专利名称：Rna的分析方法
技术领域：
本发明涉及从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法。
背景技术：
近年来，对在医院、研究机构等保存有大量样本的、以福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织为代表那样的、被固定液固定了的组织、细胞的基因的分析技术的期待大幅提高。特别是对于FFPE组织，由于积累了过去的大量病患数据，因而如果 确立能够从FFPE组织提取基因、分析它们的表达的技术，则能够进行使用长期保存后的组织的可追溯研究，可以对将来的病患的治疗和/或预防做出巨大贡献。然而，认为从FFPE等固定组织、固定细胞中提取出的RNA在一般的固定条件、保管条件下进行分解、片段化，因此难以进行基因表达分析。另外，由于作为固定液最常用的甲醛(福尔马林)，有时RNA-RNA间、RNA-蛋白质间发生交联、和/或甲醛被添加/修饰到RNA上，RNA在这样的状态下难以进行酶反应和/或化学反应，基因表达分析变得困难。因此，要求由进行了分解、片段化的RNA样品、和/或被交联、添加/修饰了的RNA样品进行基因表达分析的技术。另外，在进行这样的RNA样品的基因表达分析时，在分析之前确认RNA样品的分解、片段化、或者交联和/或添加/修饰的程度来判断品质、确认可否分析，对于进行正确的基因表达分析以及miRNA表达分析是非常有用的，要求能够进行这些确认的技术。专利文献I 4中公开了关于扩增分解了的RNA来进行基因表达分析的方法的技术。专利文献I提供与扩增靶多核苷酸、产生其大量拷贝相关的方法、组合物和试剂盒。I次扩增反应中的HiRNA的扩增倍数标准达50 100或250倍，或者为500 1000倍或500 2000倍以上，从不足纳克量的总RNA获得尽可能多的扩增RNA。然而，如果使用这样从少量的RNA尽可能多地扩增来分析的方法，则基因的每个扩增倍率产生偏差的所谓扩增偏倚变大，因而可以说不能正确地分析基因的表达量。专利文献2涉及为了全基因表达谱分析而使用例如保管的固定化石蜡包埋组织材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或极度片段化的RNA试样，也能够完全扩增的试样的调制方法。然而，该方法包含将被片段化的RNA进行多聚腺苷酸化的工序，认为该工序中的反应的偏差作为结果可能严重影响基因表达谱。另外在专利文献2中，公开了新的线性RNA扩增法。通过合成5’末端具有锚定序列、且3’末端具有RNA聚合酶启动子序列的双链cRNA，由该cDNA依赖上述RNA聚合酶启动子序列合成cRNA，由该cRNA通过引发上述锚定序列而再次合成cDNA的方法，来扩增从利用激光捕获显微切割、细胞分选仪获得的少量的细胞和/或组织中得到的微量的RNA，从而抑制作为现有的扩增法的问题的、在每次重复cDNA合成-cRNA合成循环时产生的cDNA和cRNA上的mRNA5’相当区的缺失。专利文献I、专利文献2均作为无扩增偏倚的方法记载，认为每I个循环的偏倚与以往相比较小，但由于着眼于由少量的RNA尽可能多地扩增，因而作为扩增倍率相当大。因此，相应地偏倚积累，不可否认结果产生大的扩增偏倚。
专利文献3涉及为了全基因表达谱分析而使用例如保管的固定化石蜡包埋组织材料等片段化RNA等的方法，提供即使是非常小的、或极度片段化的RNA试样也能够完全扩增的试样的调制方法。然而，该方法包含将被片段化的RNA进行多聚腺苷酸化的工序，认为该工序中的反应的偏差作为结果可能严重影响基因表达谱。
专利文献4公开了包含例如分解度等核酸样品中的核酸的品质测定方法的、分解核酸样品中的靶标的扩增用组合物和方法，以及用于从分解RNA样品制成基因表达谱的方法。以来源于同一基因的不同尺寸的扩增子(扩增产物)的扩增效率为标准，随着样品分解，尺寸较大的扩增子的扩增效率降低，由此来评价品质。本方法对于十几种至二十几种基因分别进行多个尺寸的PCR。认为在RNA分解进行的情况下，PCR的探针尺寸越大则越不被扩增，因而可以一定程度确认分解度，但需要对每个RNA样品PCR扩增总共数十种基因，因此认为本方式难以实际进行。专利文献5公开了将以不分解的状态下长链级分所含的RNA的碱基序列为基础设计的分解指标核酸探针装载于核酸阵列，使从总RNA分级出短链而得的RNA样品对该核酸阵列杂交，通过分解指标核酸探针的信号的有无来测定RNA样品的分解度的方法，以及涉及RNA的分解度测定用核酸阵列的技术。