展示副溶血弧菌tdh的迟缓爱德华菌菌蜕及构建方法
【专利摘要】一种展示副溶血弧菌TDH的迟缓爱德华菌菌蜕及构建方法，属于基因工程领域，它包括(1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh,(2)构建溶菌质粒载体p-E-tdh(3)迟缓爱德华菌的转化和筛选(4)菌脱的获得。本发明构建的表达副溶血弧菌耐热溶血素免疫保护抗原基因tdh的重组迟缓爱德华菌菌蜕疫苗，具有对迟缓爱德华菌和副溶血弧菌的共同免疫保护效果。
【专利说明】展示副溶血弧菌TDH的迟缓爱德华菌菌蜕及构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种展示副溶血弧菌耐热溶血素TDH的重 组迟缓爱德华菌菌蜕及构建方法。
【背景技术】
[0002] 细菌菌蜕是通过调控噬菌体PhiX174的裂解基因E在革兰氏阴性细菌中表达而形 成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳。细菌菌蜕不仅可以直接作为疫苗使用，而且还可作 为递呈异源抗原的重组疫苗及作为核酸疫苗甚至药物的递送载体。本发明旨在建立迟缓爱 德华菌菌蜕作为副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的递送载体制备的方法及免疫保护应用。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种展示副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的迟 缓爱德华菌菌蜕及构建方法。
[0004] 本发明提供一种展示副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的重组迟缓爱德华菌菌蜕。
[0005] 本发明提供一种展示副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的重组迟缓爱德华菌菌蜕 的构建方法，它的步骤如下：
[0006] (1)克隆噬菌PhiX174溶菌基因与副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh，所述的噬菌 PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh简称tdh基因；
[0007] (2)构建溶菌质粒载体p-E-tdh
[0008] 根据嗤囷体PhiX174洛囷基因和副洛血弧囷耐热洛血素基因tdh的序列设计引 物，上、下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和tdh 基因上游引物中加上linker序列；并以人工合成的E基因和tdh基因为模板分别进行PCR 扩增，回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以E基因上游引物和tdh基因下游引 物进行第二次扩增，将E基因和tdh基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合 基因片段E-tdh ;用BamHI和EcoRI双酶切融合基因片段E-tdh，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳 后割胶回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的PBV220大片段连接转化 ToplO感受态细胞，用E基因上游引物和tdh基因下游引物对转化后培养生长的菌落进行 PCR筛选，所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-tdh，并用 质粒提取试剂盒提取溶菌质粒载p-E-tdh ;
[0009] 所述的 E 基因上游引物 EcoRI-E-F :5' GAGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTG-3'，
[0010] 所述的 E 基因下游引物 linker-E-R :5'-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCC ACCGCCACCCTCCTTCTGCACGTA-3' ；
[0011] 所述的tdh基因上游引物linker-tdh-F :5'
[0012] GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCG GTGGCGGCAG ATATCCATGTTGGCTGCA-3'，
[0013] 所述的 tdh 基因下游引物 BamHI-tdh-R ：5?-TTAGGGATCCCTAAAACGATTCTTTGTTGG-3 夕 ，
[0014] (3)迟缓爱德华菌的转化和筛选
[0015] 按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，冰浴迟缓爱德华菌lOmin，加入溶菌 质粒载体p-E-tdh 10 y L，冰浴30min，42°C热休克90s，冰浴l-2min，加入800 y L不含抗 生素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28°C 80?100rpm/min振荡培养45min-lh， 12, 000 X g离心lmin，去上清，剩余40-50 y L上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀涂布 于含终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28°C培养过夜， 所得阳性克隆即含溶菌质粒载体p-E-tdh的迟缓爱德华菌；
[0016] (4)菌脱的获得
