一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，是一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法。

背景技术：

副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，在自然环境中，并非所有分离的副溶血性弧菌都携带致病因子，其中耐热溶血毒素(tdh)、耐热相关溶血毒素(trh)、t2ss和t3ss等被确认为致病性副溶血性弧菌重要的毒力因子。一旦食用被致病性副溶血性弧菌污染的水产品，易引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠道症状。因此对致病性副溶血性弧菌的检测是水产品安全检测的重要内容。副溶血性弧菌的传统检测需要经过前增菌、选择性培养、生理生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学的溯源。近年来随着生物技术的发展，pcr、dna探针、elisa等相关技术已广泛应用于致病性副溶血性弧菌的检测，但若样品为低污染水平，通常需要经过前增菌培养以达到检测极限，检测时间大大延长。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)利用6种特异性引物，在dna聚合酶作用下1h内即可完成体外扩增，具有低成本、特异性强、灵敏度高等特点。

免疫磁分离(immonumagneticseparation，ims)技术是一种对细胞和微生物进行分离和富集捕获的免疫学方法。待测样品中的复杂组分往往会干扰致病性副溶血性弧菌检测的准确性，免疫磁分离技术具备快速富集捕获目的靶标并防止其它杂质干扰的优势。目标菌体细胞表面抗原与连有磁珠的抗体结合形成菌体细胞和免疫磁珠复合物，该复合物在磁场作用下会聚集在磁场周围，从而与其它物质分离，是有效的样品前处理方法。利用pathatrix系统可同时对五个样品进行ims分离，并在15分钟内完成目标菌的富集，缩短捕获时间，实现快速富集目标菌体，并可连接lamp技术实现对待检样品在分子水平的检测。

中国专利文献cn102586157a公开了一种高通量富集、捕获副溶血性弧菌的方法，采用副溶血性弧菌的多克隆抗体，利用edc/nhs活化法将所述副溶血性弧菌的多克隆抗体偶联在表面包被着羧基的磁珠上，获得捕获副溶血性弧菌的免疫磁珠；重悬已偶联多抗的免疫磁珠，将其加入到反应管中，再加入反应液和样品液，在洗脱管中加入洗涤液，采用pathatrix系统进行免疫富集。中国专利文献cn102586452a公开了一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，包括(1)免疫富集反应体系组分、(2)环介导核酸等温扩增体系组分、(3)一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物：两条外引物f3、b3，两条内引物fip、bip，两条环引物lf、lb。但是关于本发明的通过ims-pathatrix系统和lamp结合在一起的高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的引物组合。

本发明的第二个目的是，提供一种致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒。

本发明的第三个目的是，提供一种高通量富集、检测致病性副溶血性弧菌的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种通过免疫磁分离富集与环介导等温扩增结合检测致病性副溶血性弧菌的引物组合，所述的引物组合由引物f3、b3、fip、bip、lf和lb组成，f3引物序列如seqidno：1所示，b3引物序列如seqidno：2所示，fip引物序列如seqidno：3所示，bip引物序列如seqidno：4所示，lf引物序列如seqidno：5所示，lb引物序列如seqidno：6所示。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的引物组合在制备致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒中应用。

一种致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括免疫富集反应体系组分和环介导核酸等温扩增体系组分，所述的免疫富集反应体系组分包括：偶联了致病性副溶血性弧菌多克隆抗体的直径1.0-2.8μm免疫磁珠；含0.02％w/vnan3、以及含0.1％w/vbsa的ph7.4的pbs免疫磁珠保护液；含有1％w/vbsa的ph7.4的pbs免疫磁珠工作液；0.05mol/l、ph6.4的tris-hcl作为免疫富集反应液；含0.05％tween-20的ph7.4的pbs免疫富集洗脱液。

所述的致病性副溶血性弧菌多克隆抗体通过如下方法制得：制备免疫抗原、免疫动物、测定血清效价、纯化抗血清、抗体特异性检测。

环介导核酸等温扩增体系组分包括引物f3、b3、fip、bip、lf和lb，f3引物序列如seqidno：1所示，b3引物序列如seqidno：2所示，fip引物序列如seqidno：3所示，bip引物序列如seqidno：4所示，lf引物序列如seqidno：5所示，lb引物序列如seqidno：6所示。

环介导核酸等温扩增体系组分包括：0.2％tween-20、40mmtris碱、20mmkcl、20mm(nh4)2so4、6mmmgso4、20μmlf/lb、20μmf3/b3、20μmfip/bip、8000u/mlbstdna聚合酶、10mmdntp。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法，所述的方法使用前述的检测试剂盒。

所述的方法包括免疫磁分离和环介导等温扩增步骤。

免疫磁分离应用pathatrix系统对副溶血性弧菌进行富集捕获。

本发明优点在于：

本发明的致病性副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法同现有技术相比，通过将免疫富集和环介导等温扩增技术相结合，检测灵敏度可达到2.97logcfu/ml，具有操作过程简便、耗时短、特异性强、灵敏度高等优点。该方法可以同时处理五个样品并有效的分析样品带菌状态，大大节省劳动力，可广泛应用于各级食品药品监督管理机构、疾病预防控制实验室等对水产品和临床病人胃肠道呕吐物、血液、粪便等样品中致病性副溶血性弧菌的富集捕获和后续检测。

