专利名称：通过全面检测和定量食物中毒细菌的热稳定直接溶血素相关的基因 ( t d h ) 相关溶 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及简捷、快速、准确地对热稳定溶血素(hemolysin)蛋白组的基因进行检测、定量分析和分类的方法，所述热稳定溶血素蛋白组指的是TDH(热稳定直接溶血素)、TRH(TDH相关溶血素)和其它类似的溶血蛋白，下文称为TDH相关毒素，它们是由弧菌属病原菌，如副溶血弧菌、部分霍乱弧菌、最小弧菌和霍氏弧菌产生的。即，本发明涉及了渔业、食品工业、公共卫生、临床实验室检测等领域。
背景技术：
弧菌属病原菌，包括副溶血弧菌、部分霍乱弧菌、最小弧菌、霍氏弧菌，是食品卫生控制中重要的细菌种群。口腔感染后会出现严重的症状，并可导致患者死亡。在日本，副溶血弧菌食物中毒的发生率尤其高，在食物中毒的起因中通常居前列。出于此考虑，有必要检测主要感染源-未烹饪的鱼、海产品中的副溶血弧菌。只有一些携带热稳定溶血素蛋白(热稳定直接溶血素TDH)基因和有类似毒素蛋白(TDH相关溶血素TRH)基因的弧菌属细菌才是食物中毒的病因。在食品卫生站点，食品卫生控制是通过设定食物中的副溶血弧菌总数容许量的上限来实现的。其前提是产毒素细菌在从食物(易腐烂的鱼和海产品)中分离的副溶血弧菌中占有一定比例或更多。具体地说，依照“食品卫生检查指南”对怀疑是副溶血弧菌的细菌进行计数。如果细菌数量等于或少于参照值(100cfu/g或更低)，食品就是安全的(依照日本厚生劳动省，药品和食品安全局，食品安全处，标准分处的第22号公告)。
如上所述，病原性副溶血弧菌仅是那些能产生TDH或TRH的副溶血弧菌。此外，TDH也存在于除副溶血弧菌外的其它弧菌属细菌中。因此，从更广的角度来说，食物中毒的预防和合乎需要的控制不应该用副溶血弧菌的数量作为指标，而是以是否有产TDH或TRH的细菌的存在或其数量作为。
据报道除了副溶血弧菌外的弧菌属细菌，即非01霍乱弧菌、霍氏弧菌和最小弧菌的一些菌株具有产生TDH的基因tdh(Infect.Immun.，52，319-322，1986，J Bacteriol.，171，6859-6861，FEMSMicrobiol.Lett.，84，249-254，1990)。已发现TDH相关毒素蛋白是从弧菌属的实际病原菌的门(phylum)独立进化而来，弧菌属病原菌通过水平传播(horizontal transmission)独立地获得每种毒素(J.Bacteriol.，173，5036-5046)。因此，似乎有一种可能就是除了已知产毒菌株外的其它菌株获得并保留了TDH相关毒素的基因。依此观点，在食品卫生控制站点检测和定量确定能够产生TDH相关毒素蛋白的实际细菌是理想的(ideal)。但是，并没有一个灵活可信的检测和定量确定TDH相关毒素的方法，因此，在食品卫生控制站点很难切实执行。
发明公开发明所要解决的问题如上所述，在食品卫生控制站点对能够产生TDH相关毒素蛋白的实际细菌进行检测和定量是理想的。为此目的展开的TDH相关毒素蛋白编码基因的全面检测和拷贝数的定量分析也是合适的。检测和定量确定TDH相关毒素蛋白使得检测和定量确定可能有相同毒性和病原性的细菌成为可能。
然而，用这种方法检测存在着很大的技术问题。具体地说，没有一种方法能够同时并全面地检测TDH相关毒素蛋白组所有已知的基因类型。相应地，当进行基因扩增(比如使用引物的PCR法)和检测时，必须单独设计引物的类型，并且必须同时使用大量的引物进行检测。因此，这种方法是不实际的。另外，后文会提到，把现存的引物结合使用很可能不能检测到所有的TDH相关毒素基因。
TDH是一种被认为引起神奈川(Kanagawa)现象的溶血素，神奈川现象与副溶血弧菌食物中毒的病因有关，会出现人红细胞的溶血。有动物实验表明，纯化的TDH与施用活细胞的一例样本产生相似的特性，因此，TDH被认为是致病因子。另一方面，TRH被发现于来源于不出现神奈川现象的食物中毒患者的菌株。TRH在氨基酸水平与TDH有大约68％的同源性，但与TDH不同，TRH是热不稳定溶血素(Infect.Immun.，56，961-965，1988)。
已知编码TRH的trh基因包括两型(trh1和trh2)，它们有大约16％的核苷酸序列互不相同(Appl.Environ.Microbiol.，58，2449-2457，1992)。此外，比较TDH型毒素组(group)和TRH毒素组的氨基酸序列会发现，这两种毒素组都经过了长期的演化过程并获得了各自的基因多样性(diversity)。因此，可能会存在具有未知的中间类型序列的毒素。事实上已经有报道，来源于霍氏弧菌一些菌株的tdh基因与其它弧菌属细菌(如副溶血弧菌)的tdh基因有系统发生上的不同(Microbiol.Immunol.，40，59-65，1996)。此报道还表明3个检测tdh基因的现有PCR引物对中的2个不能完全检测出被检霍氏弧菌的每个tdh基因类型。此外，据报道，就trh基因而言，trh1和trh2基因存在菌株之间的核苷酸序列的差异(Appl.Evniron.Microbiol.，58，2449-2457，1992)。但是，在设计检测trh基因的现有PCR引物时并没有考虑这trh1和trh2基因核苷酸序列间的不同，所以很难说这种检测trh基因的PCR引物令人满意。实际在本发明的方法中，发现了一种与TRH类似并且用标准引物很难扩增的新的毒素基因。这些结果强有力地表明除了现已发现的基因外还可能有TDH相关毒素基因存在。
现在，分别用于检测产生TDH的tdh基因和产生TRH的trh基因的PCR引物(仅检测tdh基因的引物，仅检测trh1的引物和同时检测trh1和trh2基因的引物)已经被应用于毒素基因的测试(JapanesePatent Laid-Open No.4-293486，Mol.Cell.Probes，6477-487，1992)，而且，它们作为一种研究副溶血弧菌的试剂已经出现在市场上。但是由于上述原因，没有一种商品试剂可以提供检测和定量确定食物中TDH相关毒素或毒素基因的方法。也就是说，如果在食品卫生控制站点使用这种试剂，就需要同时使用多种检测系统，即便如此，仍然可能出现假阴性结果。
解决问题的方式作为解决上述问题的研究结果，我们发现了TDH和TRH蛋白存在高度保守区。具体地说，通过对TDH和TRH已知氨基酸序列的多重比对(multi-alignment)分析，我们发现了TDH和TRH中有高度同源性的区域。由此完成了本发明。
