淋巴瘤组织石蜡包埋切片荧光原位杂交检测的预处理方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种淋巴瘤组织石蜡包埋切片荧光原位杂交检测的预处理方法。

背景技术：

石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法，石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。而荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，fish)是pinkel等1986年建立的一个分子生物学和细胞遗传学相结合的新技术，fish检测的原理是根据dna碱基对的互补性，将标记了荧光的单链dna探针与样本的dna杂交后,通过荧光显微镜观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体及基因的情况，从而检测出细胞、组织样本中的染色体或基因异常。fish技术具有操作简便、检测快速、易于观察、重复性好、敏感性和特异性高等特点，目前，该技术已广泛应用于遗传性疾病、产前诊断、肿瘤学，特别是淋巴瘤分型和诊断等领域。

近年来，将石蜡切片技术与荧光原位杂交技术结合应用于生物技术中得到了很大发展，尤其是在检测淋巴瘤基因异常上，大大提高了淋巴瘤诊断的精确性。以石蜡包埋组织切片进行fish检测时，石蜡切片的预处理是fish检测技术的重要环节，为此，本发明人探索了一种淋巴瘤组织石蜡包埋切片荧光原位杂交检测的预处理方法。

技术实现要素：

本发明中石蜡包埋切片预处理方法的淋巴瘤组织切片的桔红色和绿色荧光信号较强，且非常清晰，显著提高fish检测的质量，并能缩短后续操作步骤中胃蛋白酶消化时间，缩短检测时间。

本发明提供了一种淋巴瘤组织石蜡包埋切片荧光原位杂交检测的预处理方法，包括以下步骤：

s1：将淋巴瘤组织蜡块切片，切片厚度为1-5μm，65℃烘烤3-20h；然后依次经二甲苯、无水乙醇、85％的乙醇溶液、70％的乙醇溶液、去离子水浸泡洗脱，得到预处理切片，备用；

s2：将s1中预处理切片放入高压锅中，倒入柠檬酸盐缓冲液完全浸没预处理切片，加热，高压锅气阀门喷气后持续5min，然后将高压锅外壁冲水冷却，取出切片置于ph为7.0的2×ssc溶液中浸泡3-8min，得到高压处理切片；

s3：将s2中高压处理切片浸泡在胃蛋白酶工作液中15-25min，再用2×ssc溶液漂洗；然后将切片依次浸泡在浓度分别为70％、85％、100％的乙醇溶液中脱水，浸泡时间均为1-5min；干燥备用，得到酶处理切片；

s4：将探针混合物滴加于s3中的酶处理切片上，启动变性杂交程序，得到杂交处理切片；

s5：避光s4中杂交处理切片，放入65℃的0.3％np40/0.4×ssc溶液中1-3min并振荡1-3s，然后放入室温的0.1％np40/2×ssc溶液中1min并振荡1-3s，再将切片浸泡于70％乙醇中1-5min，自然干燥后滴加10-20μldapi荧光染料，避光放置10-20min，荧光显微镜下观察结果。

优选的，s1中洗脱的具体步骤为二甲苯室温浸泡洗脱2次，每次持续10min；然后用无水乙醇浸泡洗脱2次，每次持续5min；再分别用浓度为85％、70％的乙醇溶液依次浸泡淋巴瘤组织切片，均持续3min；用去离子水浸泡3min，得到预处理切片。

优选的，所述s2中柠檬酸盐缓冲液为0.01mol/l、ph为6.0的柠檬酸钠溶液。

优选的，高压锅气阀门喷气时压力为90kpa，温度为120℃。

优选的，所述胃蛋白酶工作液是20mg/ml的胃蛋白酶储存液和0.01mol/l的hcl溶液按照1:2000的体积比例混合，预热至37℃后得到的。

优选的，s4中，变性杂交程在原位杂交仪上进行，且杂交程序为83℃变性5min，42℃杂交16h。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)应用本发明中石蜡包埋切片预处理方法的淋巴瘤组织切片的桔红色和绿色荧光信号较强，且非常清晰，显著提高fish检测的质量，并能缩短后续操作步骤中胃蛋白酶消化时间，缩短检测时间；

(2)组织中的核酸可与细胞内的蛋白质结合以复合体形式存在于细胞质或细胞核中，固定过程中固定液的交联作用使胞质或胞核内的各种生物大分子形成网络，影响探针的穿透力，本发明使用柠檬酸盐缓冲液结合高温高压处理能更有效的消除固定液的交联作用，增强组织的通透性和核酸探针的穿透力，明显增强桔红色和绿色荧光信号的强度；