然而，认为该核酸阵列限于微小RNA(miRNA)等短链RNA，难以适用于基因表达分析。而且，在从FFPE等的固定组织和/或固定细胞提取RNA的情况下，与从细胞和/或冻结组织提取情况不同，常常不能得到大量的RNA，在这样的状况下，仅用于RNA样品的品质确认就要使用几yg 几十y g这样大量的样品进行实验是不现实的，从成本方面也决不能说是优选的方法。专利文献6中有关于测定核酸的片段化水平的方法的记载。该专利文献的申请人销售分别测定RNA样品所含的2种核糖体RNA(18S、28S)的量，由28S/18S之比来判定能否分析的试剂盒。据说当RNA分解时，首先28S分解，接着18S分解，在该试剂盒中，如果28S/18S为O. I以下，则判定为RNA的品质差。然而，从被固定液固定了的组织、细胞中提取的RNA —般在固定时RNA分解，进而由于固定组织、细胞一般常温保管，随着经年RNA进一步分解。因此，从例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织提取的RNA经常检测不到上述2种核糖体RNA，在以上述基准判定RNA样品的品质的情况下，大半样品被认为不能分析。因此，在使用如上所述的长期保存的固定组织、固定细胞进行可追溯研究时，使用该试剂盒是极为困难的。专利文献7是通过加热处理等使包含分解的mRNA的保管组织中的、与RISC(RNA诱导型沉默复合体)结合而未被分解的miRNA游离，并通过PCR扩增来检测的RNA的谱分析方法。由于在从RISC使miRNA游离时，在95°C这样的高温下处理，因此不能否定由此发生分解的可能性，也谈不上涉及确认RNA的品质的方法。此夕卜，在使用毛细管电泳系统(例如，Agilent Technologies公司制“Bioanalyzer (生物分析仪)”)的情况下，作为RNA分解的指标,计算出作为由AgilentTechnologies公司所开发的测定基准的RIN(RNA Integrity Number, RNA完整性指数)。RIN是以电泳的RNA样品全体的电泳图谱为基础算出的，其值为O 10的范围(非专利文献I)。Agilent Technologies公司的Bioanalyzer成为评价核酸的品质时一般使用的装置，在使用该装置时，RIN成为显示RNA的品质的一般指标。然而,用Bioanalyzer分析从固定组织、固定细胞提取出的RNA时，即使对于其电泳图谱明显不同、分解行为各异的RNA，RIN的值也在2 3之间基本不变，因此RIN可能未必能够反应实际的RNA的状态。而且，实际情况是，缺乏判断从被固定液固定了的各种组织、细胞提取出的RNA是否是能够供给分析的样本的方法。现有技术文献专利文献专利文献I:特表2006-520603号公报专利文献2:特开2005-224172号公报专利文献3:特表2007-515964号公报
专利文献4:特表2008-541699号公报专利文献5:特开2008-35779号公报专利文献6:特开2008-43332号公报专利文献7:特表2009-501531号公报非专利文献非专利文献I:Schroeder A, Mueller O, Stocker S, Salowsky R, LeiberM，Gassmann M，Lightfoot S，Menzel Wj Granzow Mj Ragg T:The RIN:an RNA integritynumber for assigning integrity values to RNA measurements;BMC Molecular Biology7:3(2006)
发明内容
发明所要解决的课题在现有技术中，分析从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA时，没有简便且高准确度地判断所提取的RNA是否适于分析的方法，知晓分析所得的数据的有效性是困难的。用于课题的方法鉴于上述课题，本发明者们进行了深入研究，结果发现，在进行从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的基因表达分析时，在分析前对RNA进行电泳，根据电泳图谱来判断是否适于分析，对于判断为适于分析的RNA进行分析，可获得符合本来的RNA的存在量的有效性高的数据，而且可获得再现性高的数据，从而完成了本发明。