本发明的特征在于，可同时检测溶血素基因tdh和trh，方法是利用核苷酸序列设计混合引物(退变引物(degenerate primers))，所述核苷酸序列相应于与具有不同序列的两种类型的溶血素高度同源的氨基酸序列；用PCR方法扩增编码两种类型的溶血素的tdh和trh基因的片段；从产TDH和产TRH菌株中获取扩增片段，其序列的侧翼是引物。此外，本发明的特征还在于可以确定毒素类型，功能上与TDH和TRH类似的未知毒素基因片段也可以被检测出来。
附图的简单描述[
图1]图1a-1c基于现有的TDH和TRH氨基酸序列进行多重排列分析的结果删除Entrez蛋白数据库里的13种类型的TDH氨基酸序列(8种类型的副溶血弧菌，1种类型的最小弧菌，1种类型的霍乱弧菌和3种类型的霍氏弧菌)和3种类型的TRH氨基酸序列(只有副溶血弧菌)的信号肽序列(第一部分中的24个氨基酸)，然后进行多重排列分析。细菌种类名称和毒素类型后面以“”分隔的数字代表数据库的登记号。
图2琼脂糖凝胶电泳的PCR扩增产物分析泳道1100bp梯状标记(ladder marker)；泳道2IFO12711T(trh)；泳道3V89-655(trh1)；泳道4V89-656(tdh)；泳道5V99-157(tdh)；泳道6V99-161(tdh)泳道7V99-177(tdh)；泳道8V99-215(tdh)；泳道9V99-223(tdh)；泳道10阴性对照(无DNA)[图3]图3PCR扩增的DNA片段系统发生树(phylogenetic trees)系统发生树是在把被分析核酸序列翻译成氨基酸序列后用neighbor-joining(NJ)方法建立的。本发明分析的数据以符号*标示。对未用*号标示的数据，使用Entrez蛋白数据库中的序列(在图中，“”后的数字代表数据库登记号)。
副溶血弧菌模式菌株(IFO12711T)所含的TRH用←标示。
图4通过熔解曲线分析扩增的DNA产物的Tm值将Light cycler扩增的PCR产物以每秒钟0.1℃的速率从65℃上升到95℃，接着分析扩增产物的熔解曲线。用Light cycler附带的Lightcycler软件(第3版)进行分析。
实施本发明的最佳方式根据本发明，可以检测可能产生溶血素的弧菌属细菌，并用混合核酸序列鉴定毒素类型，所述混合核酸序列编码TDH和TRH氨基酸序列中一部分共同序列，所述TDH和TRH分别由一些弧菌属细菌的tdh和trh基因编码。
用Clustal W计算机程序对13种类型的已知热稳定型溶血素TDH和3种类型的TDH相关毒素TRH的氨基酸序列进行多重排列分析(图1)，发现两种毒素中都存在高度保守的氨基酸序列。紧接着，用相同的混合引物来研究tdh和trh基因是否能用PCR方法扩增，所述引物是将这些氨基酸序列反向翻译成核酸序列产生的。
高度保守氨基酸序列的例子包括(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVR，(2)KRKPY，(3)Y(M或I)TV(N或S)IN，(4)YTMAA(V或L)SGYK，(5)YLDETP(E或S)YFV，(6)VEAYESG和(7)VMCISNK。这些序列分别与序列表中SEQ ID NO1的氨基酸位置相应。具体地说，序列(1)与氨基酸位置3-21相应；序列(2)与45-49；序列(3)与69-75；序列(4)与79-88；序列(5)与126-135；序列(6)与137-143；序列(7)与149-155相应。(α或β)的意思是在括号的位置是氨基酸α或β。例如，(5)YLDETP(E或S)YFV表示YLDETPEYFV或者YLDETPSYFV。
特别优选的高度保守氨基酸序列的例子包括氨基酸序列(1)LPS(V或I)PFPE(A或S)PGSD(L或I)LFVVLR中的DE(L或I)LFVV；(6)VEAYESG；(3)Y(M或I)TV(N或S)IN中的YMTVNIN；和(5)YLDETP(E或S)YFV中的DETPEYFV。
制备编码这些氨基酸序列的全部或部分的混合引物。这些混合引物的例子包括编码DE(L或I)LFVV的正义(sense)引物5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’，和编码VEAYESG的反义引物5’-ccnswytcrtangcytcnac-3’(在本说明书中n代表a，t，c或g)。用这些引物扩增样品，可用一次实验轻松地检测出tdh和trh基因。
此外，与以上tdh和trh基因类似的未知溶血素的基因也可以用这些引物检测。在这种情况下，先将一个已知序列加入每种引物的5’末端，以便能用扩增的片段进行直接的序列反应。用添加了已知序列的引物作为序列引物可以直接检测核酸序列，而不用克隆扩增的DNA片段。
对本发明的扩增DNA片段的分析结果也可以用实时PCR分析中的溶解曲线分析等来评价，不用确定核苷酸序列，如实施例所示。
本发明包括检测、定量确定或鉴别溶血素基因的试剂盒，它使用了基于上述氨基酸序列设计的混合引物，以及其他药剂的组合。
实施例[实施例1]用图1所示的高度保守区域，设计编码(1)来自LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVLR的DE(L或I)LFVV的正义引物5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’，和编码(6)VEAYESG的反义引物5’-ccnswytcrtangcytcnac-3’。这些引物分别与副溶血弧菌的TDH氨基酸位置38-44和161-167相应。前一种混合引物有3072种组合，后一种混合引物有2048种混合。用引物的组合可以通过PCR获取386bp扩增DNA片段。但获得的DNA片段可能是一种未知溶血素基因。因此，先将已知序列(正义侧5’-caggaaacagctatgacc-3’，反义侧5’-tgtaaaacgacggccagt-3’)加入到每个引物的5’末端，使之能用扩增片段进行直接序列反应。用添加了已知序列的引物作为序列引物可以直接确定核苷酸序列，而不用克隆扩增的DNA片段。此外，加入该序列后扩增的DNA产物是422bp。
用上述引物通过PCR扩增毒素基因片段，所使用的模板是用标准方法从表1所列的8种已知能产FDH或TRH的副溶血弧菌菌株中提取的染色体DNA。