(3)本发明对于各种肿瘤组织的石蜡包埋切片的fish检测和国内外各公司生产的fish探针均适用。

附图说明

图1为实施例1中实验组淋巴瘤组织切片的桔红色荧光信号示意图；

图2为实施例1中实验组淋巴瘤组织切片的绿色荧光信号示意图；

图3为实施例1中对照组淋巴瘤组织切片的桔红色荧光信号示意图；

图4为实施例1中对照组淋巴瘤组织切片的绿色荧光信号示意图。

具体实施方式

下面结合附图1-4对本发明的几个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

一种淋巴瘤组织石蜡包埋切片荧光原位杂交检测的预处理方法，包括以下步骤：

s1：将淋巴瘤组织蜡块切片，切片厚度为3μm，将淋巴瘤组织切片置于载玻片上，然后65℃烘烤3h，然后依次经二甲苯、无水乙醇、体积浓度为85％的乙醇溶液、体积浓度为70％的乙醇溶液、去离子水浸泡洗脱，洗脱的具体步骤为二甲苯室温浸泡洗脱2次，每次持续10min；然后用无水乙醇浸泡洗脱2次，每次持续5min；再分别用浓度为85％、70％的乙醇溶液依次浸泡淋巴瘤组织切片，均持续3min；用去离子水浸泡3min，得到预处理切片，备用；

s2：将s1中预处理切片放入高压锅中，倒入0.01mol/l，ph值为6.0的柠檬酸钠缓冲液(购于北京中杉金桥生物技术有限公司)完全浸没预处理切片，加热，高压锅气阀门喷气后压力为90kpa，温度为120℃，持续5min，然后将高压锅外壁冲水冷却，取出切片置于ph为7.0的2×ssc溶液中浸泡5min，得到高压处理切片；

2×ssc溶液制备：称取氯化钠88g、柠檬酸钠44g，加去离子水400ml，充分溶解，用12mol/l的hcl调节ph值至5.3，用去离子水定容至500ml成为20×ssc溶液；取100ml20×ssc溶液，加去离子水800ml，用10mol/l的naoh调节ph值至7.0，用去离子水定容至1000ml，即为ph为7.0的2×ssc溶液；

s3：胃蛋白酶工作液是20mg/ml的胃蛋白酶储存液和0.01mol/l的hcl溶液按照1:2000的体积比例混合，预热至37℃后得到，将s2中高压处理切片浸泡在胃蛋白酶工作液中20min，再用2×ssc溶液漂洗2次，每次5min，然后将切片依次浸泡在浓度分别为70％、85％、100％的乙醇溶液中脱水，浸泡时间均为3min，自然干燥备用，得到酶处理切片；

s4：避光将10μl探针混合物(2μl探针、7μl杂交缓冲液和1μl去离子水混匀，购于北京金菩嘉医疗科技有限公司)滴加于s3中的酶处理切片上，加盖玻片并用橡皮胶封片，然后将切片置于原位杂交仪上，启动变性杂交程序，杂交程序为83℃变性5min，42℃杂交16h，得到杂交处理切片；

s5：避光s4中杂交处理切片，放入65℃的0.3％np40/0.4×ssc溶液中2min并振荡1s，然后放入室温的0.1％np40/2×ssc溶液中1min并振荡1s，再将切片浸泡于70％乙醇中3min，自然干燥后滴加15μldapi荧光染料，盖上盖玻片，避光放置10min，荧光显微镜下观察结果。

为表明本发明预处理方法的fish检测效果，共收集20例淋巴瘤组织蜡块，平均分为实验组和对照组两组，且每组每例淋巴瘤组织蜡块切片2片，其中实验组淋巴瘤组织切片应用实施例1中的方法预处理，对照组淋巴瘤组织切片的预处理方法与实施例1中相同，区别在于s2不同，对照组中s2为：将s1中预处理切片置于90℃去离子水中处理20min，室温下2×ssc溶液中漂洗两次，每次5min。代表性的一组荧光显微镜下观察结果见图1-4，从图中可知使用90℃去离子水与使用柠檬酸盐缓冲液高温处理淋巴瘤石蜡切片的实验结果进行比较，发现使用柠檬酸盐缓冲液结合高温高压处理淋巴瘤石蜡切片的预处理方法在消除固定液的交联作用、增强组织的通透性方面有较明显的优势，淋巴瘤石蜡切片的桔红色及绿色荧光信号强度均显著增强。