另外发现，如果在扩增该RNA时，使其扩增倍率为原来的2 20倍，则能够抑制扩增所产生的偏倚，获得符合本来的RNA的存在量的有效性高的数据，而且发现数据的再现性高，从而完成了本发明。gp，本发明由以下⑴ (7)构成。(I)从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法，该RNA的分析方法具有以下步骤当设对该RNA总重量的电泳中的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A(% )、对该RNA总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B(%)时，判定该RNA满足下式，式B/A彡 I。(2)根据⑴所述的RNA的分析方法，进一步具有以下步骤判定上述比率A(% )为25%以上。
(3)根据(I)或⑵所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA分析以扩增倍率2 20倍扩增所得的扩增产物。(4)根据⑴或⑵所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA通过非扩增来进行分析。(5)根据(4)所述的RNA的分析方法，上述RNA是miRNA。(6)根据(I) (5)的任一项所述的RNA的分析方法，上述固定液包含甲醛或低聚甲醛。(7)根据⑴ (6)的任一项所述的RNA的分析方法，对上述被固定液固定了的组 织或细胞进行了石蜡包埋或OCT复合物包埋。发明的效果通过本发明的RNA的分析方法，对于从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA，可以进行正确地反映本来的基因的存在量的分析，特别是在微阵列分析中可获得良好的效果。另外，通过本发明的RNA的分析方法，可以在分析前判定从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA是否适于分析，可以将浪费使用试剂等防患于未然。
图I显示当设通过Bioanalyzer得到的各种RNA的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A(% )、超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B(% )时，以横轴为A、以纵轴为B/A对各种RNA的数值作图而得的图。图2显示对于各种RNA的RIN和扩增量进行作图而得的图。图3将利用小鼠小脑、肝脏的FFPE组织的微阵列的表达分析进行2次，对于第I次、第2次各自的分析所得的各基因的信号强度，将两者的小脑/肝脏之比进行作图而得的散点图。
具体实施例方式以下，更具体地说明本发明。本发明的“被固定液固定了的组织或细胞”，是指通过在称为固定液的溶液中浸溃组织、或者细胞，从而进行用于将生物试样维持在尽可能自然的状态下的处理、即固定处理。这里使用的固定液，优选使用甲醛溶液、低聚甲醛溶液、包含乙醇、甲醇等醇类、丙酮、氯仿等的溶液、包含苦味酸、重铬酸钾等酸的固定液(例如，鲍音固定液、Zamboni固定液、奥尔特氏固定液)、包含乙酸锌、氯化锌、硫酸锌等金属的溶液等。另外，还优选包含乙醇、氯仿、乙酸的卡诺伊固定液、包含甲醇、氯仿、乙酸的Methacarn固定液等、将上述溶液二种以上混合使用。在本发明中，作为上述固定液，更优选使用包含甲醛或低聚甲醛的溶液。甲醛溶液可以使用将市售的福尔马林(甲醛浓度37% )用水稀释而得的溶液，还优选使用将水稀释后的溶液的PH值用碳酸钙、碳酸镁等调节成中性而得的溶液，和/或用磷酸缓冲液稀释而将PH值调节成中性而得的溶液。另外，还可以使用除去了恶臭、刺激性气味、调节了浓度的福尔马林溶液(商品名'U O卜此外，甲醛溶液中的甲醛含量优选为I 30%，更优选为2 20%。低聚甲醛溶液可以使用将聚甲醛的粉末用水或磷酸缓冲液等溶解而得的溶液，和/或用水和少量的氢氧化钠溶解后、用磷酸缓冲液等将pH值调节至中性而得的溶液，也可以使用市售的低聚甲醛溶液。其浓度优选为I 10%，更优选为2 8%。另外，上述被固定了的组织或者细胞可以被石蜡包埋。在将被固定了的组织或者细胞进行石蜡包理时，通过本领域技术人员公知的一般方法来操作即可。即，将固定组织或细胞用醇置换而脱水，接着用二甲苯、苯等置换，然后在注入了加热而液化的石蜡的铸模中加入组织、细胞而包埋，制成石蜡块。