附图说明

附图1为ims-pathatrix-lamp特异性检测电泳结果示意图。m：100bpmarker；“-”：阴性对照；1.atcc33846；2.atcc33847；3.vp81；4.wtd43；5.wtd45；6.wtd46；7.wtd47；8.bb221；9.f36；10.g5；11.g6；12.g7；13.g8；14.霍乱弧菌；15.创伤弧菌；16.大肠杆菌；17.肠炎沙门氏菌；18.单增李斯特氏菌；19.铜绿假单胞菌；20.金黄色葡萄球菌；21.耶尔森氏菌。

附图2为ims-pathatrix-lamp纯菌液灵敏度检测电泳结果示意图。m：100bpmarker；“-”：阴性对照；1-8：1.22×10⁸cfu/ml-1.22×10¹cfu/ml。

附图3为ims-pathatrix-lamp人工污染虾样灵敏度检测电泳结果示意图。m：100bpmarker；1-8：9.40×10⁶cfu/ml-9.40×10^-2cfu/ml。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

一种致病性副溶血性弧菌的检测试剂盒，包括：

(1)免疫富集反应体系组分：

偶联了致病性副溶血性弧菌多克隆抗体的直径1.0-2.8μm免疫磁珠；含0.02％w/vnan3、以及含0.1％w/vbsa的ph7.4的pbs免疫磁珠保护液；含有1％w/vbsa的ph7.4的pbs免疫磁珠工作液；0.05mol/l、ph6.4的tris-hcl作为免疫富集反应液；含0.05％tween-20的ph7.4的pbs免疫富集洗脱液。

(2)环介导核酸等温扩增体系组分：

反应缓冲液由0.2％tween-20、40mmtris碱、20mmkcl、20mm(nh4)2so4、6mmmgso4、20μmlf/lb、20μmf3/b3、20μmfip/bip、8000u/mlbstdna聚合酶、10mmdntp。

其中，基于致病性副溶血性弧菌毒力基因的环介导等温扩增技术的特异性引物序列如下：

实施例1

一、致病性副溶血性弧菌多克隆抗体的制备：

(1)免疫抗原的制备

37℃条件下对致病性副溶血性弧菌vp81菌体进行过夜培养，将菌体稀释至1×10⁷cfu/ml，取1ml菌液进行紫外灭活处理。

(2)免疫动物

采用新西兰大白兔，取1ml经紫外灭活处理后的致病性副溶血性弧菌菌体抗原与弗氏完全佐剂充分混合乳化后，通过颈背部皮下注射进行首次免疫，2周后取菌体抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化进行第2次免疫，每次间隔2周加强免疫。

(3)测定血清效价

第3次免疫之后，耳静脉取血，间接elisa测定血清效价，效价达到1:40000以上，终止免疫，10天后，取血即可。

(4)纯化抗血清

抗血清用0.45μm滤膜过滤，取1mlproteina介质到p-10柱中，用5mlpbs平衡，流尽溶液，血清过proteina柱，收集流出液，流尽溶液，用5mlpbs平衡，流尽溶液，加入4ml洗脱液，同时收集洗脱液，1ml每管收集，每管加入90μltris溶液中和，待洗脱液流尽后，加入5mlpbs，流尽，再次上样纯化，收集的洗脱液，检测紫外吸收(a280nm)，od值大于1.0的所有管合并，用pbs透析过夜，纯化后的抗体进行电泳检测，并通过紫外吸收(a280nm)确定抗体浓度，得到致病性副溶血性弧菌多克隆抗体。

(5)抗体特异性检测

取各菌株培养液500μl，12000rpm离心1min，去除上清，加入500μlpbs重悬菌体。用各菌悬液包被96孔酶标板，100μl/孔，每种菌株4个平行。以1:10000稀释的纯化多抗为一抗，羊抗兔抗体为二抗，检测致病性副溶血性弧菌多克隆抗体的特异性。

二、免疫磁珠的制备：

羧基磁珠偶联致病性副溶血性弧菌多克隆抗体的具体操作如下：

取1ml磁珠于2ml无菌离心管中，用25mm的mes(ph5)洗涤磁珠3次。再加入500μledc(50mg/ml)和500μlnhs(50mg/ml)，混合均匀，室温反应30min。将200μl13.43mg/ml的多克隆抗体加入到经过活化的磁珠，再加入mes补足到总体积为1ml，混合均匀，室温下培养3h。加入1ml封闭液(含有1％bsa的pbs)，封闭未反应位点30min。用1mlpbs洗涤磁珠3次。加入保存液(含0.02％nan3，0.1％bsa的pbs)1.5ml，配置成终浓度为15mg/ml的免疫磁珠溶液，4℃冰箱保存备用。