扩增反应用热稳定DNA聚合酶(AmpliTaq GoldAppliedBiosystems)和GENE MATE热循环仪(ISC BioExpress)进行。制备终体积为50μl反应液，包含0.1μg DNA，50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3)，2.0mM MgCl2，0.01％明胶，dNTP(每种0.2mM)，2.5UAmpliTaq Gold和引物(每种1μM)。反应条件包括AmpliTaq Gold激活(95℃ 10分钟)；95℃ 1分钟的5个反应循环，45℃ 40秒，72℃1分30秒；94℃ 1分钟的35个反应循环，46℃ 40秒，72℃ 1分30秒；然后72℃ 10分钟进行延伸反应。将得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶(Sea Plaque GTG琼脂糖BioWhittaker MolecularApplications)电泳(0.5×TAE，100V 30分钟)，溴乙锭染色10分钟。紫外灯照射下确认扩增产物的存在。
结果，如图2所示，对所有产生TDH或TRH菌株的DNA，确认了422bp的DNA片段的扩增。
依标准方法切下含扩增片段的凝胶并提纯，用上述序列引物以双脱氧法确定核苷酸序列。
核苷酸序列用ABI PRISM BigDye Terminator Cycle SequenceingReady Reaction Kit(Applied Biosystems)和ABI PRISM 310 GENETICANALYZER(Applied Biosystems)确定。
产生的核酸序列(SEQ ID NO41-46)被翻译成氨基酸序列，并确认为编码TDH和TRH的基因。
一直被报道具有trh2基因的副溶血弧菌模式菌株IFO12711T(副溶血弧菌专题会概述，No.33，1999Clinical Microbiology，27，p239，2000)的一种毒素基因，被显示是一种新的基因(SEQ ID NO40)，与trh2基因序列有所不同(氨基酸水平有80％的同源性，核酸水平有91％的同源性)，并且与目前所知道的基因不同(表3)。
所以，以基于TDH和TRH蛋白的高度同源区的氨基酸序列的混合引物可以同时检测tdh和trh基因，并检测未知的TDH相关毒素基因。
表1 本研究中所用的副溶血弧菌菌株
用图1所示的高度同源区域，设计编码Y(M或I)TV(N或S)IN中的YMTVNIN的正义引物5’-tayatgacngtnaayathaayg-3’和编码YLDETP(E或S)YFV中的DETPEYFV的反义引物5’-acraartaytcnggngtytcrtc-3’。引物分别与副溶血弧菌TDH的氨基酸位置100-106和152-159相应。两种引物都是混合引物，有512种组合。用这些引物的组合可以扩增出180bp的DNA片段。
检测和确定溶血素基因可以使用实时PCR技术，并使用LightCycler System(Roche Diagnostics Co.，Ltd.)，其模板染色体DNA来源于产TDH菌株，1型产TRH菌株和副溶血弧菌模式菌株(IFO12711T)，后者被证明能生成一种新的TRH。以LightCycler-DNAMaster SYBR Green I kit(Roche Diagnostics Co.，Ltd.)作为反应液，加0.1μg DNA，制成终体积为20μl的反应液。为进行自动热启动，用抗Taq聚合酶的抗体(Taq Start AntibodyClontech)失活Light Cycler DNAMaster mix SYBR Green I。
反应条件包括激活Taq聚合酶(95℃ 90秒)；95℃ 0秒，44℃10sec，72℃ 30sec的5个反应循环；然后进行94℃ 0秒，45℃ 10秒，72℃ 30秒的35个反应循环。扩增反应完成后，温度以0.1℃/秒的速率从65℃升至95℃，然后分析扩增产物熔解曲线。
通过分析从所有DNA中确认扩增产物。熔解曲线分析显示，tdh基因片段，trh1基因片段和一个新的trh基因片段都显示了不同的Tm值(特异性熔解温度)，可以很容易地被鉴别(图4)。
用热循环仪确认目的基因所经历的标准的从扩增到电泳的过程需要3-4小时。但使用本发明的实时PCR仅需要40分钟，包括从目的基因的扩增到熔解曲线的分析，和同时确认毒素类型。
工业实用性本发明为全面检测编码TDH相关毒素蛋白组的多种基因群提供了一种通用方法，所述蛋白组有不同的氨基酸序列。此方法能快速检测食品(尤其是鲜食的易腐坏的鱼和海产品)中是否含有任何携带有TDH相关毒素蛋白基因的细菌。当存在具有毒素基因的细菌时，此法能快速评价食品安全性，因为可以用此法确定带有毒素基因的细菌的数目。因此本发明可以极大地预防食物中毒，提高食品制造和食品销售领域卫生监控的有效性和高度准确性。
本发明使人们能够检测食物中毒患者的粪便和食物中是否有TDH相关毒素蛋白基因，并快速确定毒素类型。此外还可以鉴定从粪便或食物中分离的菌株是否有TDH相关毒素蛋白基因，如果菌株有这种基因，还可以快速确定毒素类型。
本说明书引入2001年10月18提交日本专利局的专利申请2001-320403(已要求优先权)的说明书和附图的内容作为参考。
序列表<110>NICHIREI CORPORATION<120>通过全面检测和定量食物中毒细菌的热稳定直接溶血素相关基因(tdh相关溶血素基因)对产溶血素细菌进行检测和定量的方法<130>PH-1547PCT<140>JP 2001-320403<141>2001-10-18<160>46<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>149<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>1Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Asn100 105 110Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
115 120 125Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu130 135 140Cys Lys His Gln Gln145<210>2<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>2Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Ser100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Gln Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160