此外，在从石蜡包埋后的组织、细胞中提取RNA时，使用利用旋转式切片机、滑行式切片机等切片机切成薄片的样品。此时，对薄切片的厚度不特别限定，优选为I 100 μ m，更优选为2 50 μ m。此外，可以使用主要用于制作冻结组织切片的OCT (Optical CuttingTemperature,最佳切削温度)复合物代替石腊。另外,还优选使用以下方法将石蜡块切成薄片而得的样品贴合在载玻片等上，使用激光捕获显微切割(LCM)和/或手术刀等从采取成为分析对象的组织的巨型拼合模块等将一部分取出而得的组织中提取RNA。在进行LCM时，为了提高视认性、确实地取出作为分析对象的组织、细胞，还可以将组织、细胞染色。此时，作为色素可利用例如甲酚紫、苏木精-伊红(HE)、核固红(NFR)等。 本发明的“从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA”，是从使用上述固定液固定了的组织或者细胞，通过酶消化组织、细胞的蛋白质而提取的RNA，作为该RNA，可列举mRNA、rRNA、tRNA、miRNA,优选为mRNA或miRNA，更优选为miRNA。提取液中有时混入了 DNA、蛋白质等杂质，优选提取后进行纯化操作。作为这里使用的纯化方法不特别限定，可列举例如，使用硅胶膜、担载有阴离子交换树脂等的柱的方法，使用逆相色谱法等液体色谱法的方法，使用有机溶剂使RNA沉淀的方法，将浓度高的乙酸铵溶液添加到含RNA的溶液中使RNA选择性沉淀的方法，使用磁珠的方法等。在上述提取、纯化中，适合使用例如，aRecoverAll (卜 > 一 K ^ 一 ” ) Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE”(Ambion公司)、“RNeasy FFPE Kit”(Qiagen 公司)、“ ISOGEN PB Kit，，( 二 ” *。> 夕一 >株式会社)、“FFPE RNA Purification Kit”(Norgen 公司)、“PureLink(商标)FFPE RNA IsolationKit”(Invitrogen 公司)、“High Pure FFPE RNA Micro”(Roche Applied Science 社)、“Agencourt FormaPure (商标)Kit，，(Beckman Coulter 公司)、“QuickExtract (商标)FFPEExtraction Kit”(Epicentre社)等福尔马林固定石腊包埋组织用RNA提取试剂盒。从上述被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA由于被固定液成分分解、和/或交联、修饰，因而难以将该RNA供给利用该RNA与能直接或间接地选择性结合的物质(以下也称为选择结合性物质)的分子间相互作用的分析的样品较多，事先判定是否适于分析成为了技术课题，但本发明者发现，如后述的实施例等所示，在从固定组织或细胞中提取出的RNA中，通过确认对该RNA的总重量的电泳中的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率、和对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率的工序，预先排除成为RNA的分解和/或片段化的指标的分子量小的RNA、和成为交联和/或添加/修饰等的指标的分子量大的RNA的比率多的RNA样品，从而可以判断该RNA是否适于上述微阵列分析。这里所说的“适于分析”，是指在进行利用了 RNA与选择结合性物质的分子间相互作用的RNA的分析的情况下，能够正确地测定该样品所保有的信息的状态。如上所述，在将RNA供给分析的情况下，如果分解、片段化的程度大、和/或存在大量交联或者添加/修饰物，则有时与选择结合性物质的分子间相互作用被抑制，而且扩增时得不到充分的扩增量，产生偏倚，作为结果极有可能不能正确地分析。作为在从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA中，确认对该RNA总重量的电泳中的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率、和对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率的方法，可列举将该RNA以分子量大小来区分并定量各分子量范围中的RNA的存在比例的方法。