实施例2

一种淋巴瘤组织石蜡包埋切片荧光原位杂交检测的预处理方法，包括以下步骤：

s1：将淋巴瘤组织蜡块切片，切片厚度为1μm，将淋巴瘤组织切片置于载玻片上，然后65℃烘烤20h，然后依次经二甲苯、无水乙醇、体积浓度为85％的乙醇溶液、体积浓度为70％的乙醇溶液、去离子水浸泡洗脱，洗脱的具体步骤为二甲苯室温浸泡洗脱2次，每次持续10min；然后用无水乙醇浸泡洗脱2次，每次持续5min；再分别用浓度为85％、70％的乙醇溶液依次浸泡淋巴瘤组织切片，均持续3min；用去离子水浸泡3min，得到预处理切片，备用；

s2：将s1中预处理切片放入高压锅中，倒入0.01mol/l，ph值为6.0的柠檬酸钠缓冲液完全浸没预处理切片，加热，高压锅气阀门喷气后压力为90kpa，温度为120℃，持续5min，然后将高压锅外壁冲水冷却，取出切片置于ph为7.0的2×ssc溶液中浸泡3min，得到高压处理切片；

s3：胃蛋白酶工作液是20mg/ml的胃蛋白酶储存液和0.01mol/l的hcl溶液按照1:2000的体积比例混合，预热至37℃后得到，将s2中高压处理切片浸泡在胃蛋白酶工作液中25min，再用2×ssc溶液漂洗2次，每次5min，然后将淋巴瘤组织切片依次浸泡在浓度分别为70％、85％、100％的乙醇溶液中脱水，浸泡时间均为1min，自然干燥备用，得到酶处理切片；

s4：避光将10μl探针混合物滴加于s3中的酶处理切片上，加盖玻片并用橡皮胶封片，然后将切片置于原位杂交仪上，启动变性杂交程序，杂交程序为83℃变性5min，42℃杂交16h，得到杂交处理切片；

s5：避光s4中杂交处理切片，放入65℃的0.3％np40/0.4×ssc溶液中2min并振荡3s，然后放入室温的0.1％np40/2×ssc溶液中1min并振荡3s，再将淋巴瘤组织切片浸泡于70％乙醇中1min，自然干燥后滴加10μldapi荧光染料，盖上盖玻片，避光放置20min，荧光显微镜下观察结果。

实施例2中共选取20例淋巴瘤组织蜡块，且每例蜡块切片2片，荧光显微镜下每个切片的桔红色及绿色荧光信号强度均很强，结果与实施例1相同。

实施例3

一种淋巴瘤组织石蜡包埋切片荧光原位杂交检测的预处理方法，包括以下步骤：

s1：将淋巴瘤组织蜡块切片，切片厚度为5μm，将淋巴瘤组织切片置于载玻片上，然后65℃烘烤10h，然后依次经二甲苯、无水乙醇、体积浓度为85％的乙醇溶液、体积浓度为70％的乙醇溶液、去离子水浸泡洗脱，洗脱的具体步骤为二甲苯室温浸泡洗脱2次，每次持续10min；然后用无水乙醇浸泡洗脱2次，每次持续5min；再分别用浓度为85％、70％的乙醇溶液依次浸泡淋巴瘤组织切片，均持续3min；用去离子水浸泡3min，得到预处理切片，备用；

s2：将s1中预处理切片放入高压锅中，倒入0.01mol/l，ph值为6.0的柠檬酸钠缓冲液完全浸没预处理切片，加热，高压锅气阀门喷气后压力为90kpa，温度为120℃，持续5min，然后将高压锅外壁冲水冷却，取出切片置于ph为7.0的2×ssc溶液中浸泡8min，得到高压处理切片；

s3：胃蛋白酶工作液是20mg/ml的胃蛋白酶储存液和0.01mol/l的hcl溶液按照1:2000的体积比例混合，预热至37℃后得到，将s2中高压处理切片浸泡在胃蛋白酶工作液中15min，再用2×ssc溶液漂洗2次，每次5min，然后将切片依次浸泡在浓度分别为70％、85％、100％的乙醇溶液中脱水，浸泡时间均为5min，自然干燥备用，得到酶处理切片；

s4：避光将10μl探针混合物滴加于s3中的得到酶处理切片上，加盖玻片并用橡皮胶封片，然后将切片置于原位杂交仪上，启动变性杂交程序，杂交程序为83℃变性5min，42℃杂交16h，得到杂交处理切片；

s5：避光s4中杂交处理切片，放入65℃的0.3％np40/0.4×ssc溶液中2min并振荡2s，然后放入室温的0.1％np40/2×ssc溶液中1min并振荡2s，再将淋巴瘤组织切片浸泡于70％乙醇中5min，自然干燥后滴加20μldapi荧光染料，盖上盖玻片，避光放置15min，荧光显微镜下观察结果。

实施例3中共选取20例淋巴瘤组织蜡块，且每例蜡块切片2片，荧光显微镜下每个切片的桔红色及绿色荧光信号强度均很强，结果与实施例1相同。

需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。