三、应用pathatrix系统(英国matrix公司)对致病性副溶血性弧菌进行富集捕获，步骤如下：

1、取免疫磁珠溶液100μl于2ml无菌离心管中，置于磁力架上，静置2min，待磁珠完全吸附在带磁场的一侧后，去除上清液，再加入同样体积的pbs，混合均匀，于垂直混合仪上洗涤5min。

2、取tris-hcl(ph6.4)50ml置于一次性样品管中，加入1ml试验菌液和100μl磁珠，在洗脱管中加入35ml的pbst(pbs+0.05％tween-20)，将一次性套装用无菌管路连接。

3、打开pathatrix仪器，待显示“pathatrix”时，即可取下反应槽，将已安装好的一次性套装放置于反应槽中，按下红色按钮，15min后，待红绿灯交替显示时，再按一次红色按钮，约1min后完成ims。

4、取下整套装置，取出洗脱管，置于磁力管架上，待磁珠被吸附在一侧时，去除上清液，加入100μlpbs，重悬磁珠。

四、模板dna制备

取免疫磁珠和菌体细胞复合物100μl，12000rpm，离心2min，去除上清液。加入ddh2o50μl，混合均匀，95℃，温浴10min，迅速转至冰上放置2min，12000rpm，离心2min，取上清液备用。

五、lamp反应

(1)配置lamp反应缓冲液：100mm的kcl溶液200μl，100mm的(nh4)2so4溶液200μl，100mmph8.8的tris碱溶液400μl，1m的mgso4溶液18μl，加入0.2％的tween-20，再加入180μlddh2o，混合均匀，备用。

(2)配置lamp反应体系：反应缓冲液，12.5μl；10mmdntp，1μl；20μmf3/b3，0.5μl；20μmfip/bip，2μl；20μmlf/lb，1μl；8000u/mlbstdna聚合酶，1μl；dna模板，2μl。上述反应体系不足25μl的用ddh2o补足

(3)设定反应温度为63℃，60min；80℃，5min。

六、lamp反应产物的检测

(1)sybrgreeni后染色法：

反应结束后，开盖加入2μl经过1000倍稀释的sybrgreeni染色液，混合均匀，静置1min观察颜色变化。

(2)电泳检测：

配置2％琼脂糖凝胶，取lamp反应液加入loadingbuffer进行上样，选择100v电压，电泳30min，eb染色10min，照胶。电泳结果呈现梯状条带即为致病性副溶血性弧菌阳性，无条带则为致病性副溶血性弧菌阴性。

实施例2特异性检测

应用实施例1的方法对13株副溶血性弧菌、1株霍乱弧菌，1株创伤弧菌，1株大肠杆菌、1株肠炎沙门氏菌、1株单增李斯特氏菌、1株铜绿假胞单菌，1株金黄色葡萄球菌、1株耶尔森氏菌，采用ims-pathatrix-lamp方法检测致病性副溶血性弧菌。结果显示6株致病性副溶血性弧菌均出现特异性扩增条带，7株非致病性副溶血性弧菌同8株非副溶血性弧菌均未出现特异性扩增条带，表明该方法特异性强。

实施例3灵敏度检测

(1)纯菌液中致病性副溶血性弧菌灵敏度检测

将过夜培养的致病性副溶血性弧菌取1ml至灭菌1.5ml离心管中，用0.85％的生理盐水进行梯度稀释，再取1ml各稀释度(10^-1-10^-8)菌液加入到50ml离心管中，加入tris-hcl(ph6.4)50ml，加入免疫磁珠100μl，洗脱管中加入35mlpbs(0.05％tween-20)，装好反应套装，进行免疫富集。反应结束后，采用lamp方法检测，观察反应液颜色变化及电泳检测结果。检测结果表明，ims-pathatrix-lamp检测纯菌液中致病性副溶血性弧菌灵敏度为2.08logcfu/ml。

(2)人工污染虾样中致病性副溶血性弧菌的灵敏度检测

将过夜培养的致病性副溶血性弧菌取1ml至灭菌1.5ml离心管中，用0.85％的生理盐水进行梯度稀释，分别取1ml各稀释度(10^-1-10^-8)菌液接种于煮沸的虾体表面。称取25g虾样加入225ml的apw中，低速拍打90s。取均质液25ml加入到50ml离心管中，4000rpm离心5min，去除上清液，加入tris-hcl(ph6.4)50ml，加入免疫磁珠100μl，洗脱管中加入35mlpbs(0.05％tween-20)，装好反应套装，进行免疫富集。反应结束后，采用lamp方法检测，观察颜色变化及电泳检测结果。检测结果表明，ims-pathatrix-lamp检测人工污染虾样中的致病性副溶血性弧菌灵敏度为2.97logcfu/ml

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>上海海洋大学

<120>一种高通量富集和检测致病性副溶血性弧菌的方法

<130>/

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtacgaagatgtttatggtcaat23

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cttcatcttcaccaacaaagt21

<210>3

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgctgccattgtatagtctttatcattttcagtattcacaacgtcaggta50

<210>4

<211>51

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tgtctggctataagagcggtcattttgctacagaattataggaatgttgaa51

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cacagtcatgtaggatgtcaacca24

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tctgctgtgttcgtaaaatcagatc25