作为将从被固定了的组织、细胞等中提取出的RNA样品以分子量大小区分并确认分子量分布的方法的电泳的具体例，可列举琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、芯片电泳，但作为定量特定的核苷酸范围中的RNA的存在比例的方法，例如在凝胶电泳的情况下，可列举使用本领域技术人员公知的各种光密度计和/或“Typh00n”(GE 7社)等的测量将谱带强度数值化的方法，另外在芯片电泳的情况下，在使用“Agilent2100Bioanalyzer” (Agilent Technologies公司)等电泳系统进行时，通过进行专用软件所具有的Smear分析，从而可以适当地求出特定分子量范围中的RNA的存在比例。此外，在将未发生分解的RNA (完整RNA)用电泳进行分析的情况下，据说为约4700核苷酸的核糖体RNA的28S有时显示以比4000核苷酸略小的分子量为峰的谱带。认为这是由于28S的分子中含有较多的双链区，结构变得紧凑，因而在电泳中比实际的分子量泳动速度快。关于该现象，在Agilent Technologies公司主页的FAQ中也可看到同样的记载。因此，在本发明中核糖体RNA的28S实质上包含在电泳中的1000 4000核苷酸的范围内。另外，18S的分子量为1874核苷酸，在电泳中也能在1000 4000核苷酸的范围观察到谱带，因而也包含在该范围中。在本发明中，判断从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA是否适于分析的具体方法是，通过确认相对于对该RNA的总重量的电泳中的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率A(% )，对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的RNA的重量的比率B(%)较小或相同、即B/AS 1，从而判定是否适于分析的方法。认为包含超过4000核苷酸的RNA的级分中含有产生交联的RNA，它们有时不能与探针杂交，因此在分析比率B大于比率A的RNA样品的情况下,有定量值小于实际存在的mRNA量或者miRNA量的倾向，而且还有时会发现本来表达但不能检测的mRNA或者miRNA。因此，在进行从固定组织或细胞中提取出的RNA的分析之前，通过确认该RNA的B/A是否为I以下，可以迅速判定该RNA是否适于分析。在对应于B/A彡I的RNA的情况下，与从相同组织或细胞提取出的无分解(完整)的RNA的微阵列分析结果相比，可得到较高的相关关系。这里，相关系数是定量地表示2个数据的相互关系的强度的指标，取-I至I之间，如果为正的值则表示正相关，如果使负的值则表示负相关，如果是零则表示无相关。一般地，如果绝对值为O. 5以上则可判断为有相关，如果绝对值小于O. 5则可判断为无相关，2个数据的相关程度越强，则其绝对值越接近
I。此外,在通过“Microsoft Office Excel "(Microsoft公司)求相关系数的情况下,使用称为“correl”的函数即可。在本发明中，在对于确认了在两者中共同表达的基因求信号强度的相关系数的情况下，优选为0.7以上，更优选为0.8以上，进一步优选为0.9以上。进而，相对于从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA的总重量的电泳中的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率A(% )越大，显示该RNA越接近未分解的完整状态，这时，获得接近完整RNA的基因或者miRNA的表达行为的倾向高。具体地，如果A的比例优选为15%以上，更优选为20%以上，进一步优选为25%以上，则可以更迅速地判、断是否是接近完整状态的RNA。进而，相对于从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA的总重量的电泳中的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率A(% )、与对该RNA的总重量的电泳中的超过4000核苷酸的RNA的重量的比率B (% )的和(A + B)的值(O彡(A + B)彡100)越小,显示小于1000核苷酸的RNA的重量的比率越大，即分解的RNA越多，但如果分解的RNA多，则特别是在进行短链的miRNA的微阵列分析的情况下，有时发生除本来应杂交的RNA以外的RNA与探针结合的、被称为所谓交叉杂交的现象的可能性变高。