys Ile Gly Lys Ala Gly Tyr Val595 600 605Thr Asp Arg Gly Arg Gln Lys Ile Val Thr Leu Ser Glu Thr Thr Asn610 615 620Gln Lys Thr Glu Leu Gln Ala Ile Gln Leu Ala Leu Gln Asp Ser Glu625 630 635 640Ser Glu Val Asn Ile Ile Thr Asp Ser Gln Tyr Ala Leu Gly Ile Ile645 650 655Gln Ala Gln Pro Asp Arg Ser Glu Ser Glu Leu Val Asn Gln Ile Ile660 665 670Glu Gln Leu Ile Lys Lys Glu Arg Val Tyr Leu Ser Trp Val Pro Ala675 680 685His Asn Gly Leu Ala Gly Asn Glu His Val Asp Lys Leu Val Ser Arg690 695 700Gly Ile Arg Lys Val Leu Val Leu Asp Gly Ile Asp Lys Ala His Glu705 710 715 720Glu His Glu Lys Tyr His Ser Asn Trp Arg Ala Met Ala Ser Glu Phe725 730 735Asn Leu Pro Pro Val Val Ala Arg Glu Ile Val Ala Ser Cys Asp Lys740 745 750Cys Gln Leu Lys Gly Glu Ala Ile His Gly Gln Val Asp Cys Ser ProPage 32
PA134027-mrcuct2.ST25755 760 765Gly Ile Trp Gln Leu Asp Cys Thr His Leu Glu Gly Lys Ile Ile Leu770 775 780Val Ala Val His Val Ala Ser Gly Tyr Ile Glu Ala Glu Val Ile Pro785 790 795 800Ala Glu Thr Gly Gln Glu Thr Ala Tyr Tyr Ile Leu Lys Leu Ala Gly805 810 815Arg Trp Pro Val Lys Val Ile His Thr Asp Asn Gly Ser Asn Phe Thr820 825 830Ser Ala Ala Val Lys Ala Ala Cys Trp Trp Ala Gly Ile Gln Gln Glu835 840 845Phe Gly Ile Pro Tyr Asr Pro Gln Ser Gln Gly Val Val Glu Ser Met850 855 860Asn Lys Glu Leu Lys Lys Ile Ile Gly Gln Val Arg Asp Gln Ala Glu865 870 875 880His Leu Lys Thr Ala Val Gln Met Ala Val Phe Ile His Asn Phe Lys885 890 895Arg Lys Gly Gly Ile Gly Gly Tyr Ser Ala Gly Glu Arg Ile Ile Asp900 905 910Ile Ile Ala Thr Asp Ile Gln Thr Lys Glu Leu Gln Lys Gln Ile Ile915 920 925Lys Ile Gln Asn Phe Arg Val Tyr Tyr Arg Asp Ser Arg Asp Pro Ile930 935 940Trp Lys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val Val945 950 955 960Ile Gln Asp Asn Ser Asp Ile Lys Val Val Pro Arg Arg Lys Val Lys965 970 975Ile Ile Arg Asp Tyr Gly Lys Gln Met Ala Gly Ala Asp Cys Val Ala980 985 990Gly Arg Gln Asp Glu Asp99权利要求
1.一种分子，该分子包含(I)如图1所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.1)；(II)图1所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.1)所相应的RNA序列；(III)一种与图1所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.1)相比至少具有97％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，且其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与SEQ I.D.No.1给出的核苷酸序列同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其是(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
2.如权利要求1的分子，其中修饰序列是图9和10任一所示的序列(SEQI.D.Nos.9和10)。
3.一种分子，该分子包含(I)如图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)；(II)图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)所相应的RNA序列；(III)一种与图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)相比至少具有97％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，且其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图3所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.3)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其是(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
4.如权利要求3的分子，其中修饰序列是图9和10任一所示的序列(SEQI.D.Nos.9和10)。
5.一种分子，该分子包含(I)如图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)；(II)图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)所相应的RNA序列；(III)一种与图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)相比至少具有98％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，且其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图5所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.5)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其是(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
6.如权利要求5的分子，其中修饰序列是图12和13任一所示的序列(SEQI.D.Nos.11和13)。