Cys Lys His Gln Gln165<210>3<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>3Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Asn Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asn Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys Tyr Gln Asn165
<210>4<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>4Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Glu Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys His Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asp Ser Val Ala Ser100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys His Gln Gln165<210>5<211>165<212>PRT
<213>副溶血弧菌<400>5Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Gln Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Gly Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys His Gln Gln165<210>6<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>6Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile
1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Gln Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Gly Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys His Gln Gln165<210>7<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>7Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Ala Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30
Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Arg Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Lys Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Glu His Gln Lys165<210>8<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>8Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Ala Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45
Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Arg Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Glu His Gln Lys165<210>9<211>165<212>PRT<213>霍乱弧菌<400>9Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Asn Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr
65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asn Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asp Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Lys Tyr Gln Asn165<210>10<211>165<212>PRT<213>最小弧菌<400>10Phe Glu Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Ala Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asp Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Asp Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Ser Gly His Ser Ala Val Phe Val85 90 95
Lys Ser Asp Gln Val Gln Leu Gln His Ser Tyr Asn Ser Val Ala Asn100 105 110Phe Val Gly Glu Asp Glu Asp Ser Ile Pro Ser Lys Met Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Val Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Phe Phe Glu145 150 155 160Cys Glu His Gln Arg165<210>11<211>165<212>PRT<213>霍氏弧菌<400>11Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp100 105 110
Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu145 150 155 160Cys Glu Glu Gln Gln165<210>12<211>165<212>PRT<213>霍氏弧菌<400>12Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Glu Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp100 105 110Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser
130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu145 150 155 160Cys Glu Glu Gln Gln165<210>13<211>165<212>PRT<213>霍氏弧菌<400>13Phe Glu Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asp Thr Thr Phe Asn Thr Lys Glu Pro Val Asn20 25 30Val Lys Val Ser Asp Phe Trp Thr Asn Arg Asn Val Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val His Gly Gln Ser Val Phe Ile Thr Ser Gly Thr Lys50 55 60Trp Leu Thr Ser Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn Asn Lys Asp Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Phe Ser Ser Val Phe Val85 90 95Lys Ser Gly Gln Ile Gln Leu Gln His Tyr Tyr Asn Ser Val Ala Asp100 105 110Phe Val Gly Gly Asp Glu Asn Ser Ile Pro Ser Lys Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser130 135 140Gly Asn Ile Leu Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Glu Ser Tyr Phe Glu145 150 155 160
Cys Glu Ser Gln Gln165<210>14<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>14Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Asn20 25 30Ala Ile Val Asn Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Asn Ile Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Ser Val His Gly Gln Ser Ile Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Ser Ala Tyr Ile Thr Val Asn Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Leu Ser Thr Val Phe Thr85 90 95Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asn Tyr Ser Ser Val Ser Asp100 105 110Phe Val Gly Glu Asn Glu Glu Ser Leu Pro Ser Val Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn130 135 140Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Ser Ser Phe Asp Glu145 150 155 160Cys Met Ser Gln Asn165
<210>15<211>165<212>PRT<213>副溶血弧菌<400>15Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Asn20 25 30Ala Ile Val Asp Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Asn Ile Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Ser Val His Gly Gln Ser Ile Phe Thr Thr Ser Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Ser Ala Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Gly Asn Asn Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys Asp Gly Leu Ser Thr Val Phe Thr85 90 95Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asn Tyr Ser Ser Val Ser Asp100 105 110Phe Val Gly Glu Asn Glu Glu Ser Leu Pro Ser Val Thr Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Asn Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn130 135 140Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Ser Ser Phe Asp Glu145 150 155 160Cys Met Ser Gln Asn165<210>16<211>165<212>PRT