这种情况下，有时得到RNA似乎比实际存在量更强烈地表达这样的结果，和/或表达的RNA的数比实际多的结果。在本发明中，A + B的值优选为(A + B)彡15，更优选为(A + B)彡20，进一步优选为(A +B)彡 25。此外，还优选通过检测从被固定了的组织或者细胞中提取出的RNA所含的特定基因的存在有无，来详细判定该RNA能否分析。通过进行该操作，可能能够以更高比率判定可否分析。这种情况下，通过RNA的逆转录酶反应合成cDNA，以该cDNA为模板通过PCR扩增 特定基因，当通过电泳评价该扩增产物时认定了其存在的情况下，判定为可以分析。此外，作为这里所说的特定基因，优选选择被称为持家基因或者内参基因的、理论上在样品间基本没有表达变动的基因，可列举例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶、β-肌动蛋白、β2-微球蛋白、次黄嘌呤核糖基转移酶、胆色素原脱氨酶、磷酸甘油酸激酶、亲环素Α、β -葡糖醛酸糖昔酶等。本发明中只要是利用RNA与选择结合性物质的分子间相互作用的分析即可，不特别限定，作为优选的分析工具，可列举微阵列。微阵列是在包含玻璃、陶瓷、硅等无机材料、不锈钢、金(镀)等金属类、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、乙酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷、硅胶等高分子材料的基板上固定化多种选择结合性物质而成的，作为一次检测被固定化的多种选择结合性物质与被验物质的结合的有无和/或被验物质的结合量的分析工具是有用的。作为固定化于微阵列的选择结合性物质，可列举核酸或其他抗原性化合物。核酸包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、互补DNA(cDNA)、互补RNA(cRNA)等。作为其他抗原性化合物，包含低分子化合物。特别优选的选择结合性物质是核酸。这样的选择结合性物质可以是市售的，或者是合成的，也可以是从活体组织或细胞等天然来源调制的。对微阵列不特别限制，作为优选的例子，可以在基板表面具有凹凸部，还可以进一步在凸部的上面设有盖子。此时，盖子优选具备与空隙连通的I个以上贯通孔。该孔用于注入核酸溶液、结合用缓冲液等液体，另外同时也用于将基板内部的压力保持在大气压。贯通孔优选对一个空隙有多个，其中通过为3 6个而使样本溶液的填充容易，因此是特别优选的。此外，对如上所述的盖子的制造方法不特别限定，例如，在树脂的情况下优选使用注射成型法、热压印法、切削的方法等，在玻璃和/或陶瓷的情况下优选使用喷砂法，在硅的情况下优选使用公知的在半导体工艺中使用的方法等。进而，通过在微阵列与盖子之间的空隙中封入微粒，从而在空隙中加入样本溶液并向样本溶液传播振动时，封入的微粒在液体中剧烈地来回运动。其结果是搅拌效率显著提高，带来了杂交的反应促进效果，因此是优选的。这里，对微粒的材质不特别限定，优选使用例如玻璃、陶瓷(例如氧化钇稳定化氧化锆)、金属类(例如不锈钢)、聚合物(例如尼龙、聚苯乙烯)、磁性体等。其中，由于物理、化学上稳定、且比重大，因而优选使用陶瓷的微粒。进而，通过合并使用使基板旋转而使微粒沿重力方向落下的方法、和/或振荡基板的方法、使用磁性微粒通过磁力而使微粒移动的方法等，进一步提高搅拌效率。在本发明中，上述从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA(以下也称为被验物质)可以不扩增(非扩增产物)供给分析，也可以将扩增产物供给分析，可根据被验物质的种类适宜选择。例如在分析miRNA的情况下优选非扩增的分析。另外，在mRNA的分析的情况下，被验物质可以是非扩增产物也可以是扩增产物，但在分析需要防止扩增偏倚的被验物质的情况下，优选非扩增产物或如后述的以扩增倍率2 20倍扩增而得的扩增产物的分析。 在分析扩增产物的情况下，作为扩增RNA的方法不特别限制，可以使用由各公司上市的与FFPE对应的扩增用试剂盒。