[0017] 将上述步骤（3)转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-tdh的迟缓爱德华菌接种在 含终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28°C、180rpm过夜震荡培 养，然后按照1 :1〇〇的体积比转接于含终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉 汤培养基中，28°C震荡培养至所述培养液的吸光值OD_nm达0. 3-0. 4后进行42°C培养，以 诱导E基因和tdh基因表达，42°C培养诱导5小时后，离心收集菌体并用ddH20、PBS洗涤收 集的菌体，即菌蜕。
[0018] 进一步，所述步骤（2)的PCR扩增反应体系为：
[0019]
【权利要求】
1. 一种展示副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的重组迟缓爱德华菌菌蜕。
2. 根据权利要求1所述的一种展示副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的重组迟缓爱德华 菌菌蜕的构建方法，其特征在于它的步骤如下： (1) 克隆噬菌PhiX174溶菌基因与副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh，所述的噬菌 PhiX174溶菌基因简称E基因，所述的副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh简称tdh基因； (2) 构建溶菌质粒载体p-E-tdh 根据嗤囷体PhiX174?谷囷基因和副?谷血弧囷耐热?谷血素基因tdh的序列设计引物，上、 下游引物末端分别引入限制性酶切位点EcoRI和BamHI，并在E基因下游引物和tdh基因上 游引物中加上linker序列；并以人工合成的E基因和tdh基因为模板分别进行PCR扩增， 回收目的片段，并以纯化后的目的片段为模板，以E基因上游引物和tdh基因下游引物进行 第二次扩增，将E基因和tdh基因片段连接到一起，用试剂盒纯化PCR产物得到融合基因片 段E-tdh;用BamHI和ECORI双酶切融合基因片段E-tdh，经0.8%琼脂糖凝胶电泳后割胶 回收各片段，回收后的片段与经相同双酶切并割胶回收的PBV220大片段连接转化ToplO感 受态细胞，用E基因上游引物和tdh基因下游引物对转化后培养生长的菌落进行PCR筛选， 所得阳性克隆送公司进行测序鉴定正确后，溶菌质粒载体命名为p-E-tdh，并用质粒提取试 剂盒提取溶菌质粒载p-E-tdh; 所述的E基因上游引物E基因上游引物EcoRI-E-F:5'GAGGAATTCATGGTACGCTGGACTT TG-3'， 所述的E基因下游引物Iinker-E-R:5'-CTGCCGCCACCGCCGCTTCCGCCACCGCCGCTTCCACCG CCACCCTCCTTCTGCACGTA-3' ； 所述的tdh基因上游引物linker-tdh-F:5' GTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGATATCCATGTTGGCTGCA-3'， 所述的tdh基因下游引物BamHI-tdh-R:5' -TTAGGGATCCCTAAAACGATTCTTTGTTGG-3?； (3) 迟缓爱德华菌的转化和筛选 按照常规方法制备迟缓爱德华菌感受态细胞，冰浴迟缓爱德华菌lOmin，加入溶菌质 粒载体P-E-tdh10μL，冰浴30min，42°C热休克90s，冰浴l-2min，加入800μL不含抗生 素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基液体培养基，28°C80?lOOrpm/min振荡培养45min-lh， 12,OOOXg离心lmin，去上清，剩余40-50μL上清液重悬沉淀，重悬沉淀后的液体均匀涂布 于含终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰酪胨大豆肉汤琼脂培养基平板上，28°C培养过夜， 所得阳性克隆即含溶菌质粒载体P-E-tdh的迟缓爱德华菌； (4) 菌脱的获得 将上述步骤（3)转化筛选后的含溶菌质粒载体p-E-tdh的迟缓爱德华菌接种在含终浓 度为100ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，28°C、180rpm过夜震荡培养，然 后按照1 :1〇〇的体积比转接于含终浓度为l〇〇ug/ml氨苄青霉素的胰蛋白胨大豆肉汤培养 基中，28°C震荡培养至所述培养液的吸光值0D6QQnm达0. 3-0. 4后进行42°C培养，以诱导E 基因和tdh基因表达，42°C培养诱导5小时后，离心收集菌体并用ddH20、PBS洗涤收集的菌 体，即菌蜕。
3. 根据权利要求2所述的一种展示副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的重组迟缓爱德华 菌菌蜕的构建方法，其特征在于所述步骤（2)的PCR扩增反应体系为： 5. buffer 10. O^L dNTP 2. ΟμΙ ( I OmmoI/L) 上游引物 1. Ομ? ( 20ρηιο1/μυ 下游引物 1. 〇μ? ( 20pmol/pL) DM模板 2. Ομ? ddH20 33. (^L DNA Polymerase 1.0 (5U/>L) 总体积 50Τ〇μ? ο
4. 根据权利要求2所述的一种展示副溶血弧菌耐热溶血素基因tdh的重组迟缓爱德 华菌菌蜕的构建方法，其特征在于所述步骤（2)的PCR扩增条件：95°C5min;94°Clmin， 60°C4min，共30个循环；72°CIOmin;用1%琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，各取 1μL作模板，以E基因上游引物和tdh基因下游引物进行第二次扩增，将E基因和tdh基因 片段连接到一起，并用试剂盒纯化PCR产物。
5. -种权利要求2-4任何一项所述方法构建的菌脱。
【文档编号】C12N1/21GK104450596SQ201410851667
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】王雪鹏, 闫茂仓, 李宁求 申请人:山东农业大学, 浙江省海洋水产养殖研究所, 中国水产科学院珠江水产研究所