<213>副溶血弧菌<400>16Ile Asp Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu1 5 10 15Leu Phe Val Val Arg Asn Thr Thr Ile Lys Thr Glu Ser Pro Val Lys20 25 30Ala Ile Val Glu Asp Tyr Trp Thr Asn Arg Thr Ile Lys Arg Lys Pro35 40 45Tyr Lys Asp Val Tyr Gly Gln Ser Val Phe Thr Thr Ala Gly Ser Lys50 55 60Trp Leu Ser Ala Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn Gly His Asn Tyr Thr65 70 75 80Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys His Gly Thr Ser Thr Val Phe Thr85 90 95Lys Ser Glu Lys Thr Ser Leu Asn Gln Asp Phe Tyr Ser Val Lys Ser100 105 110Phe Val Asp Asp Ser Glu Glu Ser Ile Pro Ser Ile Asn Tyr Leu Asp115 120 125Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val Thr Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly Asn130 135 140Gly His Met Phe Val Met Cys Ile Ser Asn Lys Leu Ser Phe Gly Glu145 150 155 160Cys Lys Ser Gln Ile165<210>17<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段
<400>17Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>18<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>18Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>19<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>19Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>20<211>19<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>20Leu Pro Ser Val Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>21<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>21Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>22<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>22Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Leu Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg
<210>23<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>23Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ala Pro Gly Ser Asp Glu Leu Ile Leu1 5 10 15Phe Val Val Arg20<210>24<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>24Leu Pro Ser Ile Pro Phe Pro Ser Pro Gly Ser Asp Glu Ile Leu Phe1 5 10 15Val Val Arg<210>25<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>25Lys Arg Lys Pro Tyr1 5
<210>26<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>26Tyr Met Thr Val Asn Ile Asn1 5<210>27<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>27Tyr Met Thr Val Ser Ile Asn1 5<210>28<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>28Tyr Ile Thr Val Asn Ile Asn1 5<210>29<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>29Tyr Ile Thr Val Ser Ile Asn1 5<210>30<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>30Tyr Thr Met Ala Ala Val Ser Gly Tyr Lys1 5 10<210>31<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>31Tyr Thr Met Ala Ala Leu Ser Gly Tyr Lys1 5 10<210>32<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段
<400>32Tyr Leu Asp Glu Thr Pro Glu Tyr Phe Val1 5 10<210>33<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>33Tyr Leu Asp Glu Thr Pro Ser Tyr Phe Val1 5 10<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>34Val Glu Ala Tyr Glu Ser Gly1 5<210>35<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述TDH或TRH的片段<400>35Val Met Cys Ile Ser Asn Lys1 5