在使用市售的试剂盒的情况下，优选利用例如^ExpressArt FFPE RNA Amplification Kit”(AmpTec 公司)、“WT-Ovation FFPE SystemV2”(NuGen 公司)、“Arcturus Paradise Plus Reagent System”(MDS AnalyticalTechnologies 公司)等。另夕卜,还优选使用 “SenseAMP Plus，，、“RumpUp，，、“RumpUpPlus” (Genisphere公司)合成正义链RNA，由该正义链RNA通过本领域技术人员公知的方法合成反义链RNA。另外，如上所述优选分析以扩增倍率2 20倍扩增而得的扩增产物。认为仅得到扩增倍率不到2倍的扩增产物的RNA，是由于RNA的分解、片段化剧烈、RNA链长非常短，或者由于RNA分子间或者RNA与蛋白质间产生的交联、和/或固定时甲醛等来源于固定液的物质与RNA结合而产生的添加/修饰物的影响，扩增反应被抑制，因此不扩增，或者扩增反应不充分，作为其结果有时不能正确地分析。另外，在扩增产物为超过20倍的扩增倍率的情况下，有时出现分解等的影响较少的RNA容易扩增、另一方面分解相当进行的RNA基本不扩增这样的所谓扩增偏倚显著出现的可能性高。作为扩增产物，可以是通过RT-PCR等获得的DNA，也可以是通过RNA聚合酶等合成的RNA，但在本发明中优选为RNA。另外，在扩增产物为RNA的情况下，可以是正义链RNA也可以是反义链RNA，不特别限定，但现有的微阵列中大部分所担载的探针对应于反义链RNA,因此在使用现有的微阵列的情况下，优选作为反义链RNA扩增。作为使扩增倍率为2 20倍的方法,可列举通过增减用于RNA扩增的酶和/或引物、底物等的浓度来使试剂的组成最适化的方法。另外，还有通过调整反应时间而使扩增倍率为2 20倍的方法。例如，在使用扩增倍率比较大的试剂来扩增从固定组织或细胞中提取出的RNA样品的情况下，比规定反应时间的时间缩短即可。另外，扩增次数优选为I次。如果将扩增反应重复2次以上，则有时即使在通过第I次扩增而扩增产物中产生了少许偏倚的情况下，第2次以后该偏倚也变得明显。这里，为了求溶液中的RNA重量，例如，可以由将RNA溶液使用光路长IOmm的比色池用分光光度计测定时的260nm的值和溶液量通过下式A计算。式A (260nm 的值)X 40 (ng/ μ L) X 溶液量(μ L)。此外，为了确认扩增RNA的结果、扩增倍率是否为2 20倍，由使用光路长IOmm的比色池通过分光光度计测定时的260nm的值和溶液量通过上式A求出扩增后的溶液的RNA重量，通过下式B计算出扩增倍率即可。式B :(扩增后的RNA重量)/ (扩增前的RNA重量)。被验物质优选被本领域技术人员公知的核酸的标记物质进行标记，更优选被荧光标记。在将被验物质进行荧光标记的情况下，荧光标记可以在被验物质与选择结合性物质结合之前进行，也可以在结合之后进行。在被验物质是非扩增产物的情况下，优选为直接标记，作为这里使用的直接标记试剂，可列举例如，iiPlatinumBright Nucleic AcidLabeling Kit”(Kreatech 公司；突光色素为 Dyomics 系列(Dyomics 公司))、“ULS(商标)microRNA Labeling Kit”(Kreatech 公司；突光色素为 Cy3、Cy5)、“miRCURY LNA(商标)miRNA Power Labeling Kit”(Exiqon 公司；突光色素为 Hy3、Hy5)、“FlashTag RNALabeling Kit”(Genesphere 公司；突光色素为 0yster-550、0yster_650)等。另一方面，在分析扩增产物的情况下，通过使用在扩增反应时所用的核苷酸-3-磷酸(NTP)(腺苷-3-磷酸(ATP)、鸟苷-3-磷酸(GTP)、胞苷-3-磷酸(CTP)、尿苷-3-磷酸(UTP))的一部分、例如 UTP的一部分上添加氨基烯丙基和/或生物素而得的化合物，在扩增产物中导入氨基烯丙基和/或生物素等反应基，从而可以将扩增产物容易地进行荧光标记，因此是优选的。在导入了氨基烯丙基的情况下，容易地与末端具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基的荧光色素进行偶联反应。作为这里所使用的荧光色素，可列举Cy3、Cy5、Hyper5 (GE ^ > 7社)、“AlexaFluor”(注册商标)系列(Molecular Probes社)等。