7.一种分子，该分子包含(I)如图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)；(II)图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)所相应的RNA序列；(III)一种与图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)相比至少具有96％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，且其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图7所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.7)同源的序列、或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其是(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
8.如权利要求7的分子，其中修饰序列是图12和13任一所示的序列(SEQI.D.Nos.12和13)。
9.一种分子，该分子包含(I)如图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)；(II)图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)所相应的RNA序列；(III)一种与图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)相比至少具有90％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，且其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图15所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.15)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其是(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
10.一种分子，该分子包含(I)如图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)；(II)图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)所相应的RNA序列；(III)一种与图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)相比至少具有90％DNA相似性的序列、或该序列所相应的RNA序列，且其显示基本相似的免疫原性；(IV)一种与图17所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.17)同源的序列，或该序列所相应的RNA序列；或者(V)一种序列，其是(I)-(IV)中任一序列的修饰物或衍生物。
11.一种多肽，该多肽包含(I)如图2所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.2)；(II)一种与图2的序列相比具有至少95％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其是图2所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.2)的修饰物或衍生物。
12.如权利要求11的多肽，其中修饰序列是图11所示的序列(SEQ I.D.No.11)。
13.一种多肽，该多肽包含(I)如图4所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.4)；(II)一种与图4的序列相比具有至少95％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其是图4所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.4)的修饰物或衍生物。
14.如权利要求13的多肽，其中修饰序列是图11所示的序列(SEQ I.D.No11)。
15.一种多肽，该多肽包含(I)如图6所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.6)；(II)一种与图6的序列相比具有至少92％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其是图6所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.6)的修饰物或衍生物。
16.如权利要求15的多肽，其中修饰序列是图14所示的序列(SEQ I.D.No.14)。
17.一种多肽，该多肽包含(I)如图8所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.8)；(II)一种与图8的序列相比具有至少95％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其是图8所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.8)的修饰物或衍生物。
18.如权利要求17的多肽，其中修饰序列是图14所示的序列(SEQ I.D.No.14)。
19.一种多肽，该多肽包含(I)如图16所示的核苷酸序列(SEQ I.D.No.16)；(II)一种与图16的序列相比具有至少90％相似性的序列，且其具有基本相似的免疫原性；或者(III)一种序列，其是图16所示的氨基酸序列(SEQ I.D.No.16)的修饰物或衍生物。
20.HIV-1C亚型的tat基因的共有氨基酸序列如下MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNKCYCKHCSYHCLVCFQTKGLGISYGRKKRRQRRSAPP60SSEDHQNLISKQPLPQTRGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD101(SEQ ID NO18)
21.HIV-1C亚型的部分nef基因的共有氨基酸序列如下MGGKWSKSSIVGWPAVRERIRRTEPAAEGVGAASQDLDKHGALTSSNTAHNNADCAWLQA60QEEEEEVGFPVRPQVPLRPMTYKGAFDLSFFLKEKGGLEGLIYSKKRQEILDLWVYHTQG120FFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWCFKLVPVDPREVEEANEGENNCLIHPMSQHGMEDEDRE180VLKWKFDSSLARRHMARELHPEYYKDC207(SEQ ID NO19)
22.HIV-1C亚型的部分rev基因的共有氨基酸序列如下MAGRSGDSDEALIQAVRIIKILYQSNPYPKPEGTRQARKNRRRRWRARQRQIHSISERIL60STCLGRPAEPVPLQLPPIERLHIDCSESSGTSGTQQSQQTTEGVGSP107(SEQ ID NO20)
23.权利要求1和2所述序列的至少一种、权利要求3和4所述序列的至少一种、权利要求5和6所述序列的至少一种以及权利要求7和8所述序列的至少一种在生产用于治疗或预防HIV感染的疫苗中的应用。
24.权利要求1至22所述的序列中至少两种序列在生产用于治疗或预防HIV感染的疫苗中的应用。
25.包含权利要求1和2所述序列的至少一种、权利要求3和4所述序列的至少一种、权利要求5和6所述序列的至少一种以及权利要求7和8所述序列的至少一种的疫苗。
26.包含权利要求1至22所述序列中至少两种序列的疫苗。
27.包含至少部分的gag基因序列、逆转录酶(pol)基因序列、改排tat基因序列和截取的nef基因序列的疫苗，这些基因序列结合在一起形成框内多基因，以grttnC表示(SEQ I.D.No30)。
28.权利要求25至27任一所述的用于治疗或预防HIV的疫苗。
29.权利要求25至28任一所述的基本上如这里所述或举例说明的疫苗。
全文摘要
本发明描述HIV－1亚型分离调节/附加基因及其修饰物和衍生物。所描述的基因有tat、nef和rev基因。并公开了共有氨基酸系列。本发明还涉及包括两个或多个核苷酸序列的疫苗以及来自HIV－1的pol和/或gag基因的核苷酸序列。
文档编号C12N15/49GK1606625SQ02825711
公开日2005年4月13日 申请日期2002年10月31日 优先权日2001年10月31日
发明者卡罗琳·威廉森, 乔安妮·海迪·范哈梅伦, 克莱夫·莫里斯·格雷, 威廉·博恩, 萨利姆·阿卜杜勒·卡里姆 申请人:南非医学研究会, 开普敦大学