<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述编码TDH、TRH或类似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>9，12，18<223>n表示a，g，c或t<400>36gaygarhtny tnttygtngt 20<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述编码TDH、TRH或类似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>3，12，18<223>n表示a，g，c或t<400>37ccnswytcrt angcytcnac 20<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述编码TDH、TRH或类似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>12，15<223>n表示a，g，c或t<400>38acraartayt cnggngtytc rtc23<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述编码TDH、TRH或类似溶血素的基因的引物<220>
<221>
<222>9，12<223>n表示a，g，c或t<400>39tayatgacng tnaayathaa yg22<210>40<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌IFO12711T<400>40gttagaaata caacaatcaa aactgaatcc ccggttaagg caattgtgga ggactattgg 60acaaaccgaa acataaaaag aaaaccatac aaagatgtat acggtcaatc ggttttcaca 120acagcaggtt caaagtggtt aagcgcctat atgacagtaa acatcaatgg tcataactat 180acgatggcag ctctttctgg ttataaagat ggtatttcta cggtcttcac aaaatcagag 240aaaacaagcc taaagcaaga ctattcctcg gtaaaatatt ttgttgatga caacgaagaa 300tcaataccaa gtgtaactta tttagatgaa acatcagaat actttgttac tgt 353<210>41<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V89 655<400>41gttagaaata caacaataaa aactgaatca ccagttaacg caatcgttaa tgactactgg 60
acaaaccgaa acataaaacg aaaaccatat aaaagcgttc acggtcaatc tattttcacg 120acttcaggct caaaatggtt aagcgcctat ataacggtaa atattaatgg aaataactac 180acaatggctg ctctttctgg ctataaagat ggcctttcaa cggtcttcac aaaatcagaa 240aaaacaagcc taaatcagaa ctattcttct gttagtgatt tcgttggtga aaatgaagaa 300tcattgccaa gtgtaacgta tttggatgaa acgccagaat atttcgtcaa tgt 353<210>42<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V89 656<400>42gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggct gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180acaatggcag cggtgtctgg ctataagcgc ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat 240caagtacagc ttcaacattc ctatgattct gtagctaact ttgttggtga agatgaaggt 300tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa actccagaat attttgttaa tgt 353<210>43<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V99 157<400>43gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggtt gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180acaatggcag cggtgtctgg ctataagaac ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat 240caagtacagc ttcaacattc ctatgattct gtagctaact ttgttggtga agatgaaggt 300tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa actccagaat attttgttaa tgt 353<210>44<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V99 161<400>44gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggct gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180