另外，也可以不导入氨基烯丙基等反应基，与非扩增产物同样地，使用将所扩增的RNA进行直接荧光标记的试剂，这时可以优选使用上述的直接标记试剂。被荧光标记后的被验物质被供给至与固定化于微阵列等载体的选择结合性物质的结合反应。作为使被验物质与被固定化于载体的选择结合性物质结合的方法，可采用本领域技术人员公知的方法，特别是在选择结合性物质是核酸的情况下，可以通过本领域技术人员公知的杂交方法使其结合。另外，对于使核酸与选择结合性物质结合时的反应液，采用本领域技术人员公知的组成，特别是在选择结合性物质是核酸的情况下，可以使用本领域技术人员公知的杂交缓冲液。另外，作为检测与固定化于载体的选择结合性物质结合的被验物质的结合的有无、和/或所结合的被验物质的量的方法，可以通过本领域技术人员公知的荧光扫描装置读取标记于核酸的荧光的强度，从而检测、测定。实施例通过以下的参考例、实施例更详细地说明本发明。当然，本发明不限于下述实施例。参考例I(RNA的荧光标记操作中的收量确认)在使用“3D_Gene (注册商标)Human 25k chip” (東 > 株式会社)进行微阵列分析的情况下，优选可以准备被荧光标记后的反义链RNA(aRNA) I μ g。于是，研究了用于获得I μ g以上的荧光标记aRNA的条件。将从人胃冻结组织中提取出的RNA使用逆转录酶(“SuperScript (注册商标)III”(Invitrogen公司))合成第一链cDNA,接着添加DNA合成酶合成与第一链DNA互补的第二链cDNA。使用二氧化硅基的柱来纯化合成的cDNA，然后使用T7RNA聚合酶在42°C进行体外转录(IVT) 8小时，从而进行aRNA的扩增反应。将该反应进行5次，合成aRNA共计50 μ g。此外，通过在IVT反应时所用的NTP混合物(ATP、GTP、CTP、UTP)中添加附带了氨基烯丙基(AA)基的UTP (AA-UTP)，从而在合成aRNA中导入AA基。将对合成的AA-aRNA I μ g、2 μ g、3 μ g、4 μ g标记Cy5 (GE、> >夕7社)的操作进行各3次。将各样品中的标记后的回收量示于表I。显示在通过微阵列进行全面基因分析时为了获得I U g的突光标记aRNA,未标记的扩增aRNA为2yg以上即可。表I
权利要求
1.从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法，该RNA的分析方法具有以下步骤当设对该RNA总重量的电泳中的1000 4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A(% )、对该RNA总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B(% )时，判定该RNA满足下式， 式B/A ( I。
2.根据权利要求I所述的RNA的分析方法，进一步具有以下步骤判定上述比率A(%)为25%以上。
3.根据权利要求I或2所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA分析以扩增倍率2 20倍扩增所得的扩增产物。
4.根据权利要求I或2所述的RNA的分析方法，对上述判定的RNA通过非扩增来进行分析。
5.根据权利要求4所述的RNA的分析方法，上述RNA是miRNA。
6.根据权利要求I 5的任一项所述的RNA的分析方法，上述固定液包含甲醛或低聚甲醛。
7.根据权利要求I 6的任一项所述的RNA的分析方法，对上述被固定液固定了的组织或细胞进行了石蜡包埋或OCT复合物包埋。
全文摘要
本发明涉及从被固定液固定了的组织或细胞中提取出的RNA的分析方法，其中，通过下述RNA的分析方法来分析被固定液固定了的组织或细胞的基因的表达信息和/或表达有无，所述RNA的分析方法具有以下步骤当设对该RNA总重量的电泳中的1000～4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为A(％)、对该RNA总重量的电泳中的超过4000核苷酸的范围的RNA的重量的比率为B(％)时，判定该RNA满足下式，式B/A≤1。
文档编号G06F17/30GK102656280SQ20108005669
公开日2012年9月5日 申请日期2010年12月15日 优先权日2009年12月16日
发明者信正 均, 野村 修, 俊彦 黑田 申请人:东丽株式会社