一种用于RCA扩增产物的快速银染色方法与流程

本发明属于生物化学、分子生物学、核酸扩增的检测方法领域，具体涉及一种用于rca肉眼检测的管底固定凝胶的快速银染色方法。

背景技术：

核酸检测技术是一种应用十分广泛的分子检测手段。用于物种鉴定，亲子鉴定，科学研究等众多领域。核酸扩增技术即是一种十分常用的核酸检测技术，通过对特定核酸序列的扩增实现目的核酸的富集和信号的放大。

与pcr的变温核酸扩增技术不同，滚环扩增（rollingcircleamplification,rca）是一种核酸恒温扩增技术，因此其扩增不需要变温设备，更加方便快捷。rca以单链dna为模板，在链置换dna聚合酶的作用下，延伸引物3’末端，形成与模板dna序列互补的长链dna单链产物。该扩增原理简单，操作方便，检测灵敏度高。

rca扩增产物的检测一般采用荧光检测，需要电泳仪或酶标仪等检测设备。不依赖仪器设备的肉眼检测方法可以使人们更方便快捷的获知结果，尤其在不具有仪器设备的地区有更多的需求。现有的肉眼检测往往需要偶联核酶显色或纳米金颗粒等进行显色，这增加了rca模板设计和技术的复杂性和原料成本。一种普适性强的，设计和操作均更为简便的rca肉眼检测方法将会给rca检测带来很大的便利。

电泳技术虽然作为rca的常用检测方法之一，但需要配胶，上样，电泳，染色，操作繁琐，耗时费力。而且rca产物由于分子量巨大，一般位于上样孔附近，电泳的分离效果有限，因此，开发不依赖电泳的rca产物的直接胶染色，将节省电泳的操作和时间，有利于其快速检测的实现。

核酸的电泳凝胶的银染色是一种高灵敏的肉眼凝胶显色法。可以用于凝胶中的核酸分子的肉眼检测。然而该方法不仅需要长时间的电泳操作，而且电泳后凝胶染色时，需要将凝胶置于较大的染色容器中操作，各种银染色试剂的使用量较大，而且换液时需防止凝胶的损坏，其换液操作十分不便。因此，不依赖电泳的固定凝胶的小体积染色操作将十分方便快捷。

技术实现要素：

本发明针对上述现存的技术问题提出一种用于rca肉眼检测的管底固定凝胶的快速银染色方法，通过该方法可以实现rca的简便、快捷、肉眼、定性或半定量的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于rca扩增产物的快速银染色方法，该方法包括如下步骤：进行rca扩增反应，反应结束后，将待检测rca扩增产物和凝胶加入反应管内，待凝胶在管底凝固后，依次向管中加入加入和移除各种银染色的固定液，染色液，清洗液和显色液，经孵育后，获得管底凝胶中rca产物的银染色的显色结果。

所述的待检测的rca扩增产物是任何基于rca扩增的技术或rca衍生技术所扩增产生的单链或双链核酸产物。

所述的凝胶是能够用于核酸鉴定的电泳固相支持凝胶，优选聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。

所述的管是化学反应的各种反应管，优选ep管，塑料或玻璃试管。

所述的银染色方法能够进行核酸染色的银染法，优选酸性银染法。

所述的在管中加入或移出试剂的操作能够使用微量移液器或直接倾倒的方法进行。

申请人通过研究发现，rca产物检测对电泳分离的要求不高，非电泳的直接凝胶银染色检测rca产物较传统电泳法有很大优势，而且较其他的rca检测技术也具有一定优势。在此，申请人提出了管底固定凝胶的银染方法，用于rca的分析，实现了rca的非电泳，快速，方便，肉眼的检测。

与传统的核酸凝胶电泳的rca检测法相比，管底固定凝胶银染色方法，本发明具有如下优点：

1、操作方便，可以直接使用微量加样器进行银染色操作，消耗银染色试剂量少；

2、步骤简便，省去了电泳凝胶制备，以及电泳的操作步骤；

3、方便的实现肉眼可视化检测；

4、不需电泳仪、脱色摇床，以及酶标仪等仪器设备。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2为本发明利用普通rca半定量测定不同量dna模板的实验结果图。

图3是本发明利用repressor-rca定性鉴别半乳糖和其他5种单糖的实验结果图。

图4为本发明检测不同扩增时间rca扩增产物的实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细描述本发明。

实施例1

本发明利用普通rca半定量测定不同量dna模板，具体步骤如下：

（1）普通rca环形模板的设计与制备：

设计普通rca的模板序列，配制10μl的连接反应体系缓冲液（50mmtrisph8.0,10mmmgcl2,5mmdtt和0.1mmatp），加入10pmol线性单链模板dna、10pmol线性单链引物dna和175ut4dna连接酶，16℃孵育1小时。