acaatggcag cggtgtctgg ctataagcgc ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat 240caagtacagc ttcaacattc ctatgattct gtagctaact ttgttggtga agatgaaggt 300tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa actccagaat attttgttaa tgt 353<210>45<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V99 177<400>45gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggct gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180acaatggcag cggtgtctgg ctataagagc ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat 240caagtacagc ttcaacattc ctatgattct gtagctaact ttgttggtga agatgaaggt 300tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa actccagaat attttgttaa tgt 353<210>46<211>353<212>DNA<213>副溶血弧菌V99 223<400>46gttcgagata caacttttaa tacccaagct ccggtcaatg taaaggtctc tgacttttgg 60acaaaccgta atgtaaaaag aaaaccgtac aaagatgttt atggtcaatc agtattcaca 120acgtcaggta ctaaatggct gacatcctac atgactgtga acattaatga taaagactat 180acaatggcag cggtgtctgg ctataagcgc ggtcattctg ctgtgttcgt aaaatcagat 240caagtacagc ttcaacattc ctatgattct gtagctaact ttgttggtga agatgaaggt 300tctattccaa gtaaaatgta tttggatgaa actccagaat attttgttaa tgt 35权利要求
1.一种用于检测和定量确定携带TDH相关毒素[TDH(热稳定直接溶血素)，TRH(TDH相关溶血素)]基因的病原菌的方法，包括使用广泛分布于弧菌属病原菌中的，编码热稳定溶血素蛋白组[TDH(热稳定直接溶血素)，TRH(TDH相关溶血素)和类似溶血素蛋白，下文称为TDH相关毒素]的氨基酸序列中存在的共有氨基酸序列的基因序列，由此广泛而全面地检测和定量确定TDH相关毒素基因。
2.一种全面检测和鉴别携带TDH相关毒素基因的细菌的方法，包括用多种寡核苷酸作为PCR引物对，完全扩增广泛分布于弧菌属病原菌中TDH相关毒素基因的步骤，所述PCR引物对编码选自以下氨基酸序列(1)至(7)的至少两条氨基酸序列中的部分或全部，所述氨基酸序列是权利要求1中的共有氨基酸，并具有作为实际引物的功能(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVR，(2)KRKPY，(3)Y(M或I)TV(N或S)IN，(4)YTMAA(V或L)SGYK，(5)YLDETP(E或S)YFV，(6)VEAYESG，(7)VMCISNK。
3.一种扩增TDH相关毒素基因的引物，包括编码选自以下氨基酸序列(1)至(7)的部分或全部氨基酸序列的寡核苷酸，所述氨基酸序列是权利要求1中的共有氨基酸(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVR，(2)KRKPY，(3)Y(M或I)TV(N或S)IN，(4)YTMAA(V或L)SGYK，(5)YLDETP(E或S)YFV，(6)VEAYESG，(7)VMCISNK。
4.一种扩增TDH相关毒素基因的引物，其包含编码氨基酸序列(1)LPS(V或I)PFP(A或S)PGSDE(L或I)LFVVLR中的DE(L或I)LFVV的5’-gaygarhtnytnttygtngt-3’，及其相应的互补链。
5.一种扩增TDH相关毒素基因的引物，其包含编码氨基酸序列(6)VEAYESG的核苷酸序列的互补链5’-ccnswytcrtangcytcnac-3’，及其相应的互补链。
6.一种扩增TDH相关毒素基因的引物，其包含编码氨基酸序列(3)Y(M或I)TV(N或S)IN中的YMTVNIN的5’-tayatgacngtnaayathaayg-3’，及其相应的互补链。
7.一种扩增TDH相关毒素基因的引物，其包含编码氨基酸序列(5)YLDETP(E或S)YFV中的DETPEYFV的核苷酸序列的互补链5’-acraartaytcnggngtytcrtc-3’，及其互补链。
8.一种全面检测和定量确定产TDH相关毒素的细菌的方法，其包括用权利要求3-7中任一项的引物检测TDH相关毒素基因的步骤。
9.一种对检测到的毒素基因编码的毒素类型进行分类的方法，其包括用基因扩增系统，用编码TDH和TRH的氨基酸序列中的共有氨基酸序列的基因序列完全扩增TDH相关毒素基因；分析扩增产物的Tm值(特异性熔解温度)。
10.一种对产生TDH相关毒素蛋白的细菌产生的毒素类型进行分类的方法，其中使用了权利要求3-7中任一项的引物。
11.一种试剂盒，用于检测和定量确定TDH相关毒素蛋白的基因和产TDH相关毒素蛋白的细菌，或检测毒素类型以进行分类，所述试剂盒包含权利要求3-7中任一项的引物。
全文摘要
本发明可以简单、快捷、准确地检测、定量确定和鉴别弧菌属病原菌产生的热稳定溶血素蛋白组[指的是TDH(热稳定直接溶血素)，TRH(TDH相关溶血素)和其它类似溶血素蛋白，下文称为TDH相关毒素]的基因。本发明为检测和定量确定实际产TDH相关毒素细菌提供了一种方法，对食品卫生监控具有重要意义。用包含编码TDH和TRH的共有氨基酸序列的基因序列的引物对，全面检测TDH相关毒素基因，由此可以检测和定量确定产TDH相关毒素的细菌。
文档编号C12Q1/68GK1606622SQ0282556
公开日2005年4月13日 申请日期2002年10月17日 优先权日2001年10月18日
发明者小泉雄史, 山本敏, 伊藤武, 中川弘 申请人:株式会社日冷