（2）rca反应：

配制100μl的聚合反应体系缓冲液（50mmtrisph7.5、10mmmgcl2、10mm(nh4)2so4、4mmdtt、3uphi29dna聚合酶、1.5~100fmol的环形模板），并进行滚环扩增反应。

（3）管底胶银染色检测rca产物：

①制备管底胶：在四个2mlep管底加入10µl不同模板量的rca扩增产物（加入量分别为100fmol，25fmol，6.25fmol，1.5fmol）、3µl45%acr、1µl10%aps、0.3µltemed，混匀，室温静置5分钟；

②固定：移液器加入固定液（10%乙醇，0.5%乙酸）1ml，室温静置5分钟，移除，共5次；

③染色：加入染色液（0.2%硝酸银，10%乙醇，0.5%乙酸）100µl，室温静置5分钟，移除；

④洗涤：加入洗涤液（10%乙醇）1ml，室温静置5分钟，移除；

⑤显色：加入显色液（2%氢氧化钠，0.37%甲醛）100µl，室温静置3分钟，移除。

结果如图2所示，100fmol，25fmol，6.25fmol，1.5fmol模板量的rca扩增产物，其管底凝胶经染色后，呈现颜色明显的由深至浅的变化。最低检测限可达1fmol。

实施例2

本发明利用repressor-rca定性鉴别半乳糖和其他5种单糖，的具体步骤如下：

（1）repressor-rca环形模板的设计与制备：

设计repressor-rca的模板序列，配制10μl的连接反应体系缓冲液（50mmtrisph8.0,10mmmgcl2,5mmdtt和0.1mmatp），加入10pmol线性单链模板dna、10pmol线性单链引物dna和175ut4dna连接酶，16℃孵育1小时。

（2）rca反应：

配制100μl的聚合反应体系缓冲液（50mmtrisph7.5、10mmmgcl2、10mm(nh4)2so4、4mmdtt、3uphi29dna聚合酶、0.5pmol连接反应产物和半乳糖阻遏蛋白0.12μm），分别加入一种糖类进行滚环扩增反应。糖类的终浓度分别是100μm（半乳糖）和10mm（其他糖类：果糖、岩藻糖、葡萄糖、核糖、脱氧核糖）。

（3）管底胶银染色检测rca产物：

①制备管底胶：在不同的2mlep管底分别加入10µlrca扩增产物、3µl45%acr、1µl10%aps、0.3µltemed，混匀，室温静置5分钟；

②固定：移液器加入固定液（10%乙醇，0.5%乙酸）1ml，室温静置5分钟，移除，共5次；

③染色：加入染色液（0.2%硝酸银，10%乙醇，0.5%乙酸）100µl，室温静置5分钟，移除；

④洗涤：加入洗涤液（10%乙醇）1ml，室温静置5分钟，移除；

⑤显色：加入显色液（2%氢氧化钠，0.37%甲醛）100µl，室温静置3分钟，移除。

结果如图3所示，repressor-rca的扩增产物，经管底凝胶染色后，可见含有半乳糖的管底凝胶显色明显，而含有其他五种糖类的管底凝胶，没有明显的显色。

实施例3本发明检测不同反应时间的rca产物

（1）普通rca环形模板的设计与制备：

设计普通rca的模板序列，配制10μl的连接反应体系缓冲液（50mmtrisph8.0,10mmmgcl2,5mmdtt和0.1mmatp），加入10pmol线性单链模板dna、10pmol线性单链引物dna和175ut4dna连接酶，16℃孵育1小时。

（2）rca反应：

配制100μl的聚合反应体系缓冲液（50mmtrisph7.5、10mmmgcl2、10mm(nh4)2so4、4mmdtt、3uphi29dna聚合酶、100fmol的环形模板），并进行不同时间的滚环扩增反应。

（3）管底胶银染色检测rca产物：

①制备管底胶：在塑料管底分别加入10µlrca扩增产物、3µl40%acr、1µl10%aps、0.3µltemed，混匀，室温静置5分钟；

②固定：移液器加入固定液（10%乙醇，0.5%乙酸）1ml，室温静置5分钟，移除，共5次；

③染色：加入染色液（0.2%硝酸银，10%乙醇，0.5%乙酸）100µl，室温静置5分钟，移除；

④洗涤：加入洗涤液（10%乙醇）1ml，室温静置5分钟，移除；

⑤显色：加入显色液（2%氢氧化钠，0.37%甲醛）100µl，室温静置3分钟，移除。

结果如图4所示，使用塑料管和40%凝胶，进行0-30分钟不同扩增时间的rca扩增产物显色深浅不同，扩增时间越长，rca扩增产物的管